外施水楊酸誘導煙草苗期對低溫脅迫耐寒性的最適濃度篩選

金 哲, 董環(huán)宇, 金銘路, 任昭輝, 蘇 亮, 李俊明, 樸世領(lǐng)*

(1.吉林省煙草公司延邊州公司;2.延邊大學農(nóng)學院:吉林 延吉 133002;3.吉林煙草工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心,長春 130033)

低溫脅迫是影響植物生長發(fā)育及作物產(chǎn)量最主要的逆境脅迫之一,會導致產(chǎn)量降低,嚴重時甚至導致植株死亡[1]。水楊酸(Salicylic acid, SA)是一種小分子酚類化合物,廣泛存在于植物體內(nèi),逆境條件下,可使植物保持較高的抗氧化酶活性,增強其抗氧化能力[2],從而增強植物的耐寒力。相關(guān)研究表明,SA可增強植物在低溫脅迫下細胞膜穩(wěn)定性和抗氧化酶活性,抑制丙二醛和活性氧積累,增強滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,緩解低溫脅迫對植物造成的損傷[3-4]。以往的研究已經(jīng)證實了水楊酸對植物耐寒性的顯著作用,但有關(guān)東北地區(qū)在低溫脅迫下施加外源水楊酸對烤煙生理特性的影響鮮有報道。該研究對煙草苗期葉面噴施4個梯度的外源水楊酸處理,對與耐寒性相關(guān)的生理指標進行主成分分析,篩選出外源水楊酸的最佳施用濃度,為后續(xù)研究煙草低溫脅迫的機理和在生產(chǎn)上緩解低溫脅迫對煙草的不利影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以課題組前期工作篩選出的低溫敏感型品種NC82為試材,所需的種子材料由吉林省延邊朝鮮族自治州農(nóng)科院煙草研究所提供,外源水楊酸購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1) 種子預處理及育苗 試驗所需種子播種前用濃度為1%無水硫酸銅消毒15 min,之后用清水浸種24 h,然后用播種于540 mm×280 mm的裝有基質(zhì)(腐殖質(zhì)、草炭土、細紗為10∶10∶1)的72孔簡塑盤中,在溫室內(nèi)育苗,3葉齡時選擇壯苗假植至32孔簡塑料盤(540 mm×275 mm)。

2) 低溫脅迫及不同濃度水楊酸處理 苗期達到5～6葉齡時,連續(xù)3 d每天上午9:00用不同濃度SA進行葉面噴施處理1次,SA濃度梯度分別為0.5(T1)、1(T2)、1.5(T3)、2.0(T4) mmol/L,每株噴施量相同,約為1.5～2 mL。葉面噴施后24 h放于人工氣候箱中進行11 ℃低溫光照培養(yǎng)。常溫對照(CK)葉面噴水后在人工氣候箱中25 ℃培養(yǎng),低溫對照(CK0)葉面噴水后先在氣候箱中25 ℃培養(yǎng)3 d后再進行11 ℃低溫處理,氣候箱白天光照度設(shè)置為100～560 μmol/(m2·s),光照時數(shù)12 h,相對濕度80%。于0、2、6、8 d選取長勢一致烤煙幼苗進行取樣,每個處理3次重復,并放于-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.3 測定項目與方法

1) 干物質(zhì)積累量和根系活力的測定 采用常壓干燥法進行測定[6]。對煙株去泥洗凈后測定鮮重,后置入設(shè)定在100～105 ℃的電熱鼓風干燥箱(101-1A型)中完成干燥過程。連續(xù)烘干至3次恒重,冷卻結(jié)束后,測定其質(zhì)量,得到干重。根系活力參考TTC法進行測定[7]。

2) 抗氧化酶活性和脯氨酸含量的測定 SOD活性參考氮藍四唑法進行測定[8];CAT活性參考分光光度法進行測定[9];POD活性參考愈創(chuàng)木酚測定法進行測定[10];脯氨酸含量參考茚三酮比色法進行測定[11]。

3) 葉綠素及活性氧代謝指標的測定 選取長勢一致幼苗,由上至下第3片真葉采用SPAD-205葉綠素儀測定葉綠素含量。電導率采用ORION TDS型電導率儀進行測定,MDA含量參考硫代巴比妥酸法進行測定[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及主成分分析

使用SPSS20和Microsoft Excel 2013軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)及繪圖。對4個梯度SA處理各生理生化指標數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA檢驗。并采用8 d時各低溫脅迫處理的生理生化指標為耐寒性評價的原始數(shù)據(jù),對其進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個SA濃度處理低溫脅迫后干物質(zhì)和根系活力變化規(guī)律

不同濃度SA處理對干物質(zhì)積累量的影響列于表1。與常溫對照(CK)處理相比,各低溫脅迫處理的干重隨低溫天數(shù)增加呈緩慢增長趨勢,低溫脅迫2～4 d時,各處理之間均無顯著性差異(P>0.05);脅迫至8 d時,各低溫脅迫處理均顯著低于CK處理(P<0.05),外施水楊酸濃度T1(0.5 mmol/L)和T2(1 mmol/L)處理間無顯著性差異,且均高于其余低溫處理;與常溫對照相比,T2和T1處理降幅均較小,分別為T2(-8.33%)和T1(-8.95%),其次為T3(-12.65%)和T4(-12.96%),下降幅度最大的是CK0(-13.27%);綜合來看外施SA濃度為T2處理時表現(xiàn)最好,最接近CK處理,低溫脅迫后仍能保持較高的干物質(zhì)積累量。

表1 不同濃度SA處理對干物質(zhì)積累量的影響

不同濃度SA處理對根系活力的影響見表2。

表2 不同濃度SA處理對根系活力的影響

低溫脅迫后各低溫脅迫處理根系活力均出現(xiàn)逐漸下降的變化規(guī)律,而常溫對照(CK)處理呈平穩(wěn)上升趨勢,低溫脅迫8 d時,T1與T2處理間無顯著性差異(P>0.05),但均顯著高于其余低溫脅迫處理,大小順序依次為CK、T2、T1、T3、T4和CK0,其中T2處理最接近CK處理,表現(xiàn)最好,而T4處理最接近低溫對照CK0處理,表現(xiàn)最差;隨脅迫天數(shù)的增加,與常溫對照(CK)處理相比各低溫脅迫處理根系活力的降幅均隨低溫持續(xù)時間的增加而增大,低溫處理8 d時,各處理根系活力降幅均達到最大,其值自大到小分別是CK0(-36.77%)、T4(-35.70%)、T3(-34.45%)、T1(-32.69%)和T2(-30.46%),綜合來看,預施1 mmol/L濃度的SA處理,可有效減緩根系活力下降程度,效果最好。

2.2 4個SA濃度處理低溫脅迫后抗氧化酶活性和脯氨酸含量變化規(guī)律

不同濃度SA處理對POD活性的影響見表3。隨低溫處理天數(shù)的增加,常溫對照(CK)處理POD活性呈平穩(wěn)上升趨勢,而各低溫脅迫處理均為先升高后降低,處理階段2～4 d,POD活性顯著上升,并在4 d時達到最高,其值按大小順序為,T2(88.21 U/g)、T1(87.29 U/g)、T3(83.25 U/g)、T4(81.92 U/g)、CK0(81.58 U/g)和CK(45.87 U/g),與常溫對照相比,不同濃度SA處理POD活性增幅均在處理4 d時最高,其中,T2處理增幅最大,分別為T1、T3、T4和CK0的1.02、1.13、1.17和1.19倍;綜合來看,低溫脅迫前,外施1 mmol/L SA可最大程度地提高煙草苗期的POD活性。

表3 不同濃度SA處理對POD活性的影響

不同濃度SA處理后SOD活性變化(表4)均呈先升高后降低的趨勢,而常溫對照(CK)處理穩(wěn)定上升,各處理受到11 ℃低溫脅迫時,SOD活性迅速上升,在2 d時達到峰值,大小排序為T2(220.25 U/g)、T1(218.25 U/g)、T3(213.88 U/g)、T4(207.94 U/g)、CK0(199.32 U/g)和CK(90.62 U/g),T1與T2處理間無顯著性差異,但均高于其余低溫脅迫處理;低溫處理2 d時,與CK處理相比各低溫脅迫處理增幅迅速增加,并達到峰值,其增幅大小順序及數(shù)值為T2(143.05%)、T1(140.84%)、T3(136.02%)、T4(129.46%)、CK0(119.95%),T1與T2濃度處理均高于其他濃度處理,但二者間無顯著差異(P>0.05);綜合來看,外施1 mmol/L SA可最大程度提高低溫脅迫后烤煙苗期的SOD活性。

表4 不同濃度SA處理對SOD活性的影響

不同濃度SA處理后CAT活性變化(表5)與SOD活性變化基本一致。

表5 不同濃度SA處理對CAT活性的影響

各低溫脅迫處理均在2 d時CAT活性達到最高,分別為T2(205.24 μg/g)、T1(203.26 μg/g)、T3(194.02 μg/g)、T4(189.28 μg/g)和CK0(175.46 μg/g),之后開始下降,而常溫對照(CK)呈平緩上升趨勢,T1與T2處理間無顯著性差異(P>0.05),且顯著高于其余低溫脅迫處理(P<0.05);與常溫對照相比,低溫處理2 d時,各低溫脅迫處理增幅均達到最高,其中,T2處理增幅最大,分別較T1、T2、T4和CK0處理高2.41、13.62、19.37和36.14個百分點;因此,外施SA濃度為T2時,可最大程度地提高低溫脅迫后烤煙苗期的CAT活性。

不同濃度SA處理對Pro含量的影響見表6。隨低溫持續(xù)天數(shù)增加,低溫脅迫各處理均呈不斷上升趨勢,且顯著高于常溫對照(CK),CK處理則保持平穩(wěn)上升趨勢。低溫處理至8 d時,各處理Pro含量最高,大小順序依次為T2(7.09 μg/g)、T1(6.99 μg/g)、T3(6.62 μg/g)、T4(6.39 μg/g)、CK0(6.81 μg/g和CK(2.95 g/g),T2與T1無顯著性差異(P>0.05),二者與其他4個處理均有顯著性差異(P<0.05);與常溫對照(CK)處理相比,各低溫脅迫處理增長幅度均隨低溫持續(xù)時間的增加而增大,低溫處理2 d時,各處理Pro含量增幅間差異不顯著(P>0.05),低溫處理8 d時,各處理Pro含量增幅均達到最大,其值從大到小分別是T2(140.34%)、T1(136.95%)、T3(124.41%)、T4(116.61%)、CK0(96.95%);綜合來看,外施1 mmol/L SA處理,可有效增加Pro含量,且效果最好。

2.3 4個SA濃度處理低溫脅迫后葉綠素含量和活性氧代謝指標變化規(guī)律

不同濃度SA處理對葉綠素含量的影響列于表7。隨低溫天數(shù)的增加,各低溫脅迫處理的葉綠素含量與常溫對照(CK)處理相比,均有不同程度的下降,脅迫至8 d時,各低溫脅迫處理下降程度最明顯,排序自大到小依次為,CK0(25.01 mg/g)、T4(25.61 mg/g)、T3(25.66 mg/g)、T1(26.54 mg/g)和T2(26.78 mg/g),其中T1與T2處理間無顯著性差異(P<0.05),且均顯著高于其余低溫脅迫處理;脅迫8 d時,與CK處理相比各低溫脅迫處理降幅均達到最大,按大小排序依次為CK0(-26.55%)、T4(-24.79%)、T3(-24.64%)、T1(-22.06%)、和T2(-21.35%);由此可見,施用適宜濃度的外源SA,可緩解低溫脅迫下煙草苗期的葉綠素下降程度,其中,T2濃度處理表現(xiàn)最為優(yōu)異。

表7 不同濃度SA處理對葉綠素含量的影響

隨低溫脅迫天數(shù)的增加,各處理MDA含量(表8)均有不同程度的增加,在2～8 d時,MDA積累量均呈平穩(wěn)上升趨勢,常溫對照(CK)始終趨于平緩趨勢。處理8 d時,各處理MDA積累量均最高,按大小順序排序為CK0(8.78 nmol/g)>T4(8.66 nmol/g)>T3(8.52 nmol/g)>T1(8.19 nmol/g)>T2(7.98 nmol/g),T1與T2處理在8 d時不存在顯著性差異(P>0.05),但顯著低于CK處理(P<0.05),隨脅迫天數(shù)的增加,各低溫脅迫處理與CK處理相比,MDA含量增幅逐漸上升,6～8 d時,增幅變化較明顯,8 d時,MDA增長幅度最大,按積累量增幅排序為CK0(94.68%)、T4(92.02%)、T3(88.91%)、T1(81.60%)和T2(76.94%)。

表8 不同濃度SA處理對MDA含量的影響

綜合來看,11 ℃低溫脅迫前,外施適宜濃度的SA處理,可有效減緩MDA積累量,其中,T2(1 mmol/L)濃度處理最佳,最接近CK處理。

不同濃度處理對電導率的影響見表9,各低溫脅迫處理電導率與MDA積累量變化趨勢基本一致,隨低溫脅迫天數(shù)不斷增加,均呈急劇上升趨勢,而常溫對照(CK)處理呈緩慢上升趨勢,各處理均于8 d時達到最大值,其中,T2與T1處理電導率均較低,分別為T2(41.88%)和T1(42.54%),2處理間無顯著性差異(P<0.05),其中,T2濃度處理最接近CK,低溫處理CK0表現(xiàn)最差(50.93%),T4(1 mmol/L)濃度處理與CK0最為接近;與常溫對照相比,不同濃度SA處理相對電導率增幅均在處理8 d時最高,其中,T2和T1處理增幅均較小,分別為18.10%和19.97%,表現(xiàn)較好,而CK0處理最高,為43.63%,表現(xiàn)最差。因此,11 ℃低溫脅迫前,預施適宜濃度的SA處理,可有效減緩電導率上升,其中,T2(1 mmol/L)濃度處理最佳,最接近CK處理。

表9 不同濃度處理對電導率的影響

2.4 4個SA濃度處理低溫脅迫后8 d時各指標耐寒性主成分分析

對不同濃度處理基于主成分分析的耐寒性綜合排序結(jié)果見表10。

表10 不同濃度處理低溫脅迫8 d時各生理指標主成分分析總得分及排序

外施SA濃度為1 mmol /L時,耐寒性最強,為3.59,0.5和1.5 mmol /L次之,分別為2.39和-0.64,外施2 mmol /L SA的耐寒性最低,為-1.85。

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫會降低光合速率,影響水分吸收與運輸,降低營養(yǎng)物質(zhì)的積累進而降低植物的干物質(zhì)積累量。該研究發(fā)現(xiàn),外施1 mmol/L SA后,烤煙的干物質(zhì)積累量在低溫脅迫各個時期均高于低溫對照處理(CK0),最接近于常溫對照(CK),有效減緩低溫脅迫后干物質(zhì)積累量的下降幅度,這與許勇等[13]研究一致,這是由于外施水楊酸能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、丙二醛含量以及可溶性糖、脯氨酸等保護物質(zhì)的合成,改變植物體內(nèi)的堿基平衡狀態(tài),并刺激次生代謝過程[14]。

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官,直接影響地上部的營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平,低溫脅迫會抑制根系的生長,同時也會改變根的代謝和植物形態(tài)[15-16]。該試驗發(fā)現(xiàn),隨低溫脅迫天數(shù)的持續(xù),烤煙幼苗生長受到抑制,而外施4個梯度的SA處理均能顯著緩解低溫脅迫的抑制作用,且1 mmol/L緩解效果最好,說明外施適宜濃度SA能夠緩解低溫脅迫對烤煙幼苗根系活力的影響,這與孫波等[17]人研究結(jié)果一致。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)在植物酶促防御機制中起到至關(guān)重要的作用,是植物抵御抗氧化的第1道防線[18-19]。SOD能夠清除植物在逆境下產(chǎn)生的超氧陰離子自由基,POD是抗氧化系統(tǒng)的組成部分,可有效降低細胞膜脂過氧化,CAT的主要作用是清除植物代謝中產(chǎn)生的H2O2,避免H2O2過量積累而對細胞造成氧化破壞[20]。該試驗結(jié)果表明,隨著低溫脅迫時間的延長,各低溫脅迫處理抗氧化酶活性均呈先上升后下降的趨勢,造成此現(xiàn)象的原因可能是低溫脅迫前期煙株體內(nèi)積累了大量的活性氧,消耗了大量抗氧化酶,導致后期酶活性降低,這與張中華等[21]研究結(jié)果一致。SA作為內(nèi)源信號分子,能夠刺激植物在遭遇逆境脅迫時啟動生理生化反應(yīng),從而提高酶活性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫脅迫前外施1 mmol/L SA,烤煙幼苗的抗氧化酶活性均顯著高于常溫對照處理,說明外施適宜濃度SA可有效刺激酶活性,清除大量的活性氧,降低膜脂過氧化造成的損害,提高煙草耐寒力,這與張俊康等[22]研究結(jié)果一致。

低溫脅迫下,植物體內(nèi)的脯氨酸含量會迅速增加,這主要是因為低溫會誘導脯氨酸合成酶的活性增強,促使脯氨酸生成;同時,低溫也可能減慢脯氨酸降解速度,導致在細胞中積累[23]。該試驗研究發(fā)現(xiàn),外施4個梯度水楊酸處理均能夠顯著提高植物在低溫脅迫下的脯氨酸含量,減輕低溫脅迫對烤煙幼苗的損傷,其中,1 mmol/L效果最好,這與李美茹等[24]研究結(jié)果一致。這可能是因為水楊酸觸發(fā)了植物中的信號傳遞系統(tǒng),使得植物能更有效地適應(yīng)和抵抗低溫脅迫[25]。

前人研究發(fā)現(xiàn)[26],植物在遭遇低溫脅迫時,會導致細胞內(nèi)膜脂過氧化和活性氧自由基積累,細胞膜完整性遭到破壞,膜透性加大,誘導膜脂氧化產(chǎn)物MDA含量和相對電導率顯著增加。該試驗結(jié)果表明,11 ℃低溫脅迫后,烤煙葉片的相對電導率和MDA含量迅速上升,表明低溫對烤煙葉片穩(wěn)定性和細胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。外施1 mmol/L SA處理顯著降低了MDA含量和相對電導率,削弱了細胞膜受損程度,緩解了低溫脅迫對烤煙幼苗的損害,這與田丹青等[27]、韓浩章等[28]的研究結(jié)果一致。這是由于外施SA可以通過調(diào)節(jié)質(zhì)膜中飽和及非飽和脂肪酸的比例來維持質(zhì)膜穩(wěn)定性,保持活性氧代謝系統(tǒng)平衡,進而降低膜脂過氧化造成的損害[29]。該試驗發(fā)現(xiàn),外施SA濃度過高或過低都不利于緩解低溫脅迫對幼苗的損害,這可能是由于低濃度的SA不足以抵抗低溫脅迫下自由基對細胞的損害,而高濃度SA又不利于SA蛋白與SA相結(jié)合,進而導致活性氧自由基的大量積累,這與王詩雅等[30]的研究結(jié)果一致。

低溫脅迫導致葉綠素合成減少、降解速度加快,以及光合過程受損[31]。該試驗發(fā)現(xiàn),外施1 mmol/L外源SA顯著提高了植物葉綠素含量,這主要是因為水楊酸可以抑制葉綠素分解酶的活性,降低葉綠素的降解速率;同時,它還可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素水平,促進葉綠素的合成,這與馬曙曉等[32]的研究結(jié)果一致。

主成分分析(PCA,Principal Component Analysis) 是一種常用的數(shù)據(jù)分析方法。其操作是通過線性轉(zhuǎn)換(數(shù)據(jù)標準化處理),將數(shù)量眾多的變量選出較少個數(shù)重要變量,這些變量能夠概括原始信息的85%以上,并且可在此基礎(chǔ)上進行綜合分析[33-34]。外施水楊酸誘導煙草苗期對低溫脅迫耐寒性的綜合排序從大到小依次為1 mmol/L>0.5 mmol/L>1.5 mmol/L>2 mmol/L>低溫對照(CK0)。

綜上所述,外施水楊酸濃度為1 mmol/L時,能夠顯著提高低溫敏感型品種(NC82)的耐寒力,緩解低溫脅迫對烤煙幼苗造成的損害。