植物中角鯊烯環(huán)氧酶的研究進(jìn)展

宓雅琪,高龍龍,2,宋澤,高海云,趙歡△（.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京 00069;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 009;.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究所,江西 德興 4200）

1 引言

角鯊烯環(huán)氧酶（[EC1.14.99.1]squalene epoxidase，SQE）屬于A類的黃素蛋白單加氧酶，廣泛存在于動物、真菌、植物等真核生物中，可催化角鯊烯的碳-碳雙鍵發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)，生成2,3-環(huán)氧角鯊烯（2,3-oxidosqualene，OS）。SQE發(fā)揮催化功能一般需要黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等輔因子的參與[1]，且依賴NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（NADPH-cytochrome P450 reducatse，CPR）[2]將環(huán)氧基團(tuán)引入到角鯊烯的碳-碳雙鍵中[3]，黃素被還原后NADP+立即釋放（見圖1）。SQE是甾醇和三萜生物合成中第一個引入氧的酶，是第一個需要外援電子輸入的酶，也是途徑中繼3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）之后第二個重要的限速酶。

諾貝爾獎獲得者Corey E.J在1966年首次發(fā)現(xiàn)OS是角鯊烯到羊毛甾醇轉(zhuǎn)化的必需中間體，推翻了此前“氧化和環(huán)化同步進(jìn)行不經(jīng)過中間體”的假說[4]。對催化這一氧化步驟的SQE最早的報(bào)道來自于哈佛大學(xué)的S Yamamoto[5]等研究者，早在1970年其將從兔肝臟中提取的微粒體與角鯊烯一起孵育，發(fā)現(xiàn)加熱處理后環(huán)氧角鯊烯環(huán)化酶的活性喪失，然而角鯊烯轉(zhuǎn)化為環(huán)氧角鯊烯的酶活力并沒有減弱。日本的T Ono[6-7]等研究者證實(shí)角鯊烯環(huán)氧酶系統(tǒng)包括兩個部分，即末端氧化酶SQE和黃素蛋白CPR，且首次從兔肝微粒體中純化得到SQE并確定了其在體外的活性測定方法。第一個SQE基因（ERG1）則由A Jandrositz[8]等人通過構(gòu)建酵母突變體庫克隆得到，隨后Landl[9]等人利用基因敲除技術(shù)獲得的erg1缺失的釀酒酵母突變株成為了后續(xù)驗(yàn)證異源SQE基因功能的主要表達(dá)系統(tǒng)之一。Nagumo[10]等人通過去除兔源SQE的N末端99個氨基酸后在大腸桿菌（Escherichia coli）中首次得到有活性的重組蛋白，值得注意的是動物中SQE需要S105 fraction激活。1992年就有了關(guān)于從豬肝中純化出來的SQE在pH7.4時(shí)能夠?qū)⒁话氲腛S轉(zhuǎn)化為2,3;22,23-雙環(huán)氧角鯊烯（2,3;22,23-dioxidosqualene，DOS）的報(bào)道[11]，多個物種體內(nèi)也檢測到了在氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclase，OSC）抑制劑下能夠同時(shí)積累OS和DOS。雖然同屬于單加氧酶系，但是與細(xì)胞色素P450單加氧酶不同的是，SQE依賴于FAD，無heme結(jié)構(gòu)域，不受P450抑制劑的調(diào)控。直到2002年Suzuki H[12]等人首次從植物中克隆到2個SQE基因，并在erg1缺失的酵母突變株K1N1中驗(yàn)證功能。由于SQE在不同物種中具有序列和功能的保守性，植物中SQE基因多年來受關(guān)注度低，導(dǎo)致其研究起步較晚，截至目前，雖然文獻(xiàn)報(bào)道了多個植物來源的SQE基因信息，但是明確功能的并不多（見表1），深入開展研究的更是少之又少。然而，SQE在抑制劑、拷貝數(shù)、表達(dá)量以及酶系統(tǒng)組成等諸多方面存在物種的差異，提示了SQE在植物甾醇和三萜等生物合成途徑中的重要作用有待深入挖掘，引發(fā)科研人員對植物SQE的關(guān)注和深入思考。本文對植物SQE基因的分子克隆、功能驗(yàn)證、基因表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行綜述，并提出未來研究的新思路，為其進(jìn)一步的研究和開發(fā)利用提供依據(jù)。

表1 不同物種來源的SQE基因信息匯總表

2 SQE基因的克隆、鑒定與活性驗(yàn)證

2.1 植物中SQE基因克隆研究 基于酵母和哺乳動物SQE基因序列相似性，使得植物SQE基因變得相對容易。如1994年，擬南芥中的一段表達(dá)序列標(biāo)簽[13]被發(fā)現(xiàn)為ERG1同源序列，隨后被命名為Sqp2；Ar.tha。1999年Sch?fer[14]等人用Sqp2；Ar.tha為分子探針，在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)了兩條SQE基因。此后，包括擬南芥及多種藥用植物中的SQE基因[12,15-18]陸續(xù)得以克隆，為后續(xù)的功能驗(yàn)證等研究奠定了基礎(chǔ)（見表1）。

2.2 SQE基因的功能驗(yàn)證研究 植物SQE基因功能研究始于蒺藜苜蓿，2個MtSQEs可以回補(bǔ)酵母K1N1中erg1的缺失，但N末端是否截?cái)嗖挥绊懫浠钚訹12]。研究人員曾在大腸桿菌中表達(dá)不同植物SQE，多數(shù)表達(dá)為包涵體形式[22,27,29,39]，僅有絞股藍(lán)來源的SQE純化后可在體外復(fù)性[22]。Manzoor[21]等人成功在煙草中對甘草GgSQE1進(jìn)行瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)，驗(yàn)證其具有鯊烯環(huán)氧酶活性。Unland K[20]等人結(jié)合酵母回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、煙草中亞細(xì)胞定位以及橡膠草RNA干擾技術(shù)等手段較為系統(tǒng)地驗(yàn)證了橡膠草SQE的功能。

3 SQE基因的表達(dá)模式和蛋白定位研究

真菌和哺乳動物中SQE基因常為單拷貝，而植物中SQE基因往往有多個拷貝，且呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。例如，擬南芥[16]中AtSQE1和AtSQE3廣泛表達(dá)，而AtSQE2和AtSQE4只最低豐度地表達(dá)，甚至在葉和種子中都未能檢測到AtSQE2。人參[30]中PgSQE1幾乎在所有器官中都豐富地分布，而PgSQE2只在葉柄和花蕾中較高表達(dá)。催眠睡茄[39]、白樺[24]、甘藍(lán)型油菜[14,31,40]等物種的SQEs在葉子中表達(dá)水平最高，三七[17]、滇重樓[32]、雷公藤[27]、遠(yuǎn)志[33]等物種的SQEs在根中表達(dá)最高。黃芪[34]、澤瀉[35]、羅漢果[29]、橡膠草[20]等植物中SQE均表現(xiàn)出明顯的植物組織特異性。在植物生長發(fā)育的不同時(shí)期SQE基因亦表現(xiàn)出明顯的差異表達(dá)。擬南芥SQE1基因[14]在種子發(fā)育早期缺失，但在中后期可以檢測到；羅漢果中兩個SQE基因都主要在果實(shí)中積累，但SgSQE1快速增長并在第15天達(dá)到最高水平，SgSQE2則在此期間內(nèi)表達(dá)水平相對穩(wěn)定。以上研究提示我們，植物中多拷貝的SQE基因參與不同的生物合成途徑，很可能與特定的甾醇或三萜成分積累直接相關(guān)。

據(jù)報(bào)道，酵母SQE具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴的雙定位[41]。多種植物SQE的亞細(xì)胞定位顯示位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[1]，研究人員分別在橡膠草TkSQE1的N端或C端與藍(lán)色熒光蛋白Cerulean融合注射本氏煙草，觀察到TkSQE1-Cerulean（C端）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，而N端融合蛋白卻未觀察到熒光[20]，表明SQE與熒光蛋白在N端和C端融合方式可能影響蛋白的狀態(tài)。此外，紫花苜蓿MsSQE1在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，由于試驗(yàn)方法的局限不能觀察到細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，僅在細(xì)胞膜上觀察到微弱熒光[36]。

4 激發(fā)子對SQE基因表達(dá)的影響

植物免疫反應(yīng)激發(fā)子（elicitor）是一類可以誘導(dǎo)植物發(fā)生免疫防御反應(yīng)的化合物，按照來源可分為外源性激發(fā)子和內(nèi)源性激發(fā)子[42]。大量研究表明，激發(fā)子可以誘導(dǎo)SQE基因及三萜和甾醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)三萜和植物甾醇類活性產(chǎn)物的合成與積累（見表2）。

表2 影響植物SQE基因表達(dá)的激發(fā)子和轉(zhuǎn)錄因子匯總表

4.1 外源性激發(fā)子對SQE基因表達(dá)的影響 外源性激發(fā)子主要來源于對植物產(chǎn)生危害的微生物和昆蟲等[43]，目前用于誘導(dǎo)三萜及植物甾醇類產(chǎn)物合成的主要為真菌類激發(fā)子。研究表明，黑曲霉菌（Aspergillus niger）可顯著上調(diào)甘草[44]SQE基因的表達(dá)，與參與植物防御反應(yīng)的一氧化氮、水楊酸、茉莉酸等信號分子有關(guān)。黑曲霉菌與熱帶念珠菌（Candida tropicalis）單獨(dú)或混合使用[45]均可顯著上調(diào)西洋參不定根中SQE基因的表達(dá)，促進(jìn)人參皂苷的合成。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）可誘導(dǎo)西洋參[46]、滇重樓[47]中SQE基因的表達(dá)，促進(jìn)人參皂苷和重樓皂苷的合成。幾丁質(zhì)脫乙?；蟮臍ぞ厶强烧T導(dǎo)人參細(xì)胞的SQE基因表達(dá)[48]，通過激活MAPK通路增加人參皂苷的積累。此外，乙烯利、二環(huán)己基碳二亞胺和石決明可分別增強(qiáng)白樺[24]、人參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞[49]和高麗參[50]中SQE基因表達(dá)。

4.2 內(nèi)源性激發(fā)子對SQE基因表達(dá)的影響 內(nèi)源性激發(fā)子來源于植物自身，目前用于誘導(dǎo)三萜和植物甾醇類活性產(chǎn)物合成的主要為茉莉酸酯類成分，如茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和2-羥乙基-茉莉酸酯（2-hydroxyethyl jasmonate，HEJ）、二氫茉莉酸甲酯（methyl dihydrojasmonate，MDJ）等。

研究表明，一定劑量的MeJA可誘導(dǎo)植物SQE基因的表達(dá)，隨之三萜和植物甾醇含量有所增加，如澤瀉[35]、白樺[24]和人參[30]等。HEJ可誘導(dǎo)三七[17]SQE基因的表達(dá)，增加人參皂苷的合成，MDJ和JA共同作用[51]可誘導(dǎo)三七不定根中SQE等基因的表達(dá)，促進(jìn)多種皂苷成分積累，并出現(xiàn)6種新產(chǎn)物。此外，脫落酸、赤霉素[21]亦被證明可上調(diào)甘草GgSQE1的表達(dá)。水楊酸可誘導(dǎo)栽培黑種草[19]SQE基因的表達(dá)。纖維素酶降解的人參懸浮細(xì)胞細(xì)胞壁[52]和低半乳糖醛酸通過不同作用機(jī)制上調(diào)人參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞SQE基因表達(dá)[53-54]。

然而，內(nèi)源性激發(fā)子并非對所有SQE基因的表達(dá)都具有促進(jìn)作用。MeJA處理蒺藜苜蓿后MtSQE2基因的表達(dá)水平顯著提高，而MtSQE1基因無明顯變化[12]。MeJA能夠上調(diào)雷公藤中TwSQE1-TwSQE4的表達(dá)水平[27]，卻對TwSQE5無效。人參根受MeJA處理后PgSQE1水平上調(diào)，PgSQE2反而受到抑制?？傊?，內(nèi)源性誘導(dǎo)子對SQE基因表達(dá)的影響包括促進(jìn)、抑制以及無明顯影響三種，暗示同一植物不同SQE基因拷貝參與了不同的生源途徑，執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。

5 轉(zhuǎn)錄因子對SQE基因表達(dá)的影響

植物在長期進(jìn)化過程中，形成了復(fù)雜的分子信號網(wǎng)絡(luò)，從而能夠迅速地感知外界環(huán)境并調(diào)控基因的表達(dá)，以適應(yīng)、抵抗和耐受各種生物和非生物的脅迫。順式作用元件一般位于基因的啟動子中，使用染色體步移技術(shù)可得到SQE基因的啟動子。如從催眠睡茄[39]、白樺[24]等植物中分別獲得513bp、1193bp的SQE基因啟動子序列，從中發(fā)現(xiàn)了多個與植物激素、生物和非生物脅迫相關(guān)的關(guān)鍵順式作用元件。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）與真核基因的順式作用元件發(fā)生特異性相互作用，可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。目前發(fā)現(xiàn)植物中與SQE基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子多來自于bZIP、WRKY和MYB家族。

天門冬中的bZIP家族轉(zhuǎn)錄因子ArTGA1和ArTGA2與SQE基因啟動子上的MeJA反應(yīng)性順式作用元件結(jié)合可調(diào)節(jié)其表達(dá)水平[37]。人參[55]中PgWRKY4X可與PgSE啟動子W-box序列結(jié)合，其過表達(dá)可上調(diào)PgSE等基因的表達(dá)，進(jìn)而增加人參皂苷的合成。催眠睡茄中WsWRKY1與SS和SQE基因的啟動子W-box序列結(jié)合，促進(jìn)甾體類物質(zhì)醉茄素A的積累，可作為有效工具來增加甾醇和三萜合成、增強(qiáng)植物的防御反應(yīng)[28]。樺樹[56]中鑒定到2個轉(zhuǎn)錄因子，其中BpMYB21上調(diào)SQE基因的表達(dá)，BpMYB61則下調(diào)SQE基因的表達(dá)，表明BpMYB61可能為一種抑制性的轉(zhuǎn)錄因子。

6 SQEs酶的結(jié)構(gòu)

植物中SQE基因一般編碼500-600個氨基酸[29,57-58]，相對分子質(zhì)量約為55-70kDa，等電點(diǎn)大約為7.5-9，多為疏水性蛋白，其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主[57]。不同植物SQE的N末端同源性較低，如三七PnSE1和PnSE2的N末端70個氨基酸僅有20.7%的序列一致性[57]。從西葫蘆[26]中鑒定出的3個CpSEs均具有鯊烯環(huán)氧酶活性，且其中CpSE2的活性最強(qiáng)，CpSE1和CpSE3活性稍弱。植物中SQE大多具有1個及以上跨膜域[29,57-58]，因此可能導(dǎo)致在原核系統(tǒng)中表達(dá)出沒有活性的包涵體。近些年，人類SQE作為降膽固醇和癌癥的潛在靶點(diǎn)越來越受重視，2019年Andrew J Brown[59]等人報(bào)告了期待已久的人類SQE結(jié)構(gòu)，解析了其催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)及其與兩種抑制劑的配合物，并對人類SQE催化生成DOS的機(jī)制進(jìn)行闡釋。首個SQE結(jié)構(gòu)的解析一方面為與人類健康和疾病密切相關(guān)的SQE研究提供更具說服力的證據(jù)，另一方面為植物中SQE的挖掘提供借鑒。

7 總結(jié)

由于SQE基因在動物膽固醇、真菌甾醇合成途徑中的重要作用，有關(guān)SQE基因的研究層出不窮，主要作為烯丙胺類新型降低膽固醇藥物[60]、腫瘤治療[61]、抗真菌藥物[62]的靶點(diǎn)。一般而言，鯊烯環(huán)氧酶可催化角鯊烯環(huán)氧化生成OS，但目前在大鼠、豬、酵母、紅芒柄花[25]、西葫蘆、樹莓中均曾檢測到DOS的存在。然而，角鯊烯轉(zhuǎn)化為雙環(huán)氧角鯊烯的具體反應(yīng)機(jī)理，雙環(huán)氧角鯊烯在植物體內(nèi)存在的生物意義及其下游產(chǎn)物在植物中發(fā)揮的功能均有待進(jìn)一步的研究。一般而言，植物SQE通常優(yōu)先使用OS，但有意思的是，葉敏團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體AtLUP1T729F和SAD1S728F優(yōu)先用DOS而不是OS。關(guān)鍵堿基改變引發(fā)底物順序優(yōu)先級的改變提示我們，基因突變或許也可以使角鯊烯在其他成鍵部位進(jìn)行環(huán)氧化，這可能是一個值得深入研究的方向。

植物SQE酶不僅在催化功能、參與的生物合成途徑等方面上存在差異，而且可與途徑上其他酶甚至某一中間體發(fā)生相互作用影響催化效率。有關(guān)植物中SQE基因研究的根本目的是增加下游三萜或甾醇產(chǎn)物的產(chǎn)量。目前，研究的主要方向是通過上調(diào)植物或工程菌中SQE基因的表達(dá)水平來促進(jìn)三萜或甾醇合成，少有關(guān)注提升SQE酶活性的研究，本文認(rèn)為調(diào)節(jié)SQE酶活性、酶之間相互作用亦是有潛力的研究方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突