食品中植物源成分分子生物學(xué)檢測技術(shù)及應(yīng)用研究綜述

◎王 妮

（長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院,遼寧 大連 130033）

近年來，我國推崇“五谷”“五菜”“五果”主題飲食。能夠改善我國居民偏向重油、高鹽、高糖飲食習(xí)慣。但目前植物源性加工產(chǎn)品出現(xiàn)摻假行為，如不含植物來源的植物蛋白飲料、蓮花月餅（實(shí)際上是以豆類為原料）、以綠豆為原料制成的栗子甜甜圈等。更有甚者，使用廉價(jià)植物源成分冒充高品質(zhì)、有機(jī)食物，以次充好，這些都對我國食品安全監(jiān)管提出新的挑戰(zhàn)，摻假問題會(huì)使消費(fèi)者對食品安全產(chǎn)生質(zhì)疑。在檢測時(shí)，通過傳統(tǒng)的檢測方法很難進(jìn)行精準(zhǔn)檢測。要結(jié)合全新分子生物學(xué)檢測方法，對植物種類保守基因以及蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。作為首要檢測手段，需要結(jié)合檢測對象的基因水平以及蛋白質(zhì)水平2大內(nèi)容，對已有的檢測技術(shù)進(jìn)行展望。

1 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特定基因檢測

1.1 常規(guī)PCR

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是分子生物學(xué)中用于增強(qiáng)特定DNA片段的方法，可以認(rèn)為是體外生物體DNA的特殊復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是可以增加DNA的量[1]。因此，無論是化石中的古生物學(xué)，還是歷史人物的遺骸，幾十年前的頭發(fā)、皮膚或血液，只要能提取出一點(diǎn)點(diǎn)DNA，就可以通過PCR增強(qiáng)和比較[2]。這就是“微證明”的力量所在[3]。

常規(guī)PCR是在穩(wěn)定DNA聚合酶作用下，以脫氧核糖核苷酸磷酸作為主要材料，通過引物退火以及DNA雙鏈變性等環(huán)節(jié)，完全檢測到基因信號。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，如瓊脂糖凝膠，可以準(zhǔn)確地確定研究結(jié)果。傳統(tǒng)PCR使用DNA作為生物遺傳信息的載體模板，具有獨(dú)特的權(quán)威性以及科學(xué)性[4]。同時(shí)，也是檢測基因技術(shù)應(yīng)用最廣泛的一種方式，具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)。采用常規(guī)PCR對序列進(jìn)行擴(kuò)增，對青花椒屬完成鑒別。在序列號中，青花椒屬物種ITS2堿基數(shù)分別保持在383、388、385。對食物食用油中的摻假情況進(jìn)行分析，發(fā)掘食用油中加入廉價(jià)棕櫚油，PCR檢測方法的原理：將檢測拷貝數(shù)限制于5個(gè)單倍拷貝體，這種檢測技術(shù)有較高的靈敏度。例如，若檢查的橙汁中柑橘成分，對于橙汁進(jìn)行PCR檢測，能夠快速的得知其柑橘成分比例。借助葉綠體基因檢測，能夠有效分離出原橙汁以及摻假柑橘汁二者之間的比例，該方法的變異系數(shù)為7.5%，在盲測中正確識別20樣品，以22個(gè)樣品為最終數(shù)。無任何假陽性結(jié)果，這得表明常規(guī)PCR檢測技術(shù)有較高的應(yīng)用優(yōu)勢，但且耗時(shí)較長、操作步驟較繁瑣。因此，要在后續(xù)對常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行升級[5]。

1.2 熒光定量PCR

與傳統(tǒng)的PCR檢測方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測增加了特異性結(jié)合基因片段的熒光探針。例如，PCR技術(shù)可以增強(qiáng)目標(biāo)基因的片段，并在單個(gè)離心管中分析產(chǎn)物，其特點(diǎn)是具有高特異性、更好的靈敏度、低交叉污染風(fēng)險(xiǎn)的特性。PCR技術(shù)檢測耗時(shí)較小，檢測靈敏精準(zhǔn)度可達(dá)95%以上[6]。對于背景物質(zhì)的干擾，殘留細(xì)胞核生破壞程度等均符合要求。對芝麻進(jìn)行熒光定量PCR檢測，能夠清晰的對芝麻2s 白蛋白基因進(jìn)行特異設(shè)計(jì)。而扁桃仁、腰果、榛子、胡桃、花生、南瓜子、葵花籽等則無交叉反應(yīng)。硬質(zhì)小麥以及普通小麥進(jìn)行摻假分析，檢測靈敏度高達(dá)0.15，符合最低檢測要求。結(jié)合運(yùn)動(dòng)基因高度保守區(qū)域，涉及特異性引物探針，DNA質(zhì)量濃度的檢測精準(zhǔn)度達(dá)到要求。而對于咖啡豆檢測，可連續(xù)稀釋咖啡溶液，并建立4個(gè)物種超標(biāo)曲線，線性相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.99。通過結(jié)果顯示，這些物種DNA定量檢測達(dá)0.4，是一種較優(yōu)的基因檢測程序。在檢測添加量0.01%~6.00%范圍內(nèi)的肝大豆蛋白，可在加工肉類制品中檢測出大豆成分，成為我國新型檢測技術(shù)。但熒光定量PCI檢測對標(biāo)準(zhǔn)曲線有一定的依賴性，在實(shí)際樣品提取、TCL擴(kuò)增等方面有一定的差異。因此，限制PCI樣品定量分析領(lǐng)域的應(yīng)用[7]。

1.3 數(shù)字PCR

在數(shù)字PCR中，注意單分子目的序列。數(shù)字PCR拷貝定量技術(shù)，能夠計(jì)算出初始樣品的序列，精確拷貝數(shù)量，擺脫傳統(tǒng)的梯度標(biāo)準(zhǔn)測繪曲線以及基因定量方式，能夠?qū)z測樣品中的序列號位數(shù)量進(jìn)行確定[8]。數(shù)字PCR能夠解決傳統(tǒng)PCR測量出現(xiàn)的性能復(fù)雜、重復(fù)性差、帶寬低等問題，具有自動(dòng)化、高帶寬的優(yōu)點(diǎn)。主要數(shù)字PCR分為芯片PCR和微滴數(shù)字PCR，在食品植物源成分方面，以杏仁露為主，分析杏仁露的摻假成分。數(shù)字PCR技術(shù)要求檢測杏仁露中是否包含花生成分，根據(jù)計(jì)算公式，在材料質(zhì)量和拷貝數(shù)之間完成特定人工偽造樣品和市售樣品的檢測，重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間的變異系數(shù)小于15%，有助于進(jìn)行定量分析，確定偽造的效果。建立數(shù)字PCR定量檢測方法，線性擬合系數(shù)為0.997 2。因此，數(shù)字PCR技術(shù)能夠精準(zhǔn)地顯示某銷售杏仁露中包含摻假花生成分。數(shù)字PCR技術(shù)可以顯著排除背景干擾影響，提高檢測性能。數(shù)字PCR技術(shù)不會(huì)依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此對檢測出現(xiàn)的差異性有較高的確認(rèn)以及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，具有很大的優(yōu)勢。目前，它已成為數(shù)字PCR檢測技術(shù)的主力軍，創(chuàng)建一個(gè)準(zhǔn)確的檢測平臺，為以后如何識別食品類型和來源成分提出新的研究思路[10]。

2 基于恒溫?cái)U(kuò)增特定基因檢測

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增要結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的特定區(qū)域，完成引物設(shè)置。在恒溫條件下（60~65 ℃），采用具有線圈置換活性的聚合酶擴(kuò)增位于靶區(qū)的基因，檢測靈敏度高，符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，這種新型檢測技術(shù)無需精準(zhǔn)變溫條件，反應(yīng)時(shí)間大、范圍縮短、檢測結(jié)果具有明顯的可視化。通過多條引物，對特定區(qū)域識別匹配進(jìn)行反應(yīng)，有極高的特異性。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增有檢測效率較高、操作便捷、對儀器設(shè)備要求較低、結(jié)果判定簡單等優(yōu)勢，已得到廣泛應(yīng)用。對面包混合物進(jìn)行分析，檢測黑芥、白芥檢測定量，設(shè)置為16 mg·kg-1，定量檢測標(biāo)準(zhǔn)定為16 mg·kg-1，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，明確分析黑芥、白芥成分。而對于蘑菇樣品進(jìn)行檢測，能夠?qū)?zhǔn)基因成分以及過敏原檢測技術(shù)提供DNA片段，突破檢測難點(diǎn)。

2.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增

對重聚酶聚合酶擴(kuò)增進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)2種以上的特定引物。在25~42 ℃恒溫條件下進(jìn)行檢測，了解重組酶催化以及單鏈DNA結(jié)合蛋白定位模板序列，使DNA能夠達(dá)到聚合酶催化鏈接。與常規(guī)檢測方法相比，重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間更短，在5~15 min內(nèi)即可完成反應(yīng)。對于溫度也無特定要求，成本較低、反應(yīng)速度較快、樣品預(yù)處理要求較低。重組酶聚合酶擴(kuò)增在一般實(shí)驗(yàn)室即可完成檢測，限制較低，是近年來食品檢測優(yōu)先使用技術(shù)。對芒果肉進(jìn)行檢測，分析芒果肉是否出現(xiàn)摻假，重組酶聚合酶擴(kuò)增了解芒果肉檢測底線為1 copie·uL-1。對于中草藥銀杏葉是否用刺槐樹葉偽造，重組酶聚合酶的擴(kuò)增具有獨(dú)特的檢測優(yōu)勢，引起了廣泛關(guān)注。但該技術(shù)自身也有一定的缺陷，例如，傳統(tǒng)檢測方法擴(kuò)增技術(shù)的探針以及引物較短，重組酶聚合酶擴(kuò)增探針、引物較長，這無疑增加了設(shè)計(jì)難度。

3 基因序列多態(tài)性分析的通用基因檢測

在DNA條形碼分析中，基因序列多態(tài)性分析是一種先進(jìn)的分析技術(shù)，DNA序列的變異性用于快速準(zhǔn)確地鑒定物種。DNA條形碼現(xiàn)在被認(rèn)為是一種快速、廉價(jià)、通用的物種觀察技術(shù)，達(dá)到有效的監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)。對橄欖油是否包含菎麻油進(jìn)行分析，DNA條形碼能夠精準(zhǔn)的檢測出橄欖油存在5%的菎麻油摻假成分。原理是通過高分辨溶解曲線，對摻假情況進(jìn)行檢測。對大豆粉進(jìn)行分析，也可檢測大豆粉中存在1%的鷹嘴豆粉。與氣相色譜分析法進(jìn)行對比，DNA條形碼分析能夠有更好的靈敏度、檢測效率。對杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻、榛子等檢測物進(jìn)行分析，通過實(shí)驗(yàn)表明，部分花生制品加入杏仁。監(jiān)測依據(jù)是花生監(jiān)測的數(shù)據(jù)出現(xiàn)波動(dòng)，該波動(dòng)表明出現(xiàn)其他物種摻雜。而對蜂蜜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)蜂蜜摻雜白糖，且4種草本蜂蜜至少出現(xiàn)2~3種植物成分。

4 結(jié)語

在檢測中，要求考慮溫度、化學(xué)物質(zhì)、紫外線、酸堿度等影響因素，使檢測結(jié)果更高的穩(wěn)定性，所有的分析保守因素更為理想。在食品動(dòng)物植物源性成分檢測技術(shù)的研究方向，將隨著我國檢測技術(shù)的更新，而不斷發(fā)生變化。在食品生產(chǎn)、加工過程中，倉儲以及對應(yīng)的加工設(shè)備等原因，很有可能導(dǎo)致植物性原分子出現(xiàn)摻雜情況或無意識摻雜等情況。原材料在攪拌、高壓、破碎等過程中，必然會(huì)出現(xiàn)特征成分純度下降。檢測技術(shù)可應(yīng)用于核酸含量低、高度分解的樣本，有目的地完成選型，確保安全。檢測技術(shù)可以為進(jìn)一步評估和區(qū)分解決方案提供技術(shù)依據(jù)，快速檢測是未來食品生產(chǎn)和周轉(zhuǎn)監(jiān)管發(fā)展的主要趨勢。以DPC為代表，將完成精準(zhǔn)定量檢測目標(biāo)/以DNA條碼技術(shù)為發(fā)展方向，改變傳統(tǒng)檢測單一性以及檢測數(shù)據(jù)模糊不精準(zhǔn)等問題，實(shí)現(xiàn)高效篩選以及多物種分析。