響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取青椒葉多酚工藝及抗氧化研究

藍(lán) 志 福

(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 繼續(xù)教育學(xué)院,福建 漳州 363000)

青椒(CapsicumannuumL.)也稱為燈籠椒或柿子椒,為茄科辣椒屬草本植物,起源于中南美洲的熱帶地區(qū),現(xiàn)在已經(jīng)在全國各地廣泛種植[1-2]。青椒的根、莖、葉、果實(shí)中含有多種天然有效成分,包括黃酮、多酚和生物堿等,這些成分具有多種生物生理功能[3-4]。其中,多酚是一種廣泛存在于植物果實(shí)、皮、葉、根和莖等部位中,含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的復(fù)雜次生代謝物。多酚具有抗癌、抗病毒、抗氧化、改善人體免疫力、防止動(dòng)脈硬化、降低血脂血糖等多種生理功能,廣泛應(yīng)用于食品、化工、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-6]。然而,目前尚未有青椒葉多酚提取的相關(guān)報(bào)道。隨著科技的不斷發(fā)展,超聲波輔助技術(shù)在植物提取方面的優(yōu)勢越來越顯著。利用超聲波產(chǎn)生的高加速度、猛烈振動(dòng)、劇烈的空化作用、熱效應(yīng)以及攪拌作用等能夠使植物有效成分更易進(jìn)入溶劑,具有省時(shí)、節(jié)能、高效和操作簡單的特點(diǎn)[7-8]。該研究以青椒葉為原料,以多酚提取率為指標(biāo),利用超聲輔助法對(duì)青椒葉多酚進(jìn)行提取,并使用響應(yīng)面對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí),評(píng)價(jià)青椒葉多酚的抗氧化活性。該研究為青椒葉多酚資源的深入研究及青椒葉抗氧化劑的開發(fā)利用提供了參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

青椒葉采自福建省漳州市詔安縣西潭鎮(zhèn),乙醇為食品級(jí),產(chǎn)自河南漢永酒精有限公司。沒食子酸,分析純,購自無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司;硫酸鋰、鉬酸鈉、鎢酸鈉等均為市售分析純試劑。

超聲波清洗機(jī)(KQ250DE),購自昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800PC-DS2),購自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的測定

采用福林酚法[9]在可見光區(qū)的765 nm處測定青椒葉多酚溶液的吸光度,并利用吸光度與濃度之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸得到回歸方程。通過回歸方程,計(jì)算出試驗(yàn)中青椒葉多酚的提取率。

(1)

式中,b為多酚質(zhì)量濃度,mg/mL,V為定容后提取液體積,mL,m為青椒葉質(zhì)量,g。

1.2.2 青椒葉多酚的提取工藝

采摘新鮮的青椒葉,用清水洗凈,再用蒸餾水淋洗,晾干。將晾干后的青椒葉在50 ℃烘箱中烤干,再使用粉碎機(jī)對(duì)其進(jìn)行粉碎和過篩,備用。將1 g青椒葉粉末放入燒瓶中,并按照預(yù)設(shè)的工藝條件,置于超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行提取。待提取結(jié)束后,通過過濾、濃縮和定容等步驟處理樣品,得到青椒葉多酚提取液。根據(jù)式(1)計(jì)算出青椒葉多酚的提取率,并進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn),取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

該試驗(yàn)將乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度作為考察因素,研究各工藝對(duì)青椒葉多酚提取率的影響。具體工藝如下:設(shè)定超聲時(shí)間40 min、液料比25∶1 (mL∶g)和超聲溫度70 ℃,改變乙醇濃度(分別選取50%、60%、70%、80%和90%)來考察;設(shè)定乙醇濃度70%、液料比25∶1 (mL∶g)和超聲溫度70 ℃,改變超聲時(shí)間(分別選取20、30、40、50、60 min)來考察;設(shè)定乙醇濃度70%、超聲時(shí)間40 min和超聲溫度70 ℃,改變液料比(分別選取15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL∶g)來考察;設(shè)定乙醇濃度70%、超聲時(shí)間40 min和液料比25∶1 (mL∶g),通過改變超聲時(shí)間(65、70、75、80、85 ℃)來考察。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了探究乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度等4個(gè)單因素對(duì)青椒葉多酚提取的影響,該研究采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,在Design-Expert 8.05b軟件中建立4因素3水平的試驗(yàn)方案(表1)。

表1 Box-Behnken因素和水平表

1.2.5 抗氧化性能測試

1) DPPH自由基清除率的測定

取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液加入2 mL蒸餾水,混合均勻后測定其在517 nm處的吸光度,記為A0;取2 mL不同濃度的青椒葉多酚溶液,分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,混合均勻30 min,在517 nm處測定吸光度,記為Ai;取2 mL不同濃度的青椒葉多酚溶液,加入2 mL乙醇,混合均勻后測定517 nm處的吸光度,記為Aj。以抗壞血酸為對(duì)照,計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率。

2) OH自由基清除率的測定

取2 mL不同濃度的青椒葉多酚溶液,分別加入2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL的9 mmol/L FeSO4溶液,繼續(xù)加入1 mL 0.01% H2O2溶液混合均勻后反應(yīng)60 min,定容,并測得在510 nm處的吸光度,記為Ai。以蒸餾水代替H2O2溶液為對(duì)照組,測得吸光度,記為Aj,以蒸餾水代替青椒葉多酚為空白組,測得吸光度記為A0,計(jì)算對(duì)OH自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的影響

由圖1可知,青椒葉多酚的提取率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加,并在乙醇濃度為70%時(shí)達(dá)到峰值。這是因?yàn)殡S著乙醇濃度的上升,溶劑極性降低,導(dǎo)致其更容易破壞植物體內(nèi)的氫鍵結(jié)構(gòu),使得多酚類物質(zhì)更容易溶解出來。但當(dāng)乙醇濃度過高時(shí),乙醇會(huì)溶解其他一些醇溶性雜質(zhì),并與多酚類物質(zhì)競爭乙醇中的溶解位點(diǎn),從而降低多酚的提取率[10]。因此,選擇乙醇濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間的影響

由圖2可知,青椒葉多酚的提取率隨著超聲時(shí)間的延長而逐漸增加,并在超聲時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到峰值。這是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長,震蕩和剪切作用使植物顆粒內(nèi)部的多酚類物質(zhì)逐漸釋放。但當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到40 min時(shí),多酚的提取率反而下降,這是由于大部分多酚類物質(zhì)已經(jīng)被釋放出來,進(jìn)一步延長超聲時(shí)間會(huì)促進(jìn)多酚類物質(zhì)氧化分解,損失提取效率[11]。因此,選擇超聲時(shí)間為40 min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

2.1.3 液料比的影響

由圖3可知,青椒葉多酚提取率隨著液料比的增加而逐漸增加,并在液料比為25∶1(mL∶g)時(shí)達(dá)到峰值。這是因?yàn)橐毫媳鹊脑黾訉⒓哟笕軇?duì)青椒葉顆粒中多酚類物質(zhì)的浸泡程度,從而增加了多酚與溶劑之間的濃度差。但當(dāng)液料比過大時(shí),雖然多酚類物質(zhì)更易溶于大量的溶劑中,但在后續(xù)的濃縮過程中會(huì)造成大量的多酚類物質(zhì)流失和損失[12-13],從而降低提取效率。因此,選擇液料比為25∶1(mL∶g)。

圖3 液料比對(duì)多酚提取率的影響

2.1.4 超聲溫度的影響

由圖4可知,青椒葉多酚提取率隨著超聲溫度的升高而逐漸增加,并在超聲溫度為70 ℃時(shí)達(dá)到峰值。這是因?yàn)樘崛◇w系溫度的升高會(huì)加速分子的熱運(yùn)動(dòng),有效促進(jìn)青椒葉顆粒中多酚類物質(zhì)向溶液中的傳質(zhì)和擴(kuò)散,從而提高了多酚的溶解度和提取效率。但當(dāng)超聲溫度過高時(shí),部分多酚類物質(zhì)會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng),破壞其結(jié)構(gòu)和活性,降低了提取率[14]。因此,選擇超聲溫度為75 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及分析

該研究采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,進(jìn)行青椒葉多酚提取率的研究。共進(jìn)行了29組試驗(yàn),得到其多酚提取率數(shù)據(jù)見表2。隨后,利用Design Expert 8.05b軟件對(duì)這29組數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到方差分析結(jié)果如表3所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 方差分析

對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到適合該研究的青椒葉多酚提取率(Y)作為響應(yīng)值,以及乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)4個(gè)因素作為自變量的四元二次回歸模型:

Y=67.57+1.25A+0.47B-0.37C+2.19D+0.61AB+1.26AC+0.05AD+2.02BC+4.05BD-0.45CD-7.07A2-8.65B2-7.98C2-11.63D2.

根據(jù)表3的方差分析結(jié)果,該四元二次回歸模型具有極顯著的水平,表明該模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測不同處理?xiàng)l件下的多酚提取率。同時(shí),相關(guān)系數(shù)R2為0.906 7,說明該模型的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之間具有高度的相關(guān)性,約90.67%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠被該模型成功解釋和預(yù)測。此外,失擬項(xiàng)F=5.28,P=0.061 4>0.05,說明該模型中隨機(jī)誤差較小,即響應(yīng)面模型能夠很好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。通過F及P值得出影響不顯著的因素為一次項(xiàng)A、B、C和交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、CD;影響顯著為超聲溫度的一次項(xiàng)D和超聲時(shí)間和超聲溫度的交互項(xiàng)BD;影響極顯著為二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2,說明青椒葉多酚提取率受多個(gè)工藝因素的非線性影響,需要考慮相互作用。超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響最大,其次是乙醇濃度、液料比和超聲時(shí)間。因此,在優(yōu)化青椒葉多酚提取工藝時(shí),需要重點(diǎn)控制超聲溫度。綜上所述,該研究的回歸模型準(zhǔn)確性和可信度高,可用于青椒葉多酚的提取分析和預(yù)測。通過對(duì)該回歸模型進(jìn)行擬合和優(yōu)化,可以找到最佳的處理方案,以達(dá)到高效、經(jīng)濟(jì)地提取青椒葉多酚的目標(biāo)。

響應(yīng)面分析用于研究多個(gè)因素對(duì)某個(gè)響應(yīng)變量的影響[15],在該研究中,考察了乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度4個(gè)因素對(duì)青椒葉多酚提取率的影響,并繪制了響應(yīng)面和等高線圖,以直觀地展示各因素之間的交互作用對(duì)青椒葉多酚提取率的顯著性程度。由圖5～10可以看出,響應(yīng)面曲線最陡的是超聲時(shí)間和超聲溫度,其等高線偏離圓形也最厲害,說明對(duì)青椒葉多酚提取率影響最顯著的是超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用;而響應(yīng)面曲線陡度次之的是超聲時(shí)間和液料比,其等高線偏離圓形的程度次之,說明超聲時(shí)間和液料比交互作用的顯著程度次之。同理可得,各因素交互作用影響的顯著性順序?yàn)锽D> BC> AC> AB> CD> AD。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于優(yōu)化青椒葉多酚提取過程具有重要意義,可為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供有力的支持。

圖5 乙醇濃度和超聲時(shí)間交互作用對(duì)多酚提取率的影響

圖6 乙醇濃度和液料比交互作用對(duì)多酚提取率的影響

圖7 乙醇濃度和超聲溫度交互作用對(duì)多酚提取率的影響

圖9 超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用對(duì)多酚提取率的影響

2.2.2 最優(yōu)條件驗(yàn)證

經(jīng)過回歸方程計(jì)算,提取青椒葉多酚的最佳工藝為乙醇濃度70.89%,超聲時(shí)間40.53 min,液料比24.94∶1(mL∶g),提取溫度70.52 ℃。在此工藝條件下,青椒葉多酚提取率預(yù)測值可達(dá)到67.76 mg/g。為了驗(yàn)證模型預(yù)測的可靠性,根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的便利性,將各因素工藝條件修正為乙醇濃度71%,超聲時(shí)間41 min、液料比25∶1 (mL∶g)和提取溫度71 ℃,并進(jìn)行3次試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,青椒葉多酚的提取率平均值為67.62 mg/g。與模型預(yù)測值相比,其相對(duì)誤差僅為0.21%,證明基于響應(yīng)面分析方法優(yōu)化青椒葉多酚提取工藝的有效性和可行性[16]。這一研究成果為青椒葉多酚的提取和開發(fā)提供了新的思路和方向,具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

2.3 青椒葉多酚的抗氧化能力

2.3.1 多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果

青椒葉多酚和抗壞血酸的抗氧化能力可以通過對(duì)DPPH自由基的清除率來進(jìn)行評(píng)估[17](圖11)。結(jié)果表明,隨著青椒葉多酚和抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加,對(duì)DPPH自由基的清除率也逐步升高。尤其是在青椒葉多酚質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí),其清除率可達(dá)到78.21%,顯示出其強(qiáng)大的DPPH自由基清除能力。此外,青椒葉多酚和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除率的半抑制質(zhì)量濃度(IC50)分別為56.34和46.79 mg/L,說明青椒葉多酚能夠有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性與多酚濃度呈正相關(guān)。

圖11 抗壞血酸和多酚對(duì)DPPH自由基的清除效果

2.3.2 多酚對(duì)OH自由基的清除效果

青椒葉多酚和抗壞血酸的抗氧化能力可以通過對(duì)OH自由基的清除率來進(jìn)行評(píng)估(圖12)。結(jié)果表明,隨著青椒葉多酚和抗壞血酸質(zhì)量濃度的增加,對(duì)OH自由基的清除率也逐步升高,尤其是青椒葉多酚質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí),其清除率可達(dá)到80.41%,顯示出其強(qiáng)大的OH自由基清除能力。此外,青椒葉多酚和抗壞血酸對(duì)OH自由基清除率的IC50分別為125.20和96.14 mg/L,說明青椒葉多酚能夠有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性與多酚濃度呈正相關(guān)。

圖12 抗壞血酸和多酚對(duì)OH自由基的清除效果

以上試驗(yàn)結(jié)果為青椒葉多酚的抗氧化能力提供了可靠的科學(xué)依據(jù),為其在保健品和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。

3 結(jié)論

該研究使用超聲波輔助法提取青椒葉多酚,通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析,建立了多酚提取率和考察工藝之間的回歸模型。最終,優(yōu)化得出了提取多酚的最佳工藝條件為:乙醇濃度71%、超聲時(shí)間41 min、液料比25∶1(mg∶L)和提取溫度71 ℃,并進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn),青椒葉多酚的提取率平均值為67.62 mg/g。與模型預(yù)測值相比,其相對(duì)誤差僅為0.21%,基于響應(yīng)面分析方法,成功地優(yōu)化了青椒葉多酚的提取工藝,并證明了該方程的有效性和可行性。青椒葉多酚能夠有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性與多酚濃度呈正相關(guān),青椒葉多酚和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基清除率的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為56.34和46.79 mg/L,對(duì)OH自由基清除率的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為125.20和96.14 mg/L,該研究為青椒葉多酚的抗氧化能力提供了可靠的科學(xué)依據(jù),為其在保健品和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。