微生物菌劑處理增加了生姜土壤中有益微生物的相對(duì)豐度

張大琪　任立瑞　杜洪志等

關(guān)鍵詞 哈茨木霉； 淡紫擬青霉； 枯草芽胞桿菌； 土壤微生物； 宏基因組學(xué)； 有益菌

中圖分類(lèi)號(hào)： Ｓ１４４．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２２３

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展改變了作物的種植方式，許多高附加值作物的種植規(guī)模也逐漸擴(kuò)大，作物連作的種植模式可提高農(nóng)戶(hù)的經(jīng)濟(jì)收入，但高附加值作物的連年種植會(huì)產(chǎn)生一系列問(wèn)題，如土壤酸化、土壤微生物功能結(jié)構(gòu)劣變等［１］。此外，長(zhǎng)期在同一塊土地種植同一種作物也加劇了土傳病害的發(fā)生和發(fā)展，易造成高附加值作物減產(chǎn)甚至絕收［２］。生姜作為高附加值經(jīng)濟(jì)作物在中國(guó)廣泛種植，２０２０年中國(guó)生姜種植面積達(dá)５９７５２ｈｍ，全國(guó)生姜產(chǎn)量約為６４１２萬(wàn)ｔ［３］。生姜連作的種植模式在中國(guó)較為常見(jiàn)。生姜種植過(guò)程中常遭遇土傳病害的侵染，其中由青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum引起的姜瘟病可導(dǎo)致生姜當(dāng)茬絕收，并且其危害可延續(xù)多年，生姜姜瘟病已經(jīng)成為限制生姜發(fā)展的瓶頸［４］。另外，一些病原真菌導(dǎo)致的生姜病害也正阻礙著生姜的健康生長(zhǎng)，其中較為嚴(yán)重的是生姜莖基腐病，又稱(chēng)爛脖子病，其主要致病菌為尖鐮孢Fusarium oxys-porum［５］。

土壤是作物生長(zhǎng)、獲取營(yíng)養(yǎng)元素的大本營(yíng)，微生物是土壤中最龐大的群體之一，直接或間接參與土壤介質(zhì)中的一切活動(dòng)。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性是評(píng)價(jià)土壤健康的指標(biāo)之一。土壤中有益微生物數(shù)量較多時(shí)，土壤質(zhì)量就會(huì)變優(yōu)，而大量致病菌占據(jù)土壤空間時(shí)，土壤就會(huì)成為“病土”。因此如何長(zhǎng)久有效地調(diào)節(jié)土壤中有益微生物的數(shù)量也成了當(dāng)今農(nóng)業(yè)科研領(lǐng)域亟須解決的問(wèn)題。

微生物菌劑是將有益的活性菌經(jīng)過(guò)特殊的加工工藝制成便于使用的生物制劑或活菌制劑［６］。目前微生物菌劑主要有細(xì)菌類(lèi)菌劑（芽胞桿菌、假單胞菌、根瘤菌）、真菌類(lèi)菌劑（木霉、淡紫擬青霉、菌根真菌）和病毒類(lèi)菌劑（核型多角體病毒）。研究表明，微生物菌劑能夠增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量［７］，提高作物對(duì)礦物元素的吸收，抑制病原菌的發(fā)生，增強(qiáng)作物對(duì)病害的抵抗力并提高作物的產(chǎn)量［８９］。劉麗英等［１０］的研究表明，經(jīng)枯草芽胞桿菌ＳＮＢ-８６菌劑處理的土壤種植平邑甜茶幼苗，土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量顯著增加，真菌的數(shù)量降低，并且促進(jìn)了幼苗的生長(zhǎng)。Ｓｈｅｎ等［１１］研究表明，生物菌劑可降低香蕉枯萎病的發(fā)病率。張蕾等［１２］研究表明，土壤調(diào)理劑配施微生物菌劑（成分：枯草芽胞桿菌、側(cè)孢短芽胞桿菌、植物乳酸菌等高活性有益菌群）處理黃瓜土壤后顯著改善了土壤理化性質(zhì)，降低了土壤表層的鹽分含量，增加了土壤中有益菌群的含量，并促進(jìn)了黃瓜的生長(zhǎng)。工業(yè)和信息化部在２０１５年頒布的《關(guān)于推進(jìn)化肥行業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展的指導(dǎo)意見(jiàn)》中提出力爭(zhēng)在２０２０年將我國(guó)新型肥料的使用量提升至化肥總體用量的３０％［１３］。其中微生物菌劑作為新型肥料的主要產(chǎn)品之一，其研發(fā)力度和使用量不斷加大，具有較大的發(fā)展?jié)摿涂臻g，已成為國(guó)內(nèi)外的研發(fā)熱點(diǎn)。目前，關(guān)于微生物菌劑的研究多集中在設(shè)施蔬菜中，對(duì)于高附加值經(jīng)濟(jì)作物特別是根莖類(lèi)經(jīng)濟(jì)作物的研究較少。

本試驗(yàn)在生姜連作地塊中澆灌富含哈茨木霉Trucgiderna garzianumＴＨ７、淡紫擬青霉Pur-pureocillium lilacinum ＰＬ２２以及高效枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的微生物菌劑（商品名：綠地成金），并通過(guò)微生物分離培養(yǎng)和宏基因組測(cè)序技術(shù)探究微生物菌劑處理對(duì)生姜土壤中細(xì)菌和真菌群落組成的影響。哈茨木霉屬于木霉屬Trichoderma spp.，木霉屬是植物內(nèi)生生防菌，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖快［１４］。常見(jiàn)的木霉有綠色木霉Trichoderma viride、康寧木霉T.koningii、棘孢木霉T.asperel-lum、深綠木霉T.atrpvorode、哈茨木霉、長(zhǎng)枝木霉T.longibrachiatum等。其中哈茨木霉是木霉屬中重要的生防菌資源，其對(duì)植物寄生根結(jié)線蟲(chóng)有較好的防治效果［１５］。馬金慧等［１６］發(fā)現(xiàn)哈茨木霉ＴＲＩ２的４８ｈ發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogyne spp.防治效果為１００％。淡紫擬青霉是植物寄生線蟲(chóng)的天敵，廣泛應(yīng)用于防治根結(jié)線蟲(chóng)、孢囊線蟲(chóng)Heterodera spp.、馬鈴薯白線蟲(chóng)Globodera pullida等重要植物病原線蟲(chóng)［１７１８］。將淡紫擬青霉與雞糞聯(lián)合使用對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果可達(dá)到７８．３％［１９］。枯草芽胞桿菌是一類(lèi)好氧桿狀細(xì)菌，能夠分泌多種酶?？莶菅堪麠U菌在植物根際定殖，可有效防治由尖鐮孢、黃枝孢Clados porium fulvum等病原真菌引起的番茄葉霉病、黃瓜枯萎病等病害［２０］。本試驗(yàn)擬為擴(kuò)大微生物菌劑的使用范圍及田間應(yīng)用價(jià)值提供有效的理論基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)設(shè)計(jì)

大田試驗(yàn)于２０２１年４月－６月在山東省安丘市臨浯鎮(zhèn)的一塊生姜田中進(jìn)行（３６°１２′Ｎ，１１９°１６′Ｅ）。試驗(yàn)地土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷和有效鉀含量分別為０．９６、２５．６９、１１９．９２ｍｇ／ｋｇ和１９０．８３ｍｇ／ｋｇ，有機(jī)質(zhì)含量１３．２３ｇ／ｋｇ，ｐＨ （土∶水＝１∶２．５）６．８３，電導(dǎo)率２３５．００μｓ／ｃｍ。該地塊有１０年以上的生姜種植歷史。試驗(yàn)選用的生物菌劑（綠地成金）有效活菌數(shù)＞５億ｃｆｕ／ｇ，富含哈茨木霉Trichoderma har-zianum TH7、淡紫擬青霉Pur pureocillium lilaci-num PL22以及高效枯草芽胞桿菌Bacillus subti-lis，由慕恩（廣州）生物科技有限公司提供。根據(jù)微生物菌劑的使用說(shuō)明，在生姜播種、大培土、小培土、苗期進(jìn)行微生物菌劑兌水（稀釋?zhuān)担氨叮补嗵幚?，試?yàn)小區(qū)用水量為７００ｍＬ／ｍ（記為ｍｉｃｒｏｂｉａｌａｇｅｎｔ，ＭＡ）。并設(shè)置未經(jīng)微生物菌劑處理小區(qū)為對(duì)照組（記為ｃｏｎｔｒｏｌ），每處理設(shè)置３個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)小區(qū)長(zhǎng)為３０ｍ，寬為１．５ｍ，處理組和對(duì)照組之間設(shè)有０．５ｍ的緩沖帶。

１．２土樣采集與指標(biāo)測(cè)試

生姜成熟期（最后１次菌劑處理后９０ｄ），在田間每個(gè)處理小區(qū)中間部位隨機(jī)采集３份５～２０ｃｍ土層土壤樣本２００ｇ置于自封袋內(nèi)，立即送往實(shí)驗(yàn)室。同一小區(qū)的土壤樣品充分混勻后，均分為２份。一份土樣在４℃下保存，用于后續(xù)微生物分離試驗(yàn)。另一份土樣保存于－８０℃冰箱，用于測(cè)定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

１．２．１土壤中細(xì)菌和真菌分離

采用稀釋涂布法分離土壤中的細(xì)菌和真菌。稱(chēng)取３ｇ土于滅菌的５０ｍＬ離心管中并加入２７ｍＬ無(wú)菌生理鹽水，得到稀釋?zhuān)保氨兜耐寥缿腋∫?。梯度稀釋土壤懸浮液，分離真菌的土壤懸浮液濃度為１０－２～１０，分離細(xì)菌的土壤懸浮液濃度為１０～１０。

分別吸?。保担唉蹋掏寥缿腋∫杭尤朊霞永t瓊脂培養(yǎng)基（ＲＢＭ）［２１］、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（ＰＤＡ）、氯硝胺１８％甘油瓊脂培養(yǎng)基（ＤＧ１８）［２２］等真菌分離培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（ＴＳＡ）、Ｒ２Ａ［２３］、ＰＳ［２４］等細(xì)菌分離培養(yǎng)基中，用滅菌玻璃珠搖晃平板將其涂抹均勻，用封口膜密封培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基表面干燥后，將其倒置于２５℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待有菌落產(chǎn)生，按照菌落形態(tài)和顏色特征歸類(lèi)，并記錄培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量，用于分離頻率的計(jì)算。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行分離純化鑒定。細(xì)菌菌株采用１６ＳｒＤＮＡ序列，真菌菌株采用ＩＴＳ序列進(jìn)行分子鑒定。

１．２．２宏基因組學(xué)測(cè)序技術(shù)分析土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)組成

?。埃玻担缭冢福啊姹４娴耐寥罉悠酚冢停泄苤校冢停袆驖{儀（ＦａｓｔＰｒｅｐ-２４５Ｇ，ＵＳＡ）中均漿，利用ＦａｓｔＤＮＡ-ＳｐｉｎＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）提取土壤基因組總ＤＮＡ，使用０．８％瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測(cè)ＤＮＡ 濃度及純度。將ＤＮＡ 樣品送至北京諾禾致源生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌１６ＳｒＤ-ＮＡ 的Ｖ５-Ｖ７區(qū)（引物為７９９Ｆ：５′-ＡＡＣＭＧＧＡＴＴ-ＡＧＡＴＡＣＣＣＫＧ-３′ 和１１９３Ｒ：５′ＡＣＧＴＣＡＴＣ-ＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣ-３′）和真菌ＩＴＳｒＤＮＡ 的Ｉ區(qū)（引物為ＩＴＳ１Ｆ：５′-ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ-３′和ＩＴＳ１Ｒ：５′-ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ-３′）的ＰＣＲ 擴(kuò)增及文庫(kù)構(gòu)建，最后利用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行ＰＥ２５０測(cè)序。采用豐富度指數(shù)（Ｃｈａｏｉｎｄｅｘ）［２５］、Ｓｈａｎｎｏｎ 多樣性指數(shù)［２５］和系統(tǒng)發(fā)育多樣性［２６］評(píng)價(jià)土壤中細(xì)菌群落的多樣性。

１．３數(shù)據(jù)分析

微生物總菌落數(shù)＝培養(yǎng)皿中微生物菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)；

采用ＳＰＳＳ１９．０（ＩＢＭ，ＵＳＡ）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)微生物菌劑處理組和對(duì)照組中土壤細(xì)菌和真菌平均菌落數(shù)、相對(duì)豐度等數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）和最小顯著性差異法（ＬＳＤ）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α＝０．０５）。采用Ｏｒｉｇｉｎ２０１８和Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔｗｏｒｄ２００３分別繪制圖表。

２結(jié)果與分析

２．１稀釋涂布法培養(yǎng)土壤中細(xì)菌和真菌

采用稀釋涂布平板法在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細(xì)菌和真菌的菌落情況見(jiàn)圖１。由表１可知微生物菌劑處理后的土壤中細(xì)菌和真菌的平均菌落形成單位均顯著低于對(duì)照組。與對(duì)照相比，微生物菌劑處理土壤中真菌和細(xì)菌的平均菌落形成單位分別減少了３６．１１％和５０．００％。

２．２菌株鑒定

２．２．１細(xì)菌和真菌物種的鑒定

基于細(xì)菌和真菌的分離培養(yǎng)，從對(duì)照組土壤中成功鑒定２１株細(xì)菌菌株和３３株真菌菌株，從微生物菌劑處理土壤中成功鑒定４２株細(xì)菌菌株和２４株真菌菌株。物種分布見(jiàn)表２。

在屬水平上，對(duì)照組土壤中分離頻率最高的細(xì)菌屬為假單胞菌屬Pseudomonas，菌落形成單位為３×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為９．８３％。其次為壤霉菌屬Agromyces、北里胞菌屬Kitasatospora、污泥單胞菌屬Pelomonas、Piscinibacter，分離頻率均為３．９２％（圖２ａ）。對(duì)照組土壤中分離頻率最高的真菌屬為Gibellulopsis，菌落形成單位為２×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為２４．４２％。其次為絲胞菌屬Scedosporium、微結(jié)節(jié)菌屬M(fèi)icrodochium、Musidium、Linneman-nia，分離頻率分別為：１３．３２％、７．６６％、７．２５％、４．６６％（圖３ａ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率最高的細(xì)菌屬為根瘤菌屬Rhizobium，菌落形成單位為４×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１７．３４％。其次為假單胞菌屬、柄桿菌屬Caulobacter、污物假節(jié)桿菌屬Pseudarthrobacter、雷夫松氏菌屬Leifsonia，分離頻率分別為：１０．８４％、８．６７％、５．１３％、４．３４％ （圖２ｂ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率最高的真菌屬為Musidium，菌落形成單位為５×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１３．９１％。其次為Gibellulopsis、小不整球殼屬Plectosphaerella、被孢霉屬M(fèi)ortierella、Lep-tobacillium、Parasarocladium，分離頻率分別為：１２．９７％、１０．３８％、９．５２％、９．４３％、９．４３％（圖３ｂ）。

在種水平上，對(duì)照組土壤中分離頻率較高的細(xì)菌種為油菜假單胞菌屬Pseudomonas brassi-cacearum，菌落形成單位為１×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１７．４４％。其次為莫爾氏假單胞菌Pseudomonas umsongensis、Pseudomonas kilonensis、Streptomyces panaciradicis、杰氏假單胞菌Pseudomonas jessenii，分離頻率分別為：５．４９％、３．４９％、３．４９％、３．０５％ （圖４ａ）。對(duì)照組土壤中分離頻率較高的真菌種為變黑輪枝菌Gibellulopsis nigrescens，菌落形成單位為２×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１７．８６％。其次為Penicillium me-nonorum、尖端賽多孢子菌Scedosporium apiosper-mum、Scedosporium dehoogii、Linnemannia elongata分離頻率分別為：９．７４％、９．７４％、９．７４％、６．４９％（圖５ａ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率較高的細(xì)菌種是溫哥華假單胞菌Pseudomonas vancouverensis，菌落形成單位為４×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１１．６１％，其次為斯凱爾涅維采根瘤菌Rhizobium skierniewi-cense、米氏假單胞菌Pseudomonas migulae、惰性柄桿菌Caulobacter segnis、莫爾氏假單胞菌P.um-songensis，分離頻率分別為：１０．７２％、５．５８％、５．３６％、３．８３％（圖４ｂ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率較高的真菌種為Musidium stromaticum，菌落形成單位為５×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１２．１４％，其次為變黑輪枝菌Gibellulopsis nigrescens、Plecto-sphaerella oligotrophica、高山被孢霉Mortierella alpina、Leptobacillium symbioticum，分離頻率分別為：１１．３１％、９．４６％、８．３０％、８．２３％（圖５ｂ）。

２．２．２有益物種和有害物種的分離、鑒定

在屬水平上，對(duì)照組土壤中分離、純化出５個(gè)有益細(xì)菌屬，１４個(gè)種，其中包含芽胞桿菌屬Bacillus７個(gè)種，間皮芽胞桿菌屬M(fèi)esobacillus １個(gè)種，新桿菌屬Neobacillus ２個(gè)種，類(lèi)芽胞桿菌屬Paenibacillus ３個(gè)種，嗜冷芽胞桿菌屬Psychrobacillus １個(gè)種（表３）。在這些種中，東洋芽胞桿菌Bacillus toyonensis和解木聚糖類(lèi)芽胞桿菌Paenibacillus xylanilyticus具有較高的分離頻率（均為１．７４％）和菌落形成單位（均為１．４×１０ｃｆｕ／ｇ）。微生物菌劑處理土壤中共分離、純化出７個(gè)有益細(xì)菌屬，２１個(gè)種，其中包含芽胞桿菌屬Bacillus８?jìng)€(gè)種，銹色房屋芽胞桿菌屬Domibacillus１個(gè)種，間皮芽胞桿菌屬M(fèi)esobacillus１個(gè)種，新桿菌屬Neobacillus３個(gè)種，類(lèi)芽胞桿菌屬Paenibacillus６個(gè)種，嗜冷芽胞桿菌屬Psychrobacillus１個(gè)種，水原拉梅爾芽胞桿菌屬Rummeliibacillus１個(gè)種（表４）。在這些種中，阿氏芽胞桿菌Bacillus ary-abhattai具有較高的分離頻率和菌落形成單位，分別為２．０１％和７．９×１０ｃｆｕ／ｇ。

對(duì)于有害物種，本試驗(yàn)僅從對(duì)照處理土壤中分離出導(dǎo)致生姜莖基腐病的病原菌尖鐮孢Fusarium oxysporum和腐皮鐮孢Fusarium solani，純化株數(shù)均為２株，分離頻率分別為０．８１％和０．４９％。

２．３宏基因組測(cè)序分析微生物菌劑對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)多樣性的影響

由表５可知，微生物處理后，土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度指數(shù)（Ｃｈａｏ指數(shù)）、真菌Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)和真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性均低于對(duì)照處理，其中真菌Ｃｈａｏ指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性達(dá)到顯著水平。這表明，微生物菌劑處理降低了土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。并且微生物菌劑處理土壤中細(xì)菌的多樣性指數(shù)均高于真菌的多樣性指數(shù)，這表明，微生物菌劑對(duì)土壤中真菌多樣性的影響大于對(duì)細(xì)菌多樣性的影響。

微生物菌劑和對(duì)照處理土壤中細(xì)菌屬數(shù)量（６７８／６４５）大于真菌屬數(shù)量（７２／１０１）。微生物菌劑處理土壤中特有細(xì)菌和真菌屬數(shù)量分別為２０３個(gè)和２０個(gè)，與對(duì)照相比，細(xì)菌特有屬增加了１９．４１％，而真菌特有屬減少了５９．１８％。

對(duì)照處理和微生物菌劑處理土壤中細(xì)菌和真菌屬水平相對(duì)豐度結(jié)果見(jiàn)圖６。與對(duì)照處理相比，微生物菌劑處理顯著增加了根瘤菌屬、柄桿菌屬Caulobucter、污物假節(jié)桿菌屬Pseudarthrobacter、芽胞桿菌屬、雷夫松氏菌屬、紅細(xì)菌屬Rhodanobacter、農(nóng)桿菌屬Agrobacterium等細(xì)菌屬的相對(duì)豐度，另外，假單胞菌屬、Bosea、Massilia、中間根瘤菌屬M(fèi)eso-rhizobium等細(xì)菌屬的相對(duì)豐度也有所增加，微生物菌劑處理減少了Kitasatospora的相對(duì)豐度（圖６ａ）。與對(duì)照相比，微生物菌劑處理顯著增加了Musidium、被孢霉屬、Parasarocladium、albifimbria和枝孢屬Cladosporium等真菌屬的相對(duì)豐度，減少了Gibellulopsis、微結(jié)節(jié)菌屬M(fèi)icrodochium等屬的相對(duì)豐度（圖６ｂ）。

３討論

土壤微生物是土壤重要組成成分，是土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類(lèi)等的總稱(chēng)，承擔(dān)著土壤中物質(zhì)運(yùn)輸與能量傳遞的功能，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)具有重要的意義。有些土壤微生物可參與碳、氮循環(huán)，增加土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，并為植物提供可吸收利用的氮化合物；有些土壤微生物可通過(guò)寄生或分泌抗生素等物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)［２７］，通常這種微生物可被加工成微生物菌劑在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用。土壤微生物功能的失衡是導(dǎo)致健康土壤成為“病土”的原因之一，病土的特征主要表現(xiàn)在有益微生物數(shù)量下降，有害病原菌大量積累，土壤由“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀保郏玻福玻梗荨Ｎ⑸锞鷦┌罅坑幸嫖⑸?，采用微生物菌劑處理土壤是直接向土壤中補(bǔ)充有益微生物，搶占土壤空間，抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而達(dá)到控制病害的目的［３０］?？莶菅堪麠U菌可通過(guò)與植物根系中的鐵載體結(jié)合搶占在根系的定殖位點(diǎn)，抑制病原菌在根際的定殖［２０］。木霉可通過(guò)分泌多種細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶等對(duì)病原菌產(chǎn)生拮抗作用［３１］。淡紫擬青霉可通過(guò)寄生作用防治禾谷孢囊線蟲(chóng)Heterodera avenae［３２］。

本試驗(yàn)采用微生物菌劑對(duì)大田生姜進(jìn)行澆灌處理，采集最后一次微生物菌劑處理后９０ｄ的土壤樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，微生物菌劑對(duì)土壤中的細(xì)菌和真菌數(shù)量具有一定的抑制作用。Ｓｈｅｎ等［１１］在氨熏蒸的土壤中澆灌生物菌肥發(fā)現(xiàn)土壤中的細(xì)菌和真菌的多樣性在９０ｄ后仍低于未澆灌生物菌肥處理，本研究的結(jié)果與此一致。在屬、種水平上，與對(duì)照相比，微生物菌劑處理土壤中分離、純化的細(xì)菌物種數(shù)量較高，而真菌物種數(shù)量較低。微生物菌劑處理土壤分離頻率較高的屬是根瘤菌屬Rhizobium，根瘤菌具有很強(qiáng)的固氮作用，可在生姜生長(zhǎng)過(guò)程中提高生姜對(duì)氮素的吸收和利用。微生物菌劑處理土壤中假單胞菌屬的分離頻率為１０．８４％。路兆軍等［３３］研究表明，分離自蘋(píng)果樹(shù)根際的假單胞菌ＰＬ-２１對(duì)蘋(píng)果褐斑病菌Murssonina coronarias、蘋(píng)果圓斑病菌Phyllositic solitaria有較好的防治作用。婁海博等［３４］發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌PseudomonasＳＮ１５-２對(duì)番茄青枯病的防效效果為４６．６％。

有益微生物的分離結(jié)果顯示，微生物菌劑能夠提高土壤中有益微生物的數(shù)量。對(duì)照土壤中分離、純化出１４種有益微生物，而微生物菌劑處理土壤中分離、純化出２１種有益微生物。其中分離、純化較多的屬為芽胞桿菌屬。目前，芽胞桿菌屬已開(kāi)發(fā)成為成熟的微生物制劑。Ｈｕａｎｇ等［３５］研究表明芽胞桿菌屬可抑制草莓枯萎病的發(fā)生。

宏基因組測(cè)序結(jié)果表明，微生物菌劑處理降低了土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度指數(shù)Ｃｈａｏ指數(shù)、真菌Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)，說(shuō)明此微生物菌劑對(duì)土壤中細(xì)菌和真菌具有抑制作用，這與稀釋涂布平板法得到的結(jié)果相一致。物種屬水平相對(duì)豐度結(jié)果顯示，微生物菌劑增加了根瘤菌屬、芽胞桿菌屬等細(xì)菌屬的相對(duì)豐度，以及小不整球殼屬、Musidium、被孢霉屬等真菌屬的相對(duì)豐度。根瘤菌屬、芽胞桿菌屬中的某些種已被證明是有益的土壤細(xì)菌微生物。小不整球殼屬是植物內(nèi)生真菌，具有分解纖維素的能力［３６３７］。Musidium屬于子囊菌門(mén)，子囊菌在植物根部形成菌根，提高植物吸收養(yǎng)分的能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)［３８］。被孢霉屬屬于接合菌門(mén)，某些特定的被孢霉屬菌株具有促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的作用，例如被孢霉Mortierella sp.具有在不同土壤中分泌有機(jī)酸溶解土壤磷的能力［３９］，另外被孢霉與從枝菌根真菌聯(lián)合使用能提高土壤中磷酸酶活性，有利于植物生長(zhǎng)［４０］。將被孢霉添加到果園土壤中，土壤中有效磷、速效鉀以及鈣、鎂、硼等的含量顯著增加［４１］。

另外，在本試驗(yàn)中，我們注意到微生物菌劑處理后９０ｄ的土壤樣本中分離頻率較高的屬為芽胞桿菌屬。多項(xiàng)土壤微生物多樣性研究結(jié)果表明，芽胞桿菌屬在土壤中具有較高的相對(duì)豐度［４２４３］。微生物菌劑施入土壤中后，由于純化的有益微生物的數(shù)量龐大，可快速搶占土壤空間，在一定程度上抑制其他微生物（包括病原菌）的生長(zhǎng)。隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤中的非致病土著微生物（包括有益菌）的數(shù)量會(huì)得到恢復(fù)，但病原菌在有益微生物搶占定殖位點(diǎn)、寄生、重拮抗等的作用機(jī)制下以及非致病微生物搶占土壤空間的作用下，數(shù)量難以快速恢復(fù)，從而達(dá)到控制病害的目的。但微生物菌劑貨架期短、土壤環(huán)境條件不同等因素可能導(dǎo)致微生物菌劑不能很好地適應(yīng)土壤環(huán)境，難以快速繁殖，在生態(tài)位的競(jìng)爭(zhēng)中難與土著微生物抗衡［４４］，這可能是導(dǎo)致微生物菌劑在使用后期不再是優(yōu)勢(shì)物種的原因之一。

雖然微生物菌劑具有較好的應(yīng)用效果，但微生物菌劑在使用中仍然面臨諸多挑戰(zhàn)：１）微生物菌劑的活性低及貨架期短：與化學(xué)農(nóng)藥相比，微生物菌劑在加工成各種劑型及長(zhǎng)時(shí)間保存的過(guò)程中其活性會(huì)受到影響，導(dǎo)致微生物菌劑的持效期變短。Ｗｕ等［４３］比較了土壤中分離、純化的哈茨木霉菌株Ｔ２６７與哈茨木霉制劑在土壤中的活性，并對(duì)處理后６周的土壤中的哈茨木霉菌株進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明Ｔ２６７在土壤中的基因拷貝數(shù)顯著高于制劑的基因拷貝數(shù)。２）施藥次數(shù)多：田間土壤環(huán)境復(fù)雜，微生物菌劑并不能完全適應(yīng)土壤環(huán)境并快速、長(zhǎng)期定殖，在作物生長(zhǎng)過(guò)程中，至少需要４～５次的灌根處理。因此未來(lái)微生物菌劑應(yīng)加大對(duì)高效、實(shí)用、適應(yīng)性強(qiáng)的功能菌株的開(kāi)發(fā)、利用，減少施藥次數(shù)，提高微生物菌劑的認(rèn)可度。另一方面，對(duì)現(xiàn)有的微生物菌劑有必要結(jié)合基因工程改造技術(shù)，培育出能適應(yīng)多種大田環(huán)境的高效菌株。

４結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，微生物菌劑處理雖然降低了土壤中細(xì)菌和真菌物種的菌落數(shù)以及細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度指數(shù)（Ｃｈａｏ指數(shù)）、真菌Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)，但提高了土壤中根瘤菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬等細(xì)菌屬及小不整球殼屬、Musidium、被孢霉屬等真菌屬的相對(duì)豐度，并且與對(duì)照相比這些屬的分離頻率較高。綜上，微生物菌劑（綠地成金）處理土壤后能夠改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加與有益菌相關(guān)的屬或種的相對(duì)豐度。