以甘草酸為穩(wěn)定劑的姜黃素-水飛薊賓共載納米混懸劑的制備及體外評價

羅開沛，嚴(yán)春梅，楊 露，古 環(huán)，李秋霞，李芝蓓，施明毅，李小芳?

以甘草酸為穩(wěn)定劑的姜黃素-水飛薊賓共載納米混懸劑的制備及體外評價

羅開沛1，嚴(yán)春梅1，楊 露2，古 環(huán)1，李秋霞1，李芝蓓1，施明毅3?，李小芳1?

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，四川 成都 611137 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)智能醫(yī)學(xué)學(xué)院，四川 成都 611137

以甘草酸為穩(wěn)定劑制備新型姜黃素-水飛薊賓共載納米給藥系統(tǒng)，研究其制劑學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定機(jī)制。采用簡易的反溶劑沉淀法制備姜黃素-水飛薊賓共載納米混懸劑（curcumin and silybin co-loaded nanosuspension，Cur&Sil-Np），以穩(wěn)定劑質(zhì)量濃度、藥物質(zhì)量濃度、穩(wěn)定劑與藥物的比例以及攪拌速度為考察因素，以平均粒徑和多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為指標(biāo)，采用單因素實驗優(yōu)化處方工藝。利用動態(tài)光散射法和透射電子顯微鏡表征Cur&Sil-Np的粒徑、分布和形態(tài)。為提高Cur&Sil-Np的穩(wěn)定性，以3%甘露醇為凍干保護(hù)劑，通過冷凍干燥法將Cur&Sil-Np制成凍干粉。采用差示掃描量熱法和X射線衍射法分析凍干粉中藥物的晶型。進(jìn)一步評價Cur&Sil-Np的體外釋放特性和穩(wěn)定機(jī)制。最優(yōu)處方工藝為甘草酸質(zhì)量濃度1.5 mg/mL，藥物質(zhì)量濃度8 mg/mL，藥物與穩(wěn)定劑的比例5∶3，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min。制備的Cur&Sil-Np的平均粒徑為（226.5±11.1）nm，PDI為0.038±0.021，呈均一的圓球形；制備成納米混懸劑后，藥物的晶型發(fā)生了改變；體外釋放結(jié)果顯示，Cur&Sil-Np可分別將姜黃素和水飛薊賓的體外累積溶出率從游離藥物的23.3%和15.1%提高至82.7%和70.9%。穩(wěn)定機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，靜電斥力是甘草酸穩(wěn)定Cur&Sil-Np的機(jī)制之一。天然表面活性劑甘草酸穩(wěn)定的Cur&Sil-Np制備工藝簡便可行、制劑性質(zhì)良好、釋藥快速，是一種潛在的新型給藥系統(tǒng)。

姜黃素；水飛薊賓；共載納米混懸劑；甘草酸；天然穩(wěn)定劑；溶出度；穩(wěn)定機(jī)制

姜黃素是從中藥姜黃、莪術(shù)等分離的一種多酚類化合物，在關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、肥胖癥和癌癥等疾病中有所應(yīng)用[1]，并已被美國國立腫瘤研究所列為第3代抗癌藥物[2]。水飛薊賓為菊科植物水飛薊的有效成分，具有肝保護(hù)、抗氧化、抗炎、抗糖尿和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[3]。研究表明，姜黃素聯(lián)合水飛薊賓能協(xié)同發(fā)揮治療作用，如抑制結(jié)直腸癌[4]和乳腺癌[5-6]的增殖，防止腸息肉的形成[7]，抗耐藥菌[8]等。然而，二者均存在溶解性差、溶出速率慢、生物利用度低等缺點[9-10]，限制了其開發(fā)應(yīng)用。

納米混懸劑（nanosuspension）是由穩(wěn)定劑如表面活性劑或聚合物制備的亞微米體系，具有載藥量高、制備簡易、適用范圍廣等優(yōu)點[11-12]。由于合成穩(wěn)定劑的長期使用會對人體產(chǎn)生副作用，因此，挖掘毒性低、生物相容性好的天然穩(wěn)定劑成為研究熱點[13]。甘草酸，是中藥“國老”甘草的主要藥效成分，具有表面活性劑特性，能夠在水溶液中自發(fā)形成膠束而對難溶性成分進(jìn)行增溶[14-15]。除了作輔料外，甘草酸還具有促進(jìn)藥物吸收、減少化療毒副作用和逆轉(zhuǎn)耐藥等作用[16]。因此，將甘草酸用于制劑的構(gòu)建，體現(xiàn)了中藥制劑“藥輔合一”的特色。課題組前期以甘草酸為穩(wěn)定劑成功制備了水飛薊素納米混懸劑[17]、葛根素納米乳[18]和黃芩苷固體納米晶體[19]，顯著提高了難溶性藥物的溶出度。目前，甘草酸作為天然穩(wěn)定劑多用于單一藥物的增溶，而制備荷載2種藥物的納米混懸劑卻鮮有報道，值得進(jìn)一步研究。

為了解決姜黃素和水飛薊賓直接應(yīng)用的局限，同時探索天然表面活性劑甘草酸制備雙藥納米混懸劑的潛力，本研究以甘草酸替代傳統(tǒng)穩(wěn)定劑，制備姜黃素和水飛薊賓共載納米混懸劑（curcumin and silybin co-loaded nanosuspension，Cur&Sil-Np），篩選其最佳處方和制備工藝，評價其制劑學(xué)性質(zhì)，并探究其穩(wěn)定機(jī)制。

1 儀器與材料

Agilent1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Nicomp 380 ZLS Zeta型電位/粒度儀，美國PSS公司；RC-3型溶出度測試儀，濟(jì)南歐萊博生物科技有限公司；SJIA-10N-50型冷凍干燥機(jī)，寧波市雙嘉儀器有限公司；MS-280-H型磁力攪拌器，杭州旌斐儀器科技有限公司；TGA-21型高速冷凍離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；SuPerMax3100型多功能酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；DDS-11C型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；STD650型同步綜合熱分析儀，美國TA公司；Bruker D8型X射線衍射儀，德國布魯克公司；JEM-2100F型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社。

甘草酸，批號20210302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，西安格林生物科技有限責(zé)任公司；姜黃素，批號O0904A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，深圳市浩博世紀(jì)生物有限公司；水飛薊賓，批號S0916B，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，大連美侖生物技術(shù)有限公司；對照品姜黃素（批號MUST-22022111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.88%）、水飛薊賓（批號MUST-21031607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.95%），成都曼斯特生物科技有限公司；氯化鈉，分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，分析純，四川西隴科學(xué)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 Cur&Sil-Np的制備及粒徑測定

稱取穩(wěn)定劑甘草酸15.00 mg溶于去離子水中，制得穩(wěn)定劑溶液。稱取姜黃素10.80 mg和水飛薊賓14.18 mg（參考文獻(xiàn)報道[6,20]，設(shè)定藥物物質(zhì)的量比1∶1），溶于適量乙醇溶液中，制得藥物溶液。穩(wěn)定劑溶液在25 ℃、適宜轉(zhuǎn)速條件下攪拌，緩慢加入藥物溶液直至加完，持續(xù)攪拌1 min，減壓蒸發(fā)揮去乙醇，即得Cur&Sil-Np。將Cur&Sil-Np用去離子水稀釋，利用激光粒度儀測定其粒徑和多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）。

2.2 Cur&Sil-Np處方工藝單因素考察

2.2.1 穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度的考察 固定藥物與穩(wěn)定劑甘草酸比例為5∶3，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，設(shè)置穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，考察穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度對Cur&Sil-Np粒徑和PDI的影響，結(jié)果見表1。隨著穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度的增加，Cur&Sil-Np的粒徑和PDI呈先降低后增加的趨勢。當(dāng)穩(wěn)定劑甘草酸的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，平均粒徑及PDI較小。因此，選擇1.5 mg/mL為制備Cur&Sil-Np的穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度。

2.2.2 藥物質(zhì)量濃度的考察 固定藥物與穩(wěn)定劑比例為5∶3，穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，設(shè)置藥物質(zhì)量濃度分別為4、6、8、10 mg/mL，考察藥物質(zhì)量濃度對Cur&Sil-Np粒徑和PDI的影響，結(jié)果見表2。隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，Cur&Sil-Np的粒徑和PDI呈先降低后增加的趨勢。當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，平均粒徑及PDI較小。因此，選擇8 mg/mL為制備Cur& Sil-Np的藥物質(zhì)量濃度。

表1 穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度對Cur&Sil-Np平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

表2 藥物質(zhì)量濃度對Cur&Sil-Np平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.2.3 藥物與穩(wěn)定劑甘草酸比例的考察 固定藥物質(zhì)量濃度為8 mg/mL，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，設(shè)置藥物與穩(wěn)定劑甘草酸比例為5∶4、10∶7、5∶3、2∶1、5∶2，考察藥物與穩(wěn)定劑比例對Cur&Sil-Np粒徑和PDI的影響，結(jié)果見表3。當(dāng)藥物和穩(wěn)定劑比例為5∶3時，Cur&Sil-Np的平均粒徑及PDI較小。因此，以藥物與穩(wěn)定劑比例5∶3制備Cur&Sil-Np。

表3 藥物與穩(wěn)定劑甘草酸的比例對Cur&Sil-Np平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.2.4 攪拌速度的考察 固定藥物質(zhì)量濃度為8 mg/mL，藥物與穩(wěn)定劑比例為5∶3，穩(wěn)定劑甘草酸質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，攪拌轉(zhuǎn)速為400、600、800、1000 r/min，考察攪拌轉(zhuǎn)速對Cur&Sil-Np粒徑和PDI的影響，結(jié)果見表4。轉(zhuǎn)速為400、600 r/min時，Cur&Sil-Np的平均粒徑和PDI接近，但轉(zhuǎn)速較小會延長穩(wěn)定劑溶解和混懸劑形成時間，導(dǎo)致制備效率低，故選擇600 r/min為制備Cur&Sil-Np的攪拌速度。

2.2.5 驗證試驗 稱取甘草酸15.00 mg溶于10 mL去離子水中，制得穩(wěn)定劑甘草酸溶液。稱取姜黃素10.80 mg和水飛薊賓14.18 mg，溶于適量乙醇溶液中，得到8 mg/mL藥物溶液。在25 ℃、600 r/min磁力攪拌條件下，將藥物溶液緩慢滴加到穩(wěn)定劑溶液中，混合均勻，持續(xù)攪拌1 min，減壓蒸發(fā)揮去乙醇，即得。平行制備3批樣品。利用動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）測定樣品的平均粒徑和PDI，結(jié)果見表5和圖1。Cur&Sil-Np的粒徑在140～300 nm，平均粒徑為（226.5±11.1）nm，PDI為0.038±0.021，ζ電位為（?25.4±1.6）mV。3批Cur&Sil-Np的平均粒徑和PDI接近，表明該處方工藝重復(fù)性較好，可用于Cur&Sil-Np的制備。

表4 攪拌速度對Cur&Sil-Np平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.3 外觀形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察Cur&Sil-Np的形態(tài)和大小。將Cur&Sil-Np溶液滴于含有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置5 min，干燥后觀察，結(jié)果見圖2。Cur&Sil-Np呈光滑的圓球形，分布較為均勻，粒徑為200～250 nm，與DLS結(jié)果基本一致。

表5 Cur&Sil-Np最佳工藝條件驗證(, n = 3)

圖1 Cur&Sil-Np的粒徑分布

圖2 Cur&Sil-Np的TEM圖

Fig. 2 TEM image of Cur&Sil-Np

2.4 Cur&Sil-Np凍干粉的制備

為了便于納米混懸劑的貯存和運輸，通常采用固化的方式提高其穩(wěn)定性。通過冷凍干燥法固化Cur&Sil-Np，考察凍干保護(hù)劑用量對于凍干后粒徑和PDI的影響。以再分散系數(shù)（redispersibility index，RDI）和PDI為凍干粉再分散性的評價指標(biāo)，其中RDI的計算公式為RDI＝凍干再分散后的粒徑/凍干前的粒徑，RDI越接近1，表明凍干后“固化損傷”越小。Cur&Sil-Np凍干前、后的外觀見圖3，實驗結(jié)果見表6。如圖3所示，Cur&Sil-Np凍干前為帶有乳光的黃色透明溶液，凍干后為蓬松、均勻、細(xì)膩的黃色粉末。如表6所示，無凍干保護(hù)劑時，Cur&Sil-Np的粒徑增加最多。凍干保護(hù)劑用量的不同，復(fù)溶后的平均粒徑和PDI也有所變化，其中，以3%甘露醇作為凍干保護(hù)劑時，RDI最接近1，且PDI值最小。故最佳凍干工藝為Cur&Sil-Np中加入3%甘露醇，?80 ℃冰箱預(yù)凍24 h，再置于冷凍干燥機(jī)中干燥48 h，即得凍干粉。

2.5 凍干粉的表征

2.5.1 差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）分析 為考察Cur&Sil-Np中藥物的結(jié)晶狀態(tài)，對姜黃素原料藥、水飛薊賓原料藥、甘草酸原料藥、物理混合物（姜黃素＋水飛薊賓＋甘草酸，取處方量的甘草酸、姜黃素和水飛薊賓直接混合均勻，即得）和Cur&Sil-Np凍干粉進(jìn)行DSC分析。

圖3 Cur&Sil-Np (A) 及其凍干粉(B) 的外觀

表6 Cur&Sil-Np凍干前、后的平均粒徑、PDI和RDI(, n = 3)

測定參數(shù)：升溫速率10 ℃/min，升溫范圍35～350 ℃，空鋁盤作為空白對照，測定載氣為氮氣，氮氣體積流量50 mL/min，結(jié)果見圖4。由圖4可知，甘草酸在290 ℃附近存在微弱的放熱峰；水飛薊賓分別在168 ℃和300 ℃附近有放熱峰和吸熱峰；姜黃素在180 ℃附近出現(xiàn)放熱峰；在物理混合物中仍然存在168 ℃和180 ℃附近的放熱峰；而Cur&Sil-Np中僅存在168 ℃附近的放熱峰，290 ℃的放熱峰和300 ℃附近的吸熱峰均消失，說明Cur&Sil-Np中姜黃素和水飛薊賓的晶型均發(fā)生了改變。

圖4 甘草酸(A)、水飛薊賓(B)、姜黃素(C)、物理混合物(D) 和Cur&Sil-Np凍干粉(E) 的DSC分析

2.5.2 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析 取適量姜黃素原料藥、水飛薊賓原料藥、甘草酸原料藥、物理混合物和Cur&Sil-Np凍干粉，利用X射線衍射儀進(jìn)行衍射圖譜分析。

分析參數(shù)：工作電流40 mA，工作電壓40 kV，掃描范圍5°～50°，步長0.02°，掃描速率3°/min，結(jié)果見圖5。姜黃素和水飛薊賓分別在5°～30°和10°～30°出現(xiàn)很強(qiáng)的特征晶體衍射峰，可見姜黃素原料藥和水飛薊賓原料藥均以結(jié)晶態(tài)形式存在；甘草酸原料藥有微弱的衍射峰，說明甘草酸原料藥為晶體結(jié)構(gòu)；在物理混合物中，姜黃素及水飛薊賓晶體特征仍存在；而在Cur&Sil-Np中，盡管存在藥物的部分衍射特征峰，但其強(qiáng)度明顯減弱、消失或增強(qiáng)，推測姜黃素和水飛薊賓在制備成Cur&Sil-Np后，藥物晶型發(fā)生了變化。

圖5 甘草酸(A)、水飛薊賓(B)、姜黃素(C)、物理混合物(D) 和Cur&Sil-Np凍干粉(E) 的XRD分析

2.6 體外釋放測定

2.6.1 對照品溶液制備 精密稱取姜黃素對照品5.09 mg，水飛薊賓對照品2.53 mg，加3 mL甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，混勻即得混合對照品儲備液（姜黃素203.6 μg/mL、水飛薊賓101.2 μg/mL）。

2.6.2 供試品溶液制備 取0.125 mL Cur&Sil-Np置于25 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解定容。取上述溶液1 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，混勻，即得供試品溶液。

2.6.3 色譜條件

（1）水飛薊賓色譜條件：色譜柱為Diomomsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-1%冰乙酸水溶液（40.4∶9.6∶50）；體積流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為287 mm。色譜圖見圖6，圖中顯示2個特征峰，這是由于水飛薊賓存在非對映異構(gòu)體。

（2）姜黃素色譜條件：流動相為乙腈-0.5%冰乙酸水溶液（52∶48）；檢測波長為430 mm，其余同水飛薊賓。色譜圖見圖7。

2.6.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，用流動相稀釋，得到水飛薊賓質(zhì)量濃度分別為0.26、0.51、1.02、2.56、12.78、30.66、40.88 μg/mL，姜黃素質(zhì)量濃度為0.51、1.02、2.04、5.09、25.45、61.08、81.44 μg/mL的系列對照品溶液。經(jīng)HPLC檢測，以峰面積（）對藥物質(zhì)量濃度（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：水飛薊賓＝34.92＋30.249，2＝0.999 1；姜黃素＝103.54＋35.416，2＝0.999 1；結(jié)果顯示，水飛薊賓在0.26～40.88 μg/mL，姜黃素在0.51～81.44 μg/mL線性關(guān)系良好。

圖6 陰性樣品(A)、水飛薊賓對照品(B)和Cur&Sil-Np樣品(C)的HPLC圖

圖7 陰性樣品(A)、姜黃素對照品(B)和Cur&Sil-Np樣品(C)的HPLC圖

2.6.5 精密度考察 取混合對照品溶液，濾膜濾過，濾液置于進(jìn)樣瓶中，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄水飛薊賓和姜黃素峰面積，計算其RSD分別為0.48%和0.64%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，濾膜濾過，濾液置于進(jìn)樣瓶中，分別于制備后0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，HPLC測定，水飛薊賓和姜黃素的RSD分別為0.50%和0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.7 重復(fù)性考察 取適量Cur&Sil-Np，分別制備6份供試品溶液，HPLC測定，水飛薊賓和姜黃素的RSD分別為1.28%和0.73%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗 取適量Cur&Sil-Np，制備6份供試品溶液，分別加入已測定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，HPLC測定，水飛薊賓和姜黃素的平均加樣回收率分別為101.27%、100.44%，RSD分別為3.04%、0.68%，表明該方法回收率較好。

2.6.9 體外釋放實驗 稱取游離姜黃素、游離水飛薊賓和Cur&Sil-Np凍干粉，分別置于250 mL釋放介質(zhì)（0.1%聚山梨酯-80的中性磷酸鹽緩沖液）中，設(shè)置溶出裝置的轉(zhuǎn)速為75 r/min，溫度為37.0 ℃，分別于預(yù)定時間點取樣1 mL，并立即補(bǔ)足等量介質(zhì)，取出樣品按“2.6.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算不同時間的累積釋放率，結(jié)果見圖8。在120 min時，游離姜黃素和游離水飛薊賓累積釋放率分別為23.3%和15.1%；而在Cur&Sil-Np中，姜黃素和水飛薊賓累積釋放率分別達(dá)到82.7%和70.9%，二者的累積溶出度顯著提高（＜0.05）。

圖8 姜黃素(A)和水飛薊賓(B)的體外釋放曲線(, n = 3)

2.7 穩(wěn)定性影響因素

2.7.1 pH值的影響 按照最佳處方工藝制備Cur& Sil-Np，用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整pH值分別為3、4、5、6、7，觀察其現(xiàn)象，測定平均粒徑和PDI，結(jié)果見圖9和表7。

如圖9所示，當(dāng)pH值為3～6時，Cur&Sil-Np仍呈黃色乳光，而當(dāng)pH值為7時，制劑為橙色，出現(xiàn)懸浮顆粒，并且過濾膜后藥物幾乎全部被濾膜截留，濾液呈透明淡黃色，無乳光。以上結(jié)果提示，pH≥7時Cur&Sil-Np性質(zhì)不穩(wěn)定。

圖9 pH值對Cur&Sil-Np穩(wěn)定性的影響

表7 pH值對Cur&Sil-Np的平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

如表7所示，當(dāng)pH值為3～6時，隨著pH值的增大，Cur&Sil-Np的粒徑呈現(xiàn)增大趨勢，而當(dāng)pH值為7時，Cur&Sil-Np發(fā)生渾濁，出現(xiàn)沉淀，無法測得粒徑和PDI，這意味著Cur&Sil-Np在此條件下不穩(wěn)定。究其原因，一般來說，如果粒徑隨著體系pH值變化而改變，那么靜電作用則是穩(wěn)定納米結(jié)構(gòu)的主要機(jī)制[21-22]。

具體而言，甘草酸中的3個羧基（pa1＝3.98、pa2＝4.59、pa3＝5.15），以及姜黃素和水飛薊賓中的酚羥基，使得體系性質(zhì)呈酸性，而pH值的變化會影響甘草酸的質(zhì)子化程度和電荷密度，從而破壞穩(wěn)定保護(hù)層。因此，甘草酸的穩(wěn)定機(jī)理與靜電斥力有關(guān)。

2.7.2 離子強(qiáng)度的影響 穩(wěn)定劑的靜電作用還與離子強(qiáng)度（ionic strength，IS）因素密切相關(guān)。若離子強(qiáng)度對粒徑?jīng)]有變化，則說明無靜電斥力的參與，反之亦然。按照最佳處方工藝制備Cur&Sil-Np，用氯化鈉調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L，觀察其現(xiàn)象，測定平均粒徑和PDI，結(jié)果見圖10和表8。

如圖10所示，當(dāng)IS≤0.03 mol/L時，Cur&Sil- Np仍具有乳光，而IS≥0.04 mol/L時，制劑顏色變深，藥物懸浮于液體表面，過濾膜后藥物大部分被截留，濾液無乳光。

圖10 離子強(qiáng)度對Cur&Sil-Np穩(wěn)定性的影響

表8 離子強(qiáng)度對Cur&Sil-Np的平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

如表8所示，當(dāng)離子強(qiáng)度為0.01～0.03 mol/L時，Cur&Sil-Np的粒徑呈現(xiàn)遞增趨勢，而IS≥0.04 mol/L時，無法測得粒徑和PDI，與外觀現(xiàn)象一致。以上結(jié)果表明，Cur&Sil-Np的粒徑隨離子強(qiáng)度的變化而變化，這可能是由于離子強(qiáng)度會影響粒子周圍雙電極層的形成和厚度，進(jìn)而影響納米結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)一步證明了靜電作用介導(dǎo)的穩(wěn)定機(jī)制。

3 討論

聯(lián)合給藥，又稱“雞尾酒”療法，是臨床疾病治療的主要趨勢，其目的是增強(qiáng)藥物的治療效果或減輕藥物的毒副作用[23]。而聯(lián)合用藥的最佳比例是需面臨的首要問題。目前，聯(lián)合比例通常是通過細(xì)胞實驗或動物實驗篩選而得出[24-25]。

文獻(xiàn)證實，姜黃素和水飛薊賓物質(zhì)的量比為1∶1時，能夠起到協(xié)同增效的作用[6,20]。實際上，藥物聯(lián)用比例的不同，也會影響制劑的處方工藝[26]。前期預(yù)實驗研究了姜黃素和水飛薊賓物質(zhì)的量比（4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4）對共載納米混懸劑制劑性質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物物質(zhì)的量比不同時，Cur&Sil-Np的粒徑和PDI也有所變化，但幅度不大，平均粒徑在210～270 nm，PDI在0.054～0.137。因此，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報道的聯(lián)用比例（姜黃素和水飛薊賓物質(zhì)的量比為1∶1）進(jìn)行了后續(xù)處方工藝考察。

在前期預(yù)試驗中，對天然穩(wěn)定劑種類包括甘草酸、絞股藍(lán)皂苷和茶皂素進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以絞股藍(lán)皂苷為穩(wěn)定劑時，藥物顆粒沉降，其原因可能是姜黃素和水飛薊賓中的酚羥基在水中電離，使體系pH值約為4.5，而絞股藍(lán)皂苷結(jié)構(gòu)中存在羧基（pa≈3.25），此時體系的pH值與絞股藍(lán)皂苷的pa接近，導(dǎo)致絞股藍(lán)皂苷的質(zhì)子化程度較高，難以提供良好的排斥穩(wěn)定性[27]。而以甘草酸和茶皂素為穩(wěn)定劑時，均能成功制備納米混懸劑，兩者的平均粒徑較為接近，但甘草酸為穩(wěn)定劑時的PDI較小，且ζ電位較高，提示Cur&Sil-Np的分布更均勻，性質(zhì)更加穩(wěn)定。因此，本實驗選擇甘草酸作為制備納米混懸劑的穩(wěn)定劑。

產(chǎn)業(yè)化是制藥行業(yè)面臨的關(guān)鍵問題。越簡單的制備工藝，越能實現(xiàn)成果轉(zhuǎn)化。反溶劑沉淀法、介質(zhì)研磨法、沉淀法-高壓均質(zhì)法聯(lián)合技術(shù)和沉淀法-高剪勻質(zhì)法聯(lián)合技術(shù)是納米混懸劑制備的常用方法。其中，反溶劑沉淀法操作簡便，無需昂貴、精密的制藥設(shè)備，但存在納米粒子粒徑較大、分布較寬的問題[11]，導(dǎo)致其單獨應(yīng)用受到限制。本實驗通過該方法制備的Cur&Sil-Np，其粒徑小于250 nm，PDI小于0.1，外觀形態(tài)呈現(xiàn)圓整的球形，分布均一，有效避免了上述問題，兼顧了制備工藝簡便、生產(chǎn)成本不高和成品性質(zhì)良好等諸多優(yōu)點，體現(xiàn)了“綠色制造”理念，易于實現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。

為便于制劑的貯存和運輸，本實驗采用冷凍干燥法進(jìn)一步將納米混懸劑制成固體粉末。利用差示掃描量熱法和X射線衍射法對Cur&Sil-Np粉末中姜黃素和水飛薊賓的晶體狀態(tài)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，2種藥物的晶型均發(fā)生了一定程度的改變。體外釋放結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素和水飛薊賓制備成納米混懸劑后，120 min內(nèi)累積溶出度顯著提高，分別為游離姜黃素和游離水飛薊賓的3.5倍和4.7倍。根據(jù)穩(wěn)定機(jī)制考察結(jié)果可知，pH值和離子強(qiáng)度會影響Cur&Sil-Np的穩(wěn)定性，其機(jī)制與靜電作用有關(guān)。有文獻(xiàn)報道，空間作用可能是甘草酸穩(wěn)定作用的另一機(jī)制[28]。這是由于甘草酸的分子結(jié)構(gòu)為兩親性，一方面，基于此結(jié)構(gòu)對藥物微粒的高親和力，甘草酸可吸附于藥物外層，另一方面，可通過分子間作用力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，抑制納米粒的團(tuán)聚和沉降。但該機(jī)制是否真正參與了Cur&Sil-Np的形成，有待進(jìn)一步探索。

總之，本研究提出了一種簡單可行的策略，以甘草酸為天然穩(wěn)定劑制備了負(fù)載2種藥物的納米混懸劑。Cur&Sil-Np具有較小的粒徑、均勻的分布和快速的釋藥特性，為其他中藥組分納米混懸劑的制備提供了示范，同時拓展了甘草酸的應(yīng)用。然而，與傳統(tǒng)穩(wěn)定劑相比，甘草酸作為“輔料”是否影響姜黃素和水飛薊賓的藥動學(xué)性質(zhì)，甘草酸是否還存在其他穩(wěn)定機(jī)制，以及甘草酸作為“藥物”能否與姜黃素和水飛薊賓產(chǎn)生協(xié)同治療作用等系列問題，還需進(jìn)一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andevaluation of curcumin and silibinin co-loaded nanosuspension with glycyrrhizic acid as stabilizer

LUO Kai-pei1, YAN Chun-mei1, YANG Lu2, GU Huan1, LI Qiu-xia1, LI Zhi-bei1, SHI Ming-yi3, LI Xiao-fang1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. School of Intelligent Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

The nano-drug delivery system co-loaded with curcumin and silybin was prepared with glycyrrhizic acid as stabilizer as well as its pharmaceutical properties and stability mechanism were explored.A curcumin and silybin co-loaded nanosuspension (Cur&Sil-Np) was prepared by anti-solvent precipitation method. The mass concentration of stabilizer, drug concentration, proportion of stabilizer and drug, and stirring speed were used as investigative factors, while particle size and polydispersity index (PDI) were used as indicators. Based on above, the formulation and preparation process of Cur&Sil-Np were optimized by single factor test. Particle size, distribution, and morphology of Cur&Sil-Np were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy, respectively. To improve the stability of Cur&Sil-Np, Cur&Sil-Np was lyophilized by freeze-drying method with 3% mannitol as lyophilized protective agent. Both differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffraction (XRD) were applied to analyze the crystal form of drugs in freeze-dried powder. The dissolution characteristics and stability mechanism of Cur&Sil-Np were further evaluated.The optimal process parameters were as follows: the mass concentration of glycyrrhizic acid was 1.5 mg/mL, the drug concentration was 8 mg/mL, the ratio of drug to stabilizer was 5:3, and the stirring speed was 600 r/min. The average particle size and PDI of Cur&Sil-Np were (226.5 ± 11.1) nm and 0.038 ± 0.021, respectively. Cur&Sil-Np presented a spherical shape with a uniform distribution. The crystal form of drugs in Cur&Sil-Np altered. The cumulative release of curcumin and silybin in Cur&Sil-Np was significantly increased from 23.3% and 15.1% of free drugs to 82.7% and 70.9%, respectively. Moreover, electrostatic repulsion was one of the stabilization mechanisms of Cur&Sil-Np stabilized by glycyrrhizic acid.Cur&Sil-Np stabilized by natural surfactant glycyrrhizic acid is a potential new drug delivery system with simple and feasible preparation process, good properties and rapid drug release.

curcumin; silybin; co-loaded nanosuspension; glycyrrhizic acid; natural stabilizer; dissolution rate; stabilization mechanism

R283.6

A

0253 - 2670(2023)15 - 4823 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.007

2023-02-05

國家自然科學(xué)基金資助項目（82204633）；中國博士后科學(xué)基金資助項目（2021M700550）；四川省自然科學(xué)基金資助項目（2022NSFSC0634）；四川省自然科學(xué)基金資助項目（2023NSFSC1782）；四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研專項（2020JC0038）

羅開沛，博士，講師，從事中藥納米給藥系統(tǒng)研究。E-mail: luokaipei@126.com

通信作者：施明毅，碩士，講師，從事中藥學(xué)、中藥信息化教學(xué)及科研。E-mail: 394540370@qq.com

李小芳，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)研究。E-mail: lixiaofang@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]