淡水螯蝦類胚胎離體孵化技術(shù)研究進展

程 順，韋永春，蔣文枰，遲美麗，劉士力，鄭建波，杭小英，彭 苗，李 飛

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001）

目前具有市場前景的淡水經(jīng)濟螯蝦類主要有克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、紅螯螯蝦（Cherax quadricariratus）、亞比螯蝦（Cherax destructor）、通訊螯蝦（Pacifastacus leniusculus）、奧斯塔歐洲螯蝦（Astacus astacus）、格魯西東歐螯蝦（Astacus leptodactylus）、麥龍螯蝦（Cherax tenuimanus）等，其中克氏原螯蝦與紅螯螯蝦在我國產(chǎn)業(yè)化發(fā)展呈急速上升趨勢[1-2]。但它們特有的生物學(xué)特性，即胚胎發(fā)育時間過長、個體抱卵量偏低導(dǎo)致在大規(guī)模生產(chǎn)育苗中出現(xiàn)出苗同步性差，導(dǎo)致出苗量偏低，這極大阻礙了這些淡水螯蝦類產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。其中克氏原螯蝦、紅螯螯蝦等淡水螯蝦類的繁育方式主要有室內(nèi)工廠化水泥池繁育、室外土塘繁育等[3-6]。而國內(nèi)目前更趨向于室內(nèi)工廠化水泥池育苗，因為該繁育方式孵化率與出苗率更高，有利于規(guī)?；┟纾噎h(huán)境可控，集約化程度相對高，特別是對于紅螯螯蝦等熱帶性品種更宜采用該方式[7]。但室內(nèi)工廠化水泥池繁育也存在一些問題，該方式需要占用大量水泥池用于抱卵蝦及幼蝦的培育，且繁育期間需消耗大量人力、物力、用水及能源，不利于實現(xiàn)數(shù)字漁業(yè)與智慧漁業(yè)的要求。因此，亟需有針對性開發(fā)新的技術(shù)，解決淡水螯蝦類的繁育中的瓶頸。胚胎離體孵化技術(shù)目前已被應(yīng)用于淡水螯蝦類繁育中，該技術(shù)不僅環(huán)境易控，節(jié)省人力、物力、占地與用水，還可有效提高孵化效率，減少飼養(yǎng)管理成本，并可發(fā)展“訂單育苗”“反季育苗”等，有利于實現(xiàn)繁育智能化與自動化，批量化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苗種[8-10]。與淡水魚類相比，淡水螯蝦類胚胎離體孵化困難更大，因為自身的生物學(xué)特性及孵化時間更長，期間需要更為適宜的環(huán)境控制、人工管理及消毒處理等[11]。因此，有必要對淡水螯蝦類的相關(guān)生物學(xué)特性、離體孵化期間環(huán)境的控制、消毒等人為調(diào)控、孵化裝置的設(shè)計等環(huán)節(jié)進行更加深入系統(tǒng)研究。淡水螯蝦類的首次胚胎離體孵化于19 世紀(jì)發(fā)生在奧斯塔歐洲螯蝦（Astacus astacus）中[12]，隨后Paris 于20 世紀(jì)初用魚卵孵化器孵化了白爪螯蝦（Austropotamobius pallipes）離體胚胎，但均未獲得實質(zhì)性突破[13]。在國內(nèi)，朱玉芳等[14]于2002 年嘗試克氏原螯蝦胚胎的離體孵化，也未獲得成功，抱卵孵化的孵化率遠高于離體胚胎的孵化率。王慶[15]的研究進一步驗證克氏原螯蝦胚胎可在離開母體后孵化，但總體上孵化率較低，仍不能應(yīng)用于規(guī)?；?。首次取得成功的是Brian等[16]對亞比螯蝦的研究，離體胚胎的孵化率達87%，與親蝦抱卵的孵化率接近。紅螯螯蝦胚胎離體孵化的研究起步則相對較晚，King 等[17]使用靜態(tài)的充氣懸浮上升系統(tǒng)首次進行該蝦的胚胎離體孵化嘗試，但未獲得成功。直到21 世紀(jì)之后，在Rudge、Joly與Clive等[9,18-19]共同努力下，紅螯螯蝦胚胎離體孵化技術(shù)才取得了突破。

1 胚胎與初孵幼蝦生物學(xué)的研究

胚胎與初孵幼蝦生物學(xué)上的成功探索是取得離體孵化突破的關(guān)鍵。Winnicki 等[20]研究認(rèn)為，自然母體抱卵孵化和離體孵化的效果差異是因為前者是在理想的母體中自然孵化的，孵化區(qū)域由母體通過卷曲腹部構(gòu)成，在整個孵化期內(nèi)，胚胎與初孵幼蝦始終附著在該區(qū)域；而離體孵化的胚胎若因為人為剝離或其他外力原因造成外膜結(jié)構(gòu)的機械性地破壞，將影響胚胎與水的交換，且易被細菌、真菌等感染。王吉橋等[21]發(fā)現(xiàn)母體和胚胎之間有四點聯(lián)系，一是腹肢上的剛毛細長，附著面積大，可有效保護胚胎；二是剛毛可使胚胎成排排列，互不黏連，利于胚胎與外環(huán)境間的交流；三是剛毛可感知水流、水壓和水質(zhì)變化，通過腹部與附肢的擺動使胚胎免受機械等損傷；四是腹肢節(jié)律性扇動，保持水體局部流動，可降低胚胎因局部缺氧死亡的幾率。Shui等[22]研究表明淡水螯蝦類母體在產(chǎn)卵的同時會分泌大量黏液，這些黏液對卵附著于步足起重要作用；同時他們的研究還表明母體孵化的胚胎抗感染能力強于離體孵化。其他研究也表明，在母體孵化期間，淡水螯蝦類的母體會通過如隱藏、清潔、轉(zhuǎn)移和扇動腹部等行為護卵[23]。這些發(fā)現(xiàn)為此后離體孵化的研究提供3 點重要參考：1）胚胎在孵化階段不能大面積黏連或沉底，需要與水進行充分的交流以保證溶氧；2）胚胎在孵化階段需要通過保護措施使其免受機械等損傷；3）輕柔的滾動或擺動更有利于孵化效果的提高。

Clive 等[19]對孵出后幼蝦的發(fā)育時期進行規(guī)定，第一期幼蝦指剛破膜孵出的幼蝦，蛻殼后成為第二期幼蝦，再次蛻殼后成為第三期幼蝦，第三期幼蝦已能自由游動，標(biāo)志著離體孵化的結(jié)束。還有研究表明不同發(fā)育時期的幼蝦運動特征不同，第一期幼蝦通常鉤在合適的基質(zhì)上，并在蛻殼進入第二期之前幾乎靜止不動，在這一階段，所有定位和感知環(huán)境信號所必需的器官，即眼睛[24]、平衡囊[25]、嗅覺感受器官[26]、第一、二觸角上的觸覺以及水動力感受器剛毛[27-28]和正在形成中的游泳器官[29]等只有部分或根本沒有發(fā)育，使其不能在自然界中獨立生活；但第一期幼蝦擁有足夠的卵黃儲備，可以在無捕食者的體外系統(tǒng)中生存，通過避免運動將能耗降至最低[23]。第二期幼蝦運動能力增強，特別在離體孵化期間可頻繁移動改變位置，但由于尾節(jié)和平衡囊發(fā)育不完全，步行和游泳協(xié)調(diào)性較差。第三期幼蝦相對于前兩期的幼蝦具有更強的運動能力[23]。Ⅴogt[23]發(fā)現(xiàn)淡水螯蝦類在初孵幼體階段有一條尾節(jié)線，它將幼體固著在母體上，防止其被水流沖走，第一期幼蝦被尾節(jié)線固定，基本不運動；第二期幼蝦控制平衡的平衡囊發(fā)育不完全，運動能力較差；第三期幼蝦口器和胃磨已發(fā)育完全，可攝食，并自由運動。上述研究提示：1）第三期幼蝦可自由運動及攝食，需及時取出進行中間培育或暫養(yǎng)標(biāo)粗，避免自殘與饑餓；2）盡量使同一個孵化區(qū)域同步性保持一致；3）實際離體孵化期間可添加網(wǎng)片、海綿等附著基質(zhì)代替尾節(jié)線與附肢剛毛；4）離體孵化期間應(yīng)降低水環(huán)境的沖擊，避免使第一期與第二期幼蝦脫離附著基質(zhì)。

2 影響離體孵化的環(huán)境因素研究

2.1 水溫

王吉橋等[21]研究表明，溫度是制約離體胚胎孵化的重要因素，水溫低則胚胎孵化所需時間延長，但水溫過高易引起水質(zhì)惡化而導(dǎo)致離體胚胎死亡。李水根[30]研究發(fā)現(xiàn)紅螯螯蝦胚胎在水溫20～32 ℃條件下，孵化時間為4～13 周，并認(rèn)為在22～30 ℃范圍內(nèi)，提高水溫有利于其孵化。李進等[31]研究結(jié)果顯示，在水溫18 ℃時，紅螯螯蝦胚胎可以發(fā)育，但孵化期較長，當(dāng)超過30 ℃以后，胚胎發(fā)育畸形率增加，孵化率呈下降趨勢，且溫度對胚胎孵化時長影響較大，這與梁俊平等[32]及曹林泉等[33]對其他蝦類研究相一致，并認(rèn)為這可能是兩個原因所導(dǎo)致，一是水溫升高會導(dǎo)致胚胎代謝加速，但機體各組織器官發(fā)育又不完善，引發(fā)各器官衰竭；二是過高水溫可能會導(dǎo)致機體代謝相關(guān)酶及其他大分子物質(zhì)活性的降低。同時，在離體孵化期間，細菌、真菌等不利微生物生長會隨溫度升高而增加[34]。在胚胎孵出后，初孵幼蝦也會受到溫度影響，彭剛等[35]研究發(fā)現(xiàn)，紅螯螯蝦幼蝦隨水溫上升新陳代謝加快，需消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，若營養(yǎng)物質(zhì)積累不足，易導(dǎo)致其無法正常蛻殼，所以水溫超過30 ℃幼蝦死亡率會上升。因此，水溫對胚胎孵化、胚后發(fā)育均具有影響，而且水溫穩(wěn)定（溫差不大于3 ℃）也是孵化成功與否的重要因素[36]。

2.2 水質(zhì)

Antonín 等[37]在未進行甲醛浸泡消毒的情況下通過半循環(huán)系統(tǒng)離體孵化奧斯塔歐洲螯蝦胚胎，因水質(zhì)條件惡化，導(dǎo)致孵化效果較差，并出現(xiàn)幼體無法成功蛻殼、幼體腿部畸形和幼體培養(yǎng)死亡率升高等異?，F(xiàn)象，推測這是由于真菌感染可導(dǎo)致生物降解的有機物從胚胎釋放到水環(huán)境中引起了水質(zhì)惡化；同時他們認(rèn)為在半循環(huán)系統(tǒng)中，水質(zhì)是最大的挑戰(zhàn)，可以通過更大的水交換來解決，在NO2中毒的情況下，也可以通過添加氯離子或?qū)⑸镞^濾介質(zhì)上的硝化過程納入系統(tǒng)來解決。Antonín 等[38]與Policar等[39]也得到了類似結(jié)論。Rudge等[9]與Carral等[40]也認(rèn)為維持良好、清潔的水質(zhì)是進行胚胎離體孵化的前提條件。目前去除水質(zhì)不利因素的方法主要有這幾點：1）定期換水，排出部分孵化用水，加入經(jīng)過消毒的清潔水；2）加入過濾及凈化水的物質(zhì)，通過濾膜培養(yǎng)硝化細菌等有益菌，維持水生態(tài)穩(wěn)定；3）在不影響水生態(tài)平衡的前提下對孵化用水進行紫外或臭氧消毒；4）Antonín等[37]提出可通過添加氯離子以降低水中亞硝酸鹽等的毒性。

2.3 菌群環(huán)境

水生動物胚胎的表面是細菌定植的良好基質(zhì)[41]，其表面細菌的組成可以反映周圍水域的菌群環(huán)境，并且胚胎表面相關(guān)條件致病菌的存在會影響它們的生存能力和以后發(fā)育[42]，一些水生動物早期生命階段的密集培育所帶來的許多問題都是由細菌引起的，因此離體孵化階段菌群環(huán)境對孵化具有重要影響[41]。Micknien 等[43]介紹人工孵化的奧斯塔歐洲螯蝦胚胎表面異養(yǎng)細菌豐度的數(shù)據(jù)，在第一期幼蝦上觀察到異養(yǎng)細菌的豐度最高，而孵化器系統(tǒng)水中的細菌數(shù)量遠低于胚胎上，死胚的細菌數(shù)量比健康胚胎高100 倍；死胚上色素細菌的豐度也遠遠高于健康胚胎；氣單胞菌和假單胞菌在胚胎中占有優(yōu)勢，占鑒定的所有細菌的70%。還有研究觀察到胚胎剛產(chǎn)出時是無菌的，但釋放到環(huán)境中才被細菌定植，母體用它的步足擺動可能有助于限制細菌數(shù)量，因此了解螯蝦如何與周圍環(huán)境中的細菌相互作用具有重要意義[44-45]。Stevenson 等[46]離體孵化紅螯螯蝦時發(fā)現(xiàn)細菌性疾病導(dǎo)致的大量死亡是一個問題，他們在初孵幼蝦蛻殼期間的后腸內(nèi)觀察到細菌，這些細菌主要為一種強烈溶血性的嗜水氣單胞菌。Clive 等[19]利用循環(huán)水+機械拉動裝置（Clive 等將其命名為AquaⅤerde Incubator）離體孵化紅螯螯蝦胚胎，雖然一個批次可平均生產(chǎn)18 萬尾幼蝦，但同時也發(fā)現(xiàn)有時卵或幼蝦會出現(xiàn)大批量死亡現(xiàn)象。他們推測造成這一現(xiàn)象的原因是菌群環(huán)境的變化，即細菌（特別是嗜水氣單胞菌）的滋生，因此他們采取使用經(jīng)臭氧消毒的水、接種噬菌體及其他消毒措施，改善了孵化效果。Olafsen[42]指出，在離體孵化期間，經(jīng)過消毒的胚胎表明菌群多樣性會降低，使其易受到進一步潛在致病微生物的感染，因此有必要進行定期消毒并對淡水螯蝦類胚胎表面正常菌群區(qū)系的性質(zhì)進行深入研究。

2.4 溶氧

朱玉芳等[14]研究認(rèn)為克氏原螯蝦母體抱卵孵化的孵化率高于胚胎離體孵化的孵化率的原因之一，是抱卵時母蝦附肢的擺動為胚胎提供了更多的溶氧。閻斌倫等的研究表明，蝦蟹類的胚胎與母體以剛毛連接，通過腹肢擺動保證胚胎發(fā)育過程中氧氣的充足[47]。王吉橋等[21]也認(rèn)為在進行胚胎離體孵化時，盡量避免胚胎因局部缺氧死亡是最應(yīng)該考慮的問題。王慶[15]研究結(jié)果則顯示，充氣孵化方式的胚胎孵化率高于靜水孵化方式，這是因為前者水體中溶氧含量更高。因此，溶氧是影響離體胚胎孵化的重要因素之一，為避免在實際孵化過程中胚胎因缺氧死亡，可以嘗試循環(huán)水或充氣懸浮系統(tǒng)，以提供盡可能充足的溶氧。

通過上述研究，本研究認(rèn)為有必要做好這幾點：1）水溫控制在適宜水平；2）水質(zhì)良好、清潔，溶氧充足，亞硝酸鹽、氨氮、pH 等指標(biāo)穩(wěn)定在較低水平；3）離體孵化期間經(jīng)過消毒的胚胎表明菌群異質(zhì)性會降低，應(yīng)進行定期消毒防止致病微生物的傳染。

3 影響離體孵化的人為調(diào)控因素研究

3.1 消毒劑的篩選

紅螯螯蝦等淡水螯蝦類在抱卵過程中會經(jīng)常扇動尾部和附肢，除可增氧外，還能清除胚胎上的污垢及死胚，防止健康胚胎遭受真菌等微生物感染，但在進行離體孵化時缺少該過程。定期清除死胚是控制真菌等生長的有效方法，但這種做法需要大量人力，不當(dāng)處理可能會損害健康胚胎，特別在卵量大、密度高時，這些缺點更為明顯[48]。Royuela等[11]認(rèn)為與淡水魚類相比，人工孵化淡水螯蝦困難更大，因為其胚胎發(fā)育時間更長，使用與魚類消毒一樣的消毒劑濃度和消毒頻率處理可能會無效，特別在高密度下，適宜消毒處理方法是使離體孵化成功的關(guān)鍵因素。

目前取得較好效果的消毒劑包括甲醛、溴硝丙二醇、乙醇、氫氧化銅、金合歡精油等。甲醛是在胚胎離體孵化中使用最為廣泛的消毒劑，Antonín等[37-38]認(rèn)為甲醛是一種有效殺菌劑，可有效減少胚胎感染，可成功在半循環(huán)系統(tǒng)中孵化奧斯塔歐洲螯蝦胚胎。Rocío等[49]對通訊螯蝦的研究認(rèn)為，人工孵出的幼蝦生長速度明顯快于母體孵化出的幼蝦，表明甲醛的消毒處理對幼蝦無不良影響，且可使幼蝦獲得更好的生長潛能。Celada 等[48]使用甲醛、過氧化氫、氯化鈉等作為消毒劑，對通訊螯蝦胚胎進行離體孵化實驗，結(jié)果證明使用體積分?jǐn)?shù)4 500×10-6甲醛與質(zhì)量分?jǐn)?shù)15×10-6孔雀石綠可以達到最高出苗率，且二者都能有效抑制真菌生長；而使用體積分?jǐn)?shù)1 500×10-6甲醛、1 000×10-6過氧化氫、3 000×10-5氯化鈉，則不能控制真菌蔓延，出苗率質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。Melendre 等[34]研究甲醛、孔雀石綠、過氧化氫、異丙醇、硫酸銅、高錳酸鉀和聚維酮碘對通訊螯蝦胚胎離體孵化的消毒效果，結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)3 000×10-6的甲醛是最有效的殺菌劑，完全可以取代禁用的孔雀石綠，其他化學(xué)試劑如過氧化氫、高錳酸鉀、硫酸銅、聚維酮碘或異丙醇等則效果較差。但由于甲醛使用不當(dāng)有可能致癌或有潛在對水生環(huán)境的不利影響[34]，研究者也嘗試了其它消毒劑，González等[50]對通訊螯蝦的研究表明溴硝丙二醇是較好消毒劑，即使在高密度孵化過程中，每日使用體積分?jǐn)?shù)3 000×10-6的溴硝丙二醇消毒15 min 可以取得較好效果。Lio-Po 等[51]與Cheng 等[10]報道乙醇在很高濃度下是真菌抑制劑，后者研究也表明，使用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇對紅螯螯蝦胚胎消毒1 min 有助于提高孵化率及出苗率。Carral 等[40]對通訊螯蝦胚胎離體孵化的結(jié)果表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)200×10-6的氫氧化銅（孵化率達86.2%、出苗率達77.6%）與體積分?jǐn)?shù)3 000×10-6甲醛（孵化率為83.7%、出苗率為74.3%）效果無顯著差異（消毒劑隔天處理一次15 min），是甲醛的良好替代品。Seval 等[52]研究表明，體積分?jǐn)?shù)1 000×10-6的金合歡精油處理離體孵化的格魯西東歐螯蝦（Astacus leptodactylus）胚胎，其孵化率可以提高至86%。2023 年，Cheng 等[53]報道了以金合歡精油基礎(chǔ)液體積分?jǐn)?shù)1 000×10-6，SOD 超氧化物歧化酶10 000 U/mg，海藻糖30 mmol/L，牛血清蛋白200 mmol/L，蝦青素30 mmol/L作為消毒劑具有較高孵化率與出苗率，可以作為替代傳統(tǒng)甲醛的一種無公害、有效的紅螯螯蝦胚胎離體孵化消毒劑。

總之，消毒劑使用被認(rèn)為是淡水螯蝦類胚胎離體孵化成功與否的關(guān)鍵因素之一，其中體積分?jǐn)?shù)3 000×10-6甲醛浸泡消毒離體胚胎15 min 是大多數(shù)研究中選擇的消毒方法，但體積分?jǐn)?shù)75%乙醇、體積分?jǐn)?shù)3 000×10-6溴硝丙二醇等消毒劑也被部分研究認(rèn)為效果較佳，特別是近年來，研發(fā)替代甲醛的綠色無公害消毒劑可能是今后淡水螯蝦類胚胎離體孵化的重點領(lǐng)域。

3.2 水體消毒

對霉菌和病菌的有效防控以及對不良水質(zhì)因子的有效處理是離體孵化過程中關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。但由于水體消毒不宜將硝化細菌、光合細菌等有益菌殺滅，因此不建議加入過多化學(xué)消毒劑。目前常用水體消毒方式包括紫外照射消毒與臭氧消毒。

紫外照射消毒是目前最常使用的水體消毒方式，對水產(chǎn)養(yǎng)殖品種已證明能有效控制病原[54]，通常用于循環(huán)系統(tǒng)中鮭（Oncorhynchus keta）胚胎的人工孵化[55]。在淡水螯蝦類離體孵化的研究中，Antonín等[37]研究表明，真菌會導(dǎo)致胚胎死亡，解決這個問題的主要方法除使用化學(xué)抗真菌劑對胚胎進行浸泡消毒外，還可以通過紫外線照射孵化水體，達到對病原菌的抑制作用。同時，Antonín等[37]也認(rèn)為紫外照射會提高氨氮和亞硝酸鹽含量，因為水中的微生物經(jīng)過紫外處理被殺死后可以作為剩余微生物群落生長的合適基質(zhì)。

臭氧的強氧化性可破壞病毒的RNA 或DNA，從而達到滅活病毒的作用；臭氧也可作用于細胞膜，使細胞膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞溶解、死亡，從而殺滅細菌、霉菌等病原生物。特別是臭氧使用后最終會分解為氧氣，不會造成二次污染，具有無公害特點，在歐盟、美國、日本等地臭氧已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖循環(huán)水處理系統(tǒng)中[56]。但其具有強烈氧化作用，臭氧在氧化細菌細胞膜及體內(nèi)活性基團發(fā)揮殺菌作用的同時也會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生一定毒性作用，導(dǎo)致胚胎發(fā)育滯后、畸形或死亡[56]。劉淇等[57]研究發(fā)現(xiàn)卵膜有一定保護作用，胚胎發(fā)育階段對臭氧耐受能力強于幼體階段。鄭錦濱等[56]研究認(rèn)為臭氧的水處理效果良好，0.30 mg/L 的臭氧在3 h 內(nèi)對水中亞硝酸鹽的去除率可達72.29%，0.05 mg/L 的臭氧處理20 min 后也能完全殺滅弧菌，但高質(zhì)量濃度臭氧（0.30 mg/L）對胚胎發(fā)育具有一定毒性。目前，將臭氧應(yīng)用于淡水螯蝦類胚胎離體孵化的水體消毒報道僅見于Cheng等[10]對紅螯螯蝦的研究中，該研究結(jié)果表明，臭氧消毒是一種有效水體消毒方式，它不僅能像紫外照射消毒一樣殺死水體中有害病菌，還能殺滅附著于裝置四周內(nèi)壁的病菌，在合適的濃度范圍內(nèi)效果更佳。

3.3 胚胎發(fā)育階段的選擇

淡水螯蝦類胚胎的發(fā)育階段大致可通過顏色區(qū)分，以紅螯螯蝦為例，孟凡麗等[58]研究表明，剛產(chǎn)出的卵呈乳白色或淡黃色（Ⅰ期），隨后顏色加深，至囊胚期呈橄欖綠色（Ⅱ期），從原腸期到孵出前，胚胎體表顏色依次為黃綠色或黃褐色（Ⅲ期）、土黃色或中褐色（Ⅳ期）、桔黃色或深褐色（Ⅴ期）、桔紅色（Ⅵ）、紅色或紅褐色（Ⅶ），之后可以觀察到眼點，到達眼點期（Ⅷ期），此時即將孵出。不同發(fā)育階段的胚胎進行離體孵化效果也有差異，王吉橋等[21]認(rèn)為當(dāng)胚胎死亡時，真菌迅速繁殖，同時菌絲長出，附近正常的胚胎也因菌絲覆蓋而窒息死亡，且離體胚胎易受真菌感染而死亡，造成離體培養(yǎng)的早期胚胎孵化率較低。王慶[15]比較了不同時期的克氏原螯蝦胚胎離體孵化的效果，結(jié)果表明早期胚胎孵化率低，至胚胎呈桔紅色后孵化率較高，說明后期胚胎的孵化效果較好。但Perez 等[59]對白爪螯蝦（Austropotamobius pallipes）胚胎離體孵化的研究則認(rèn)為早期胚胎進行離體孵化也可獲得較高孵化率（67.7%）及出苗率（51%）。在最新研究中，Cheng 等[10]認(rèn)為發(fā)育后期的胚胎孵化效果明顯優(yōu)于早期胚胎，該研究推測可能是因為早期胚胎在剝離時較易受損，且孵化期間卵膜的堅固性不如后期胚胎，從而造成部分胚胎膜受損而死亡或被感染。Shui等[22]研究表明克氏原螯蝦不同的胚胎剝離階段會對離體孵化結(jié)果產(chǎn)生影響，其中有一個關(guān)鍵時期，即原腸胚期，孵化率從原腸胚期之前的24%增加到45%，因此在原腸期之前進行離體孵化效果較差?？傊?，本研究認(rèn)為選取后期的桔黃色或桔紅色胚胎進行剝離有助于離體孵化效果的提高。

3.4 密度

淡水螯蝦類死亡的胚胎是霉菌的良好基質(zhì)，霉菌能夠從受感染的胚胎傳播至周圍的健康胚胎，從而影響離體孵化的效果，當(dāng)胚胎密度較大時，該現(xiàn)象則更為明顯[11,50]。Cheng 等[10]在進行紅螯螯蝦胚胎離體孵化的研究中發(fā)現(xiàn)，密度是離體孵化的影響因子之一，低密度組（300 粒胚胎/孵化器）與中密度組（600粒胚胎/孵化器）的孵化率及出苗率均高于高密度組（900 粒胚胎/孵化器）。Celada 等[48]也報道了胚胎密度對離體孵化具有較大影響，并推測密度的降低有助于胚胎間隔的擴大，進而避免真菌生長到達周圍健康胚胎，從而提高離體孵化效果。因此，在離體孵化前需要探索適宜的密度，以提高孵化率與出苗率。

3.5 其他人工管理措施

主要包括定期清潔、換水、挑死胚、挑第三期幼蝦、添加附著物等，這些措施也是決定孵化成功與否的關(guān)鍵。

由于死胚或者受傷的胚胎可能會被細菌、真菌感染[34,40]，而人工剝離難免會造成少量胚胎受損，因此前期管理非常重要。Rudge 等[9]每5 周清洗將會對孵化裝置進行一次清潔，該措施有效解決了長期孵化造成的病菌滋生問題。有研究表明定期清除死胚、死蝦是控制病菌滋生的有效方法，因為在孵化過程中，病菌會從死胚擴散到健康的胚胎上，定期去除有助于減少感染源[37,48]。Sahul-Hameed[60]研究也表明，早期清除死亡胚胎和碎屑可以防止細菌增殖。在奧斯塔歐洲螯蝦人工孵化的研究中，胚胎浸泡消毒和每日清除死胚均會提高孵化成功率和出苗幼蝦產(chǎn)量，其中去除死胚后的孵化率高于胚胎浸泡消毒的孵化率[39]。因此孵化期間需及時清除死胚以保證霉菌等不產(chǎn)生。Melendre 等[61]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胚胎發(fā)育不同步時，通過每天將第三期幼蝦幼蝦取出可以獲得較高出苗率，并觀察到第三期幼蝦會抓取并攝食早期幼蝦或同為三期的幼蝦，如果它們不被移除，它們在孵化器中的數(shù)量會隨新的蛻殼發(fā)生而增加，這也會增加攻擊行為和同類相食的頻率。Celada 等[48]與Melendre 等[34]的研究也表明第三期幼蝦、初孵幼蝦、胚胎之間的共存可能會導(dǎo)致出苗的幼蝦攝食未出苗的幼蝦或胚胎，因為在第一次蛻殼后，自由活動的幼蝦已經(jīng)開始早期攝食，因此建議孵化期間胚胎的同步性保持一致。Ⅴogt[23]發(fā)現(xiàn)初孵幼蝦主要依靠第一步足牢固附著于母體腹部剛毛，這種附著意義重大，因為它們通過附著于母體得到保護及適宜的溶氧與棲息環(huán)境，避免運動，將能耗降至最低。Cheng 等[10]在紅螯螯蝦胚胎離體孵化時在孵化器內(nèi)加入了15～25 個小網(wǎng)片取得較好效果，并認(rèn)為加入網(wǎng)片的作用是增加附著物，避免抱團中間的胚胎或蝦因缺氧死亡發(fā)霉，造成健康的胚胎或蝦被傳染。因此添加合適的附著物具有創(chuàng)造適宜的棲息環(huán)境、保護幼蝦、防止缺氧及霉菌等的傳播等作用。Cheng 等[62]運用循環(huán)水+機械拉動裝置對附著物進行了探索，結(jié)果表明在孵化盒內(nèi)插入細海綿條，可解決幼蝦孵出后幼蝦因為于孵化盒內(nèi)壁上磨擦碰撞損傷而造成損耗的問題，因為幼蝦附著在細海綿條上，細海綿條即可充當(dāng)母蝦腹足的作用，定期抖動，還柔軟有彈性，在抖動中起到幼蝦與孵化盒內(nèi)壁的緩沖間質(zhì)作用，這可以大幅減小幼蝦于內(nèi)壁上磨擦碰撞損傷，從而可以顯著提高出苗率。

4 離體孵化裝置的研究

Perez 等[59]于20 世紀(jì)就提出孵化裝置對淡水螯蝦類胚胎離體孵化的作用。Joly 等[18]研究認(rèn)為紅螯螯蝦等淡水螯蝦類的養(yǎng)殖技術(shù)已經(jīng)較為成熟，下一步關(guān)鍵是開發(fā)適宜的孵化裝置。目前在淡水螯蝦類胚胎離體孵化中取得過成功的裝置主要有四種：充氣懸浮上升裝置、反氣舉裝置、循環(huán)水裝置、循環(huán)水+機械拉動裝置。

4.1 充氣懸浮上升裝置

Brian 等研究認(rèn)為充氣懸浮上升裝置可成功應(yīng)用于亞比螯蝦胚胎的離體孵化。該裝置的原理是通過底部充氣使胚胎懸浮，從而為胚胎提供良好的水和氧氣，并避免了胚胎與可能會被細菌或寄生蟲感染的表面接觸[16]。但是此前的研究中，King[17]和Caceci等[63]使用靜態(tài)的充氣懸浮上升裝置孵化淡水螯蝦類胚胎均未獲得成功，而Carral 等[64]采用充氣懸浮上升裝置，上升流流速僅為0.5 L/min，胚胎不產(chǎn)生運動，卻能夠獲得85%的孵化率。因此，該裝置的孵化穩(wěn)定性仍需加強。

4.2 反氣舉裝置

該裝置優(yōu)化了充氣懸浮上升裝置，不僅多了對流，而且其內(nèi)部水流更大，同時，氣流從下往上，水流則從上往下，水與氧充分融合。Cheng 等[10]利用反氣舉法原理，使紅螯螯蝦胚胎在一個可控制的動態(tài)水流中處于不斷翻滾的狀態(tài)，從而形成一個穩(wěn)定的循環(huán)水流，使胚胎均勻而輕柔地翻動，這為胚胎提供了一個高氧孵化環(huán)境，且翻動的胚胎基本散開，有效抑制病菌的傳播。通過該反氣舉裝置，胚胎孵化率在80%以上、出苗率55%以上，共孵出SPF蝦苗10.65萬尾。

4.3 循環(huán)水裝置

近年來循環(huán)水裝置被應(yīng)用于淡水螯蝦類胚胎離體孵化的研究，這類裝置通過生物過濾和水循環(huán)設(shè)備保證孵化用水的質(zhì)量，并有助于節(jié)水[37]。Antonín 等[37]與Antonín 等[38]離體孵化奧斯塔歐洲螯蝦胚胎的結(jié)果表明循環(huán)水裝置可成功地用于該蝦。Royuela等對通訊螯蝦（P.leniusculus）胚胎離體孵化進行了研究，胚胎放置密度分別為6.6、20與42 cm-2，水流速分別為0.5 和1 L/min，消毒劑甲醛濃度分別為體積分?jǐn)?shù)2 500×10-6和3 000×10-6，結(jié)果表明，在密度20 cm-2，水流速為0.5 L/min，消毒劑為體積分?jǐn)?shù)2 500×10-6甲醛（隔天消毒一次，每次15 min）時，出苗率最高，達到88.8%[11]。

4.4 循環(huán)水+機械拉動裝置

該裝置是對循環(huán)水裝置的優(yōu)化升級。Rudge等在比較充氣懸浮上升裝置、胚胎置于網(wǎng)上+底下充氣的裝置及循環(huán)水+機械拉動裝置（Rudge等將其命名為Hemputin）后，發(fā)現(xiàn)后者效果明顯優(yōu)于前面兩者。該裝置是通過一個連接到架子上的電動機使孵化盒前后上下?lián)u動，從而模仿在母體中的抱卵環(huán)境，出苗率從母體孵化的55%提高至65%[9]。Clive等[19]利用循環(huán)水+機械拉動裝置（Clive 等將其命名為AquaⅤerde Incubator），裝置主體由一個淺的矩形不銹鋼槽組成，長3 m，寬60 cm，深15 cm，槽內(nèi)部不銹鋼框架被設(shè)計成可容納一定數(shù)量的孵化盒，整個框架與一個電動拉桿連接，來回運動使孵化盒在水中來回擺動，模仿抱卵蝦附肢的擺動，通過該裝置一個批次可生產(chǎn)約18萬尾幼蝦。Cheng等[62]運用循環(huán)水+機械拉動裝置共培育紅螯螯蝦SPF幼蝦240 031尾，孵化率達（85.34 ± 4.56）%，出苗率達（61.31 ±9.58）%。總體上該裝置具有以下優(yōu)點：1）批量化供苗能力大幅提高；2）易于選取同步出苗的幼蝦；3）出苗量清晰可控；4）有利于實施無特定病原苗種傳代；5）大幅減少人工，智能化與自動化程度高。

綜上所述，這四類孵化裝置各有優(yōu)點，但筆者認(rèn)為反氣舉裝置與循環(huán)水+機械拉動裝置具有更廣闊的應(yīng)用前景，特別是循環(huán)水+機械拉動裝置，批量化生產(chǎn)效果最好。同時，在進行胚胎離體孵化時，正如Antonín 等[38]提出的設(shè)想，還需要進行以下探索：1）探討胚胎表面正常菌群的地位和作用以及消毒劑對其的影響；2）研究真菌從受感染胚胎傳播到新宿主途徑；3）長期監(jiān)測亞硝酸鹽與氨氮等水質(zhì)條件對胚胎孵化和胚胎后發(fā)育的影響，并在循環(huán)水裝置運用生物過濾器等過濾或凈化水的部件，以用來穩(wěn)定硝化作用、防止水質(zhì)惡化和減少病菌的潛在定殖。

5 展望

今后離體孵化的目標(biāo)是要解決阻礙紅螯螯蝦等淡水螯蝦類產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的出苗量不足等問題，將離體孵化技術(shù)更好地應(yīng)用于實際生產(chǎn)，并深入思考以下三個問題：1）如何將離體孵化期間的水質(zhì)指標(biāo)穩(wěn)定保持在一個適宜的范圍；2）如何在大規(guī)模生產(chǎn)中，運用更高效的裝置實現(xiàn)離體孵化的智能化、數(shù)字化，批量化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苗種；3）如何控制胚胎或幼蝦死后病菌的滋生，實現(xiàn)孵化率與出苗率的提高。針對上述問題，筆者認(rèn)為，首先必須明確水質(zhì)指標(biāo)等環(huán)境因素適宜的范圍及最適值，并通過定期換水、消毒創(chuàng)造清潔、無污染的水環(huán)境，同時加入過濾及凈化水的部件，通過濾膜培養(yǎng)硝化細菌等有益菌，維持水生態(tài)的穩(wěn)定。其次，在規(guī)模化生產(chǎn)中，有必要應(yīng)用適合的離體孵化裝置的同時探討離體胚胎應(yīng)對不同外界因素的生理生化或分子層面的內(nèi)在機制，胚胎表面正常菌群的地位和作用以及消毒劑對其的影響，添加生物過濾器等控制硝化作用、水質(zhì)惡化和病菌的潛在定殖，真菌從受感染的胚胎傳播到新宿主的途徑等更深層次的問題，并進行跨學(xué)科的融合，建造智能化離體孵化車間，實現(xiàn)離體孵化的智能化、數(shù)字化、批量化，即可以基于離體胚胎孵化平臺，通過物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)將水質(zhì)傳感器、增氧設(shè)備、控溫裝置、自動化挑卵裝置、水循環(huán)等設(shè)備集成，實現(xiàn)對當(dāng)下離體孵化生態(tài)數(shù)據(jù)的實時采集，輔助管理人員對當(dāng)下孵化情況的實時掌握，提高生產(chǎn)效率，保證生產(chǎn)安全，并通過對整個孵化環(huán)境的具體指標(biāo)監(jiān)控，可以對水質(zhì)、溶氧、溫度和養(yǎng)殖設(shè)備是否正常運行進行監(jiān)控，還能對水質(zhì)指標(biāo)閾值進行設(shè)置，對突發(fā)事件及時響應(yīng)。最后，繼續(xù)篩選更好的消毒劑與消毒方法、孵化密度、胚胎剝離階段等，確定最適人為調(diào)控方法，并根據(jù)死胚透明度或折光度的變化，運用智能化挑卵裝置實現(xiàn)批量化、機械化挑除死胚，避免死胚造成的病菌滋生，實現(xiàn)孵化效率質(zhì)的提升。

6 結(jié)語

綜上所述，目前紅螯螯蝦等淡水螯蝦類產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸主要表現(xiàn)在苗種孵化期間，苗種孵化率低與出苗不同步、單位水體出苗量低、育苗占用空間大、人力投入量大等原因?qū)е碌拿绶N規(guī)?；?yīng)不足及價格較高等問題。因此，今后有必要針對上述實際生產(chǎn)中的這些問題進行研究。離體孵化技術(shù)的應(yīng)用可以節(jié)省人力、物力、占地與用水，還可有效提高孵化效率，減少飼養(yǎng)管理成本，并可發(fā)展“訂單育苗”“反季育苗”，有利于實現(xiàn)繁育的智能化與自動化，批量化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苗種，今后需要在離體孵化裝置的優(yōu)化、離體孵化期間水質(zhì)與菌群環(huán)境的維持、死胚與死蝦的挑除、苗種生產(chǎn)的批量化與智能化等方面進行深入研究，實現(xiàn)孵化效率質(zhì)的提升，使其更好應(yīng)用于實際生產(chǎn)。