水飛薊賓糖基化衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和周期的影響

黃瑋瑋，孫晶晶，潘金明，莊思靜，姜曉杰，曹宇，席建軍，莊讓笑

作者單位： 310012 杭州，杭州市西溪醫(yī)院

水飛薊素是從水飛薊的種子中提取出來的一種黃酮木質(zhì)素類混合物，水飛薊賓（SLB）是水飛薊素中最具藥理活性的成分，占水飛薊素總量的60%～70%[1]。SLB 具有抗氧化，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定的作用，被廣泛用于治療各種肝病[2-3]。藥理學(xué)研究顯示，SLB能夠通過抑制腫瘤受體型酪氨酸激酶（RTK）的活性，如抑制表皮生長(zhǎng)因子受體1（EGFR）和胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受體（IGF-1R）及其下游信號(hào)分子的活化等途徑，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌及舌癌等具有良好的抑制作用[4-5]。SLB 還可增強(qiáng)化療藥物的療效及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥（MDR）的發(fā)生[6-7]，但其較差的水溶性（溶解度為430 mg/L）、較低的吸收度和生物利用度（吸收率20%～50%）嚴(yán)重影響其臨床治療效果[8-9]。筆者前期課題利用藥物糖基化對(duì)SLB 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到其糖基化衍生物，見圖1。本研究擬探討SLB 糖基化衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，報(bào)道如下。

圖1 SLB 糖基化衍生物結(jié)構(gòu)

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞LIXC-002，上海研卉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 SLB 衍生物（SLB-X2），浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州西溪醫(yī)院制劑室制作，純度≥99%。SLB，純度≥98%，購(gòu)買于武漢克米克生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。胎牛血清購(gòu)買于Hyclone 公司，青鏈霉素購(gòu)買于Sigma公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)買于Rockville公司，胰蛋白酶購(gòu)買于Gibco 公司，細(xì)胞周期試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)買于南京建成生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 FORMA 700 型超低溫冰箱（Thermo 公司），YC-300L 型藥品儲(chǔ)存柜（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司），SW-CJ-2FD型超凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），3K15 型低溫高速離心機(jī)（Sigma 公司），BS224 型電子天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），F(xiàn)orma 3111 型水套式CO2培養(yǎng)箱（Thermo Electron company），Beckman DxFlex 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將LIXC-002 細(xì)胞加入到含有青鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（Control）、SLBX2（3mol/L）組、SLB-X2（10mol/L）組、SLB-X2（30mol/L）組及SLB 對(duì)照組（30mol/L）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)分組方式加入對(duì)應(yīng)化合物于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化30 s，加入完全培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心5 min，棄上清，每管加入0.5 ml 染色緩沖液重懸細(xì)胞，然后每管加入5l Annexin V-FITC 染液，輕柔吹打混合均勻后，加入5l Propidium Iodide，混勻，室溫條件下避光孵育15 min，然后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6 孔板，用無血清的培養(yǎng)基孵育24 h 使細(xì)胞同步化，隨后按照分組方式加入對(duì)應(yīng)化合物于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入2 ml 0.25%不含有EDTA 胰蛋白酶消化，800 r/min，4 ℃，離心5 min，棄去上清，使用體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇500l對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，4 ℃固定過夜。800 r/min 離心15 min 收集固定細(xì)胞，用0.4 ml PBS 重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至Tube 中輕輕吹打，加RNase-A 約3l 至終濃度約為50g/ml，37 ℃水浴消化30 min，然后加PI 約50l至終濃度約為65g/ml，在冰浴中避光染色30min，用300 目尼龍網(wǎng)過濾，然后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。1.3 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 9（Version 9.4.0）進(jìn)行分析與作圖，Adobe Illustrator 2022（Version 26.3.1）進(jìn)行整理合圖。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，多重比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLB-X2 對(duì)LIXC-002 細(xì)胞凋亡的影響 在給予SLB-X2 處理后細(xì)胞凋亡率明顯上升，不同濃度SLB-X2（3、10 及30mol/L）處理的LIXC-002 細(xì)胞凋亡率分別為13.22%、16.40%和21.24%。與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率顯著上升（t≥8.62，均P ＜0.05），且隨著濃度的增加凋亡率進(jìn)一步上升。與SLB 組比較，相同濃度下，SLB-X2 上調(diào)凋亡率能力是SLB 的2 倍（t=11.45，均P ＜0.05），見圖2 和封三彩圖1。

圖2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 SLB-X2 及SLB 對(duì)LIXC-002 細(xì)胞凋亡的影響

2.2 SLB-X2 對(duì)LIXC-002 細(xì)胞周期的影響 與空白對(duì)照組比較，SLB-X2 組G0/G1、S 期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，而G2/M 期細(xì)胞數(shù)量顯著上升（t≥3.26，均P ＜0.05）；不同濃度SLB-X2 G2/M 期細(xì)胞數(shù)量為23.83%、28.03%、29.21%，提示細(xì)胞周期被阻滯于G2/M 期。與SLB 組比較，在相同濃度下，SLB-X2的細(xì)胞阻滯作用更強(qiáng)（t≥2.65，均P ＜0.05），見圖3和封三彩圖2。

圖3 處在不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量結(jié)果

圖2 SLB-X2 和SLB 對(duì)LIXC-002 細(xì)胞周期的影響

3 討論

2007 年索拉非尼被批準(zhǔn)用于晚期肝細(xì)胞癌（HCC）患者的標(biāo)準(zhǔn)姑息療法[10]，然而索拉菲尼對(duì)胃腸道和皮膚產(chǎn)生的不良反應(yīng)以及耐藥性使其臨床應(yīng)用受到巨大影響[11]。除索拉菲尼外，其他細(xì)胞毒性的化療藥物，都因嚴(yán)重不良反應(yīng)對(duì)臨床應(yīng)用產(chǎn)生了巨大影響[12]，因此高效、低毒的植物藥在研發(fā)抗腫瘤藥物上有很大潛力。

藥物糖基化后糖基部分能夠通過增加溶解性、調(diào)節(jié)血漿半衰期和提高與作用位點(diǎn)結(jié)合的特異性來改變母體藥物的藥理活性，因此藥物糖基化成為藥物結(jié)構(gòu)改造和修飾的常用手段。SLB 在治療肝臟疾病上已經(jīng)有悠久的歷史，近年來其抗腫瘤活性備受關(guān)注[13]，然而生物利用率低抑制了SLB 的發(fā)展。本研究旨在將SLB 糖基化修飾提高水飛薊賓抗腫瘤活性，結(jié)果顯示SLB-X2 具有比SLB 更加優(yōu)良的促凋亡活性。本研究檢測(cè)了化合物對(duì)細(xì)胞周期的影響，在給予不同濃度的SLB-X2 后，細(xì)胞被阻滯在G2/M期，相同濃度下，SLB-X2 的細(xì)胞阻滯作用也明顯優(yōu)于SLB。研究表明，SLB 糖基化修飾后，其體外抗腫瘤活性得到明顯改善，對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期以及凋亡都具有影響，在低濃度下其抗肝癌活性明顯優(yōu)于SLB。

圖3 生存曲線圖

綜上所述，SLB 糖基化物SLB-X2 能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到延緩或抑制腫瘤細(xì)胞惡性傳代的作用，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 黃瑋瑋、席建軍、曹宇：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；潘金明、姜曉杰、莊思靜、孫晶晶：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；莊讓笑：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持