乳制品中乳糖測(cè)定方法研究進(jìn)展

◎ 李 卓，張建雄，張彩華，翟子陽(yáng)

（1.河北大學(xué)，河北 保定 071000；2.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 唐山 063000）

1 乳糖概述

乳糖屬于雙糖，主要存在于乳制品中。乳制品主要可以分為液體乳類、乳粉類、煉乳類、乳脂肪類，牛奶屬于液體乳類，嬰兒所飲用的奶粉屬于乳粉類[1]。乳糖在嬰幼兒配方奶粉中占比較大，這是因?yàn)槿樘怯欣诖龠M(jìn)嬰幼兒對(duì)鈣等營(yíng)養(yǎng)素的吸收，促進(jìn)骨骼發(fā)育，能夠有效預(yù)防佝僂??；對(duì)大腦發(fā)育、調(diào)節(jié)腸道功能及人體能量供應(yīng)等也具有重要作用。嬰兒配方奶粉是對(duì)母乳的補(bǔ)充，是嬰幼兒在生命早期乃至脫離母乳后一段時(shí)間內(nèi)的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。攝入體內(nèi)的乳糖會(huì)被乳糖酶水解為半乳糖和葡萄糖，如果飲用者體內(nèi)缺乏乳糖酶或者乳糖酶活性偏低，則會(huì)產(chǎn)生乳糖不耐癥，主要表現(xiàn)為腹脹、腹痛、腹瀉等消化道癥狀。目前我國(guó)乳制品行業(yè)發(fā)展快速，各企業(yè)之間的競(jìng)爭(zhēng)持續(xù)升級(jí)，對(duì)于準(zhǔn)確高效測(cè)定乳制品中各物質(zhì)含量，保證乳制品質(zhì)量安全具有重要作用。由于乳糖在產(chǎn)品中含量比較穩(wěn)定，通過(guò)測(cè)定乳糖的含量，既可以檢測(cè)乳糖含量是否達(dá)標(biāo)，又可以確定市面上所銷售的零乳糖牛奶是否合格，為乳糖不耐癥個(gè)體提供購(gòu)買及飲用參考。

2 測(cè)定方法

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前被廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定》（GB 5413.5—2010）中測(cè)定乳制品中乳糖含量第一法即為高效液相色譜法[2]，通常選用示差折光或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。陳星蓉等[3]對(duì)高效液相色譜法前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，采用乙酸鋅、亞鐵氰化鉀代替乙腈作為沉淀劑，既減少了乙腈對(duì)操作人員的危害，又避免了使用國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行前處理時(shí)溶液會(huì)出現(xiàn)混濁的現(xiàn)象。張玲等[4]則采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光檢測(cè)器對(duì)奶粉中乳糖含量進(jìn)行了測(cè)定，相較于國(guó)標(biāo)第一法，此方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明此類方法具有可行性，同時(shí)線性范圍良好、操作簡(jiǎn)單、精密度高、結(jié)果可靠，可以滿足實(shí)際檢驗(yàn)分析的需要。然而高效液相色譜儀較大且價(jià)格昂貴，適合實(shí)驗(yàn)室分析，不適合普遍使用。

2.2 離子色譜法

離子色譜法主要應(yīng)用于陰、陽(yáng)離子及碳水化合物的分析測(cè)定，具有前處理簡(jiǎn)單、可實(shí)現(xiàn)多種離子同時(shí)測(cè)定及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。離子色譜法測(cè)定乳糖含量可以采用離子色譜儀，配備電化學(xué)檢測(cè)器，離子色譜儀由脫氣裝置、色譜泵系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成[5]。使用最多的方法為高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法，該法不僅可以用于測(cè)定乳制品中乳糖、蔗糖的含量，還可用于測(cè)定食品中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖等[6]。胡雪等[7]應(yīng)用ICS-5000+型離子色譜儀，使用冰乙酸對(duì)樣品進(jìn)行前處理，目的是沉淀樣品中蛋白質(zhì)等物質(zhì)，使用3 mm×150 mm 的CarboPacTMPA20 作為分析柱分離乳糖，并進(jìn)行梯度洗脫，最后使用電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行定性，峰高或者峰面積進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，峰面積與乳糖質(zhì)量濃度之間具有良好的線性關(guān)系，此方法的檢出限為50 mg·kg-1，加標(biāo)回收率在92.32%～103.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.44%～4.43%，說(shuō)明使用離子色譜法測(cè)定乳制品中乳糖含量時(shí)能實(shí)現(xiàn)有效分離且具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。同時(shí)，離子色譜法還可以測(cè)量乳制品中添加劑的含量，為確保乳制品質(zhì)量安全提供了保障，該方法操作簡(jiǎn)單且安全，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，得到了廣泛使用。

2.3 核磁共振波譜法

核磁共振技術(shù)包括核磁共振波譜技術(shù)和核磁共振成像技術(shù)兩類。核磁共振波譜法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMRS）是一種將核磁共振現(xiàn)象應(yīng)用于測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的譜學(xué)技術(shù)，目前關(guān)于核磁共振波譜的研究主要集中在氫譜和碳譜兩方面。目前我國(guó)已將高分辨率核磁共振技術(shù)應(yīng)用在食品質(zhì)量安全控制領(lǐng)域。例如，趙程祥等[8]論述了利用NMRS 對(duì)乳制品中脂肪酸、代謝物及奶酪中組胺等的檢測(cè)。樊雙喜等[9]利用核磁共振波譜儀，根據(jù)脈沖寬度、外標(biāo)和內(nèi)標(biāo)定量法，建立了一種高效、準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中乳糖含量的方法。利用NMRS 對(duì)牛奶中乳糖進(jìn)行定量分析，對(duì)于內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)物的選擇應(yīng)滿足化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易溶于牛奶且不與牛奶發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、產(chǎn)生的信號(hào)不與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生重合，通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，最后選擇檸檬酸和煙酰胺作為內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)參考物。通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的日內(nèi)、日間精密度均小于1%；采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析可知，日內(nèi)、日間的檢測(cè)結(jié)果之間無(wú)顯著性差異，由此說(shuō)明NMRS 檢測(cè)牛奶中乳糖含量具有較高的精密度且符合要求。高分辨NMRS 避免了國(guó)標(biāo)液相色譜法復(fù)雜的前處理方式及樣品處理過(guò)程，所使用的試劑也較為安全、重現(xiàn)性好、靈敏度高，能夠滿足對(duì)乳糖的檢測(cè)。核磁共振波譜技術(shù)具有上述優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)促使其在食品質(zhì)量安全控制方面具有更廣闊的發(fā)展前景。

2.4 電位滴定法

電位滴定法的原理是在滴定過(guò)程中根據(jù)電位變化來(lái)定位滴定終點(diǎn)[10]，其理論基礎(chǔ)結(jié)合了待測(cè)離子的活度與電極電位之間的關(guān)系。結(jié)合能斯特方程，可以建立待測(cè)物質(zhì)含量和電位變化之間的聯(lián)系[11]。相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，電位滴定法對(duì)外部環(huán)境的要求較低，可在溫度和濕度不適宜的情況下實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的檢測(cè)，檢測(cè)也更為方便，大幅度提升了檢測(cè)效率。王亞飛[12]運(yùn)用全自動(dòng)電位滴定法對(duì)嬰幼兒奶粉中乳糖含量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程中首先對(duì)樣品進(jìn)行了預(yù)處理，再用斐林試劑進(jìn)行標(biāo)定，正式滴定及計(jì)算等步驟嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)手動(dòng)滴定方法進(jìn)行，最后達(dá)到最大等電點(diǎn)時(shí)即為指示終點(diǎn)，通過(guò)消耗滴定液的體積計(jì)算乳糖含量。與國(guó)標(biāo)方法（萊茵-埃農(nóng)氏法）測(cè)定結(jié)果相比，萊茵-埃農(nóng)氏法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.41%～1.01%，而全自動(dòng)電位滴定法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.17%～0.36%，說(shuō)明該方法可行，且重現(xiàn)性更好。全自動(dòng)電位滴定法相較于國(guó)標(biāo)法，檢測(cè)乳糖更為快速，操作簡(jiǎn)單，基本實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可有效避免由于手工滴定、終點(diǎn)的判斷及讀數(shù)所引起的誤差，可以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的分析測(cè)定，但是該方法目前在我國(guó)還沒(méi)有形成一套較為成熟完整的體系。

2.5 生物傳感器差分法

上述檢測(cè)方法都需要進(jìn)行樣品的預(yù)處理，儀器設(shè)備較為復(fù)雜且不能用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，生物傳感器作為現(xiàn)代新興的檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單快速、低成本、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外生物傳感器的發(fā)展極為迅速，在食品安全方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在農(nóng)藥殘留、食源性致病菌及有害添加劑的檢測(cè)。1962 年，Clark和Lyon 研制出了能夠測(cè)定葡萄糖含量的酶電極[13]，由此打開(kāi)了生物傳感器的大門。生物傳感器是能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)采集和處理信息的設(shè)備，其主要組成包括分子識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換器兩部分[14]。選擇酶、抗原抗體、微生物等作為識(shí)別元件，當(dāng)被測(cè)樣品與之接觸時(shí)，會(huì)發(fā)生生化反應(yīng)或特異性結(jié)合，信號(hào)轉(zhuǎn)換器可將這種特異的信息轉(zhuǎn)換為可以檢測(cè)到的光信號(hào)或電信號(hào)，從而完成對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。杜祎等[15]采用復(fù)合膜生物傳感器差分法對(duì)牛奶中乳糖含量進(jìn)行測(cè)定。采用酶固定化技術(shù)，乳糖在乳糖酶作用下分解為半乳糖和葡萄糖，葡萄糖進(jìn)一步被葡萄糖氧化酶分解產(chǎn)生過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化氫電極下產(chǎn)生電信號(hào)，從而確定乳糖含量。乳糖濃度與響應(yīng)信號(hào)之間具有良好的線性關(guān)系且穩(wěn)定性良好，在測(cè)定乳糖含量時(shí)，該方法體現(xiàn)出良好的選擇性，具有更大的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)語(yǔ)

食品安全是每個(gè)人都重視的問(wèn)題，乳糖是生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)素之一，所以對(duì)乳制品中乳糖含量的測(cè)定顯得尤為重要。本文綜述了目前較為新穎的乳糖檢測(cè)方法，實(shí)際生活中，可以根據(jù)自己的需求選擇最佳的檢測(cè)方法。例如，生物傳感器因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、儀器小巧，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等檢測(cè)，但由于儀器設(shè)備較大，有時(shí)還需與質(zhì)譜等聯(lián)用，成本較高，所以更適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。隨著核磁共振技術(shù)的完善和更新，核磁共振波譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作安全、試劑無(wú)毒及測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高，因此在分析復(fù)雜混合物等方面具有廣闊前景。