不同生長年限黨參根系微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究

孟彤彤，崔興帥，朱 寧，冷非凡，王永剛*，陳吉祥1, *

不同生長年限黨參根系微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究

孟彤彤1, 3，崔興帥2，朱 寧2，冷非凡2，王永剛2*，陳吉祥1, 2*

1. 蘭州理工大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050 2. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050 3. 甘肅省水利科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050

探究不同生長年限黨參根系微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性，以提高黨參品質(zhì)。對(duì)一、二、三年生黨參土壤、根際土壤和根進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析。隨黨參生長年限的增加，土壤和根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌處于動(dòng)態(tài)平衡，而根內(nèi)細(xì)菌豐度減少。真菌在土壤和根際土壤中豐度逐年降低，病原真菌在黨參根系中豐度逐年增加。不同生長年限的黨參根系微生物群落組裝更多的受隨機(jī)性過程影響，且根系細(xì)菌的群落功能穩(wěn)定性高于真菌。蛋白酶（protease，PRO）、全氮（total nitrogen，TN）、速效鉀（available potassium，AK）、水分（water content，WC）、速效磷（available phosphorus，AP）和土壤有機(jī)質(zhì)（soil organic matter，SOM）是影響不同生長年限黨參根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要影響因素，TN和全鉀（TK）是影響真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要影響因素。黨參根系微生物群落組成和多樣性隨生長年限改變，并對(duì)不同土壤環(huán)境因子作出差異化響應(yīng)，該研究為后期深入研究黨參病害防治，提高黨參品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

黨參；高通量測(cè)序；環(huán)境因子；根系；微生物多樣性

黨參(Franch.) Nannf.屬于桔?？浦参?，其干燥根作為中國傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，富含甾醇、多糖、炔苷、生物堿等活性成分[1-2]。中國藥典中記載，黨參具有健脾、潤肺、養(yǎng)血、生液、增強(qiáng)免疫等功效[3]。黨參在我國種植廣泛，而甘肅省是中國最大的黨參種植基地，栽培面積占全國種植總面積的90%以上[4]。

植物根系包含根內(nèi)、根平面、根際和土壤，土壤中蘊(yùn)含豐富多樣的微生物，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用[5-8]。根際作為地球上物質(zhì)和能量循環(huán)、信息交換最活躍的界面之一，也是植物-微生物-土壤相互作用的一個(gè)復(fù)雜場所[9]。根際微生物系統(tǒng)可以調(diào)整植物菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)植物抵抗力和提高特殊環(huán)境脅迫下的耐受性[10]，同時(shí)根際土壤微生物也是衡量土壤肥力和養(yǎng)分的重要指標(biāo)[11]。藥用植物產(chǎn)生的黃酮、萜類等次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累，因種植地點(diǎn)、季節(jié)和植物基因型而異，這些因素也會(huì)影響定殖于宿主體內(nèi)微生物的分布[5]。在植物生長過程中，這些代謝產(chǎn)物很容易被釋放到土壤中，引起土壤理化性質(zhì)的改變，最終導(dǎo)致根系微生物群落的變化[12]。冼康華等[13]對(duì)3、5、7、9年生華重樓根際微生物和土壤理化因子進(jìn)行的研究結(jié)果表明，隨著華重樓生長年限的增加，根際微生物多樣性先升高后降低，速效鉀和全氮是影響根際細(xì)菌群落組成的主要因素，總鉀是影響根際真菌群落組成的重要因子。李勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同生長年限的西洋參根際土和非根際土中的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，不同土壤樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)一定的根際效應(yīng)。國內(nèi)外研究表明，土壤養(yǎng)分丟失、微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[15,16-22]等為植物連作障礙的主要原因。綜上研究所述，探究在不同生長年限藥用植物生長發(fā)育對(duì)根系微生物群落多樣性的影響，對(duì)了解藥用植物根系狀態(tài)、促進(jìn)植株生長、防止土傳病蟲害及提高藥材品質(zhì)等有極其重要的意義。

近年來黨參根系微生物研究多集中在連作障礙[23]、緩解根腐病[24]等方面，而不同發(fā)育時(shí)期的黨參與根系微生物群落多樣性變化的研究較少，微生物群落結(jié)構(gòu)變化與黨參生長年限的關(guān)系仍不清楚。因此，本研究利用Illumina MiSeq的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同生長年限黨參土壤、根際土壤和根細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS序列進(jìn)行測(cè)序，研究不同生長年限的栽培黨參根系微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，探討黨參生長發(fā)育對(duì)定殖微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響，為后續(xù)深入研究黨參活性成分積累調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試黨參根際土壤和根來自甘肅省定西市岷縣中藥種植基地（104°14′40″E，35°10′12″N），植物樣本經(jīng)蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院制藥工程專業(yè)楊林副教授鑒定為桔?？浦参稂h參(Franch.) Nannf.，品種為“白條”。不同年限黨參主要通過種苗移栽的方式種植。

1.2 儀器

DYCP-32C型瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠）；Covaris超聲波破碎儀（Covaris S2 System Massachusetts，美國）；Qubit Fluorometric Quantification（Qubit 2.0，Thermo Scientific，美國）；Agilent 5400生物分析儀（Agilent Technologies有限公司，USA）T100 PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；Novaseq 6000測(cè)序儀（Illumina，San Diego，CA，美國）。

2 方法

2.1 樣品處理

2021年8月中旬，在甘肅省定西市岷縣中藥種植基地分別采集一年生、二年生和三年生黨參根際土壤和藥用部位根。采樣時(shí)，每個(gè)樣地隨機(jī)選取6個(gè)樣方（5 m×5 m），每個(gè)樣方隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，則共采集黨參土壤18×3份，根際土壤18×3份，根18×3份。先采用抖落法收集與根系結(jié)合松散的土壤，作為非根際土壤，再收集與根系表面粘附性較強(qiáng)的土壤作為根際土壤（距離根部2.5 mm），最后收集根[25]。土壤樣品裝入無菌密封袋，冰袋保存迅速送回實(shí)驗(yàn)室。隨機(jī)將每2個(gè)樣方內(nèi)的土壤混合作為土壤樣本的一個(gè)重復(fù)；將每個(gè)樣方內(nèi)的根際土壤混合，作為根際土壤樣本的一個(gè)重復(fù)；將每個(gè)樣方內(nèi)的根混合，作為根樣本的一個(gè)重復(fù)。3個(gè)處理（SF、SS、SR），共得到18組樣品，分別標(biāo)記為SF1、SF2、SF3、SS1、SS2、SS3、SR1、SR2、SR3。SF1、SF2、SF3分別表示一、二、三年生黨參土壤；SS1、SS2、SS3分別表示一、二、三年生黨參根際土壤；SR1、SR2、SR3分別表示一、二、三年生黨參根。所有樣品平均分成2份，一份保藏于?80 ℃用于高通量測(cè)序，一份保藏于?20 ℃用于理化性質(zhì)測(cè)定。

采集的黨參根部，分別用毛刷去除表面土壤，自來水沖洗干凈，利用0.1%次氯酸鈉表面消毒10 min，再用75%乙醇，消毒5 min，最后用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干表面水分，最后一次清洗水用于菌落檢查，將確定表面消毒徹底的根部保存在預(yù)先滅菌的離心管中，液氮速凍，置于?20 ℃冰箱中，用于后續(xù)的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)分析。

2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定參考《土壤農(nóng)化分析》[26]。土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）含量測(cè)定采用重鉻酸鹽濕法燃燒法；全氮（TN）測(cè)定采用凱氏定氮法；速效氮（AN）測(cè)定采用堿擴(kuò)散法；全磷（TP）含量測(cè)定采用鉬酸銨比色法；速效磷（AP）含量測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提-火焰分光光度法。全鉀（TK）含量測(cè)定采用氫氧化鈉熔融-火焰分光光度法[27]。速效鉀（AK）含量采用醋酸銨浸提-鉬銻抗比色法[28]。土壤含水率（MC）采用常規(guī)烘干恒重法測(cè)定[29]。

2.3 土壤微生物活性測(cè)定

土壤微生物生物量氮（MBN）和微生物生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸浸提法測(cè)定[30-33]。

2.4 土壤酶活性測(cè)定

土壤酶活性測(cè)定參考《土壤酶及其研究法》[32]。硝酸還原酶（nitrate reductase，NiRs）采用苯酚二磺酸比色法測(cè)定，纖維素酶（cellulase，CE）和蔗糖酶（sucrase，SUC）采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，過氧化氫酶（catalase，CAT）采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，土壤磷酸酶（soil phosphatase，PHP）采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NR）采用微量法測(cè)定，土壤蛋白酶（soil protease，PRO）采用茚三酮比色法測(cè)定。

2.5 DNA提取與PCR擴(kuò)增

從根部和土壤中提取總DNA。根樣本的16S用799F（5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’）和1193R（5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’）引物對(duì)V5-V7可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，土壤和根際土壤樣本的16S用341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有樣本的ITS用ITS1-1F-F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAA- GTAA-3’）和ITS1-1F-R（5’-GCTGCGTTCTT- CATCGATGC-3’）引物對(duì)ITS1-1F可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?8 ℃預(yù)變性1 min后，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，包括在98 ℃下孵育10 s，50 ℃下孵育30 s，在72 ℃時(shí)延長30 s，然后在72 ℃時(shí)延長5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳法純化回收。

2.6 文庫構(gòu)建與測(cè)序

根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina，San Diego，美國）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫。構(gòu)建文庫步驟如下：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對(duì)到預(yù)先訓(xùn)練好的13.8版本99%相似度的GREENGENES數(shù)據(jù)庫（16S rRNA）（根據(jù)引物對(duì)將數(shù)據(jù)庫分別聚集到V3V4和V4V5的區(qū)域）和8.2版本的UNITE數(shù)據(jù)庫（ITS）（根據(jù)引物對(duì)將數(shù)據(jù)庫分別聚集到ITS1、ITS3的區(qū)域），得到了物種的分類信息表[34]。之后用QIIME2 feature-table插件剔除了所有污染性的線粒體和葉綠體序列。

2.7 生物信息學(xué)分析

使用Qiime 2.0計(jì)算分析到物種的Chao1、Shannon、Simpson和Observed feature指數(shù)值，使用ANOVA分析α多樣性指數(shù)的組間差異?；赗的“Phyloseq”包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）分析，以可視化不同組之間樣本關(guān)系。Mantel test基于R的“vegan”包分析土壤養(yǎng)分與物種多樣性之間關(guān)系。應(yīng)用中性群落模型來評(píng)估細(xì)菌和真菌群落的組裝過程，中性群落模型用于通過預(yù)測(cè)微生物群落組裝的頻率之間的關(guān)系來確定隨機(jī)過程對(duì)微生物群落組裝的貢獻(xiàn)[35]。去除樣本發(fā)現(xiàn)率低于20%的物種，構(gòu)建共生網(wǎng)絡(luò)，選取豐度＞10%的模塊進(jìn)行標(biāo)記，并展示其top10門水平物種豐度，使用R的“vegan”“psych”和“igraph”包完成上述內(nèi)容。冗余分析（redundancy analysis，RDA）使用深圳微科盟云平臺(tái)繪制（https://www. bioincloud.tech）。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 不同生長年限黨參土壤理化性質(zhì)的變化

對(duì)不同生長年限黨參土壤和根際土壤的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和分析（表1），結(jié)果顯示測(cè)得的土壤理化因子中除SOM外，其余理化因子含量在各樣本中組間差異顯著（＜0.05）。不同生長年限的黨參根際土壤和土壤中TN含量組間差異顯著（＝5.293，＜0.01），根際土壤中的TN含量逐年增加，而土壤中SF2的TN含量最高。土壤中的TP含量、MC隨黨參種植年限的增加逐漸提高，而根際土壤中的相應(yīng)含量與之相反。不同生長年限黨參的土壤、根際土壤都呈弱堿性（pH 7.7～8.0）。MBN在一年生黨參的土壤和根際土壤中含量最高，而在二年生、三年生黨參相應(yīng)土壤中含量顯著降低，且隨種植時(shí)間的增加，含量逐漸降低。各土壤酶活性，僅NiRs表現(xiàn)出組間顯著差異（＝2.859，＜0.05），隨年限增加，NiRs含量分別在土壤、根際土壤中呈先減少后增加趨勢(shì)。PRO含量在土壤和根際土壤中隨時(shí)間序列，先增加后減少，且二年生黨參的土壤中NiRs含量高于根際土壤。

表1 各樣品土壤理化因子含量()

同行中數(shù)值后面的不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）；*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下同

Different lowercase letters after the values in the same line indicate significant differences. ANOVA:*< 0.05**< 0.01***< 0.001, same as below

3.2 不同生長年限黨參根系微生物群落組成及其多樣性

3.2.1 細(xì)菌群落組成及其多樣性 對(duì)不同生長年限黨參土壤、根際土壤和根樣品進(jìn)行細(xì)菌16S和真菌ITS高通量測(cè)序，土壤和根際土壤樣品采用同一引物擴(kuò)增16 S序列，而根樣品采用不同引物擴(kuò)增16S序列，結(jié)果顯示土壤樣本與植物樣本細(xì)菌注釋稍有差異。在質(zhì)量控制后，18個(gè)根樣本得到1 446 298個(gè)16 S的clean reads，27個(gè)土壤和根際土壤樣本得到2 240 267個(gè)16 S的clean reads，在97%分類水平下進(jìn)行OTU分類，根內(nèi)生細(xì)菌共獲得3287個(gè)OTU，分類學(xué)地位明確的細(xì)菌有25個(gè)門，68個(gè)綱，105個(gè)目，156個(gè)科，265個(gè)屬和150個(gè)種；根際土壤細(xì)菌共獲得20 522個(gè)OTU，分類學(xué)地位明確的細(xì)菌有49個(gè)門，140個(gè)綱，202個(gè)目，238個(gè)科，362個(gè)屬和179個(gè)種。不生長年限黨參土壤、根際土壤、根內(nèi)微生物組成差異顯著，選擇top10屬水平物種相對(duì)豐度進(jìn)行優(yōu)勢(shì)物種展示。圖1結(jié)果顯示土壤、根際土壤屬水平優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為（3.07%），根樣本中優(yōu)勢(shì)屬為（23.64%）。黨參生長過程中，土壤和根際土壤樣本中的各細(xì)菌物種占比處于動(dòng)態(tài)平衡，而根內(nèi)細(xì)菌屬的比例逐年減少，的比例逐年增加。

表中展示Shannon、Simpson、Observed features、Chao1 4個(gè)α多樣性指數(shù)（表2）。細(xì)菌的Shannon指數(shù)顯示，不同生長年限黨參土壤和根際土壤分別與根樣本組間差異顯著（＜0.001），土壤樣本Shannon指數(shù)高于根樣本。Chao1指數(shù)顯示土壤和根際土壤中組間差異顯著（＜0.001），土壤樣本的Chao1指數(shù)高于根樣本。圖2-A、B的PCoA顯示同年生黨參土壤和根際土壤細(xì)菌樣本聚集在一起，而不同年之間樣本分離（Permanova：＝2.294，＝0.001），解釋率為25.77%；不同生長年限黨參根細(xì)菌樣本分離（Permanova：＝2.303，＝0.001），解釋率為33.15%。

A-屬水平根系相關(guān)微生物群落組成 B-根內(nèi)細(xì)菌組成 C-土壤和根際土壤細(xì)菌組成

表2 根系微生物α多樣性指數(shù)()

3.2.2 真菌群落組成及其多樣性 測(cè)序質(zhì)量控制后，45個(gè)土壤樣本和根樣本得到3 537 408個(gè)ITS的clean reads。在97%分類水平下進(jìn)行OTU分類，所有樣本真菌共獲得3287個(gè)OTU，分類學(xué)地位明確的真菌有20個(gè)門，50個(gè)綱，113個(gè)目，259個(gè)科，599個(gè)屬和916個(gè)種。圖1-C結(jié)果顯示土壤、根際土壤和根內(nèi)屬水平優(yōu)勢(shì)真菌為（10.66%）、（9.98%）、（7.80%）、（6.64%）和（5.05%）。黨參生長過程中，真菌在三年生黨參的不同隔室中比例最高，在一年生黨參的不同隔室中比例最高。

A-根系微生物β多樣性基于Permanova的PCoA B-根內(nèi)細(xì)菌的PCoA C-土壤和根際土壤細(xì)菌的PCoA

真菌的Shannon指數(shù)顯示，不同生長年限黨參土壤和根際土壤分別與根樣本組間差異顯著（＜0.001），土壤樣本Shannon指數(shù)高于根樣本。Chao1指數(shù)顯示不同生長年限黨參根內(nèi)細(xì)菌和真菌組間差異不顯著，而各樣本中細(xì)菌的Chao1指數(shù)明顯高于真菌。圖2-C的PCoA顯示不同生長年限的黨參土壤和根際土壤樣本的真菌聚集在一起，根樣本聚集在一起（Permanova：＝4.448，＝0.001），解釋率為36.93%。

3.3 不同生長年限的黨參根系微生物菌群分布

3.3.1 細(xì)菌菌群分布 中性群落模型表明隨機(jī)過程在土壤和根際土壤細(xì)菌群落組裝過程中占主導(dǎo)作用。圖3-A結(jié)果顯示中性模型分別解釋了一年生、二年生、三年生土壤和根際土壤細(xì)菌85%、90.6%、90.2%的群落變化，其中二年生黨參土壤細(xì)菌擴(kuò)散能力高于一年生和三年生細(xì)菌。隨機(jī)過程主導(dǎo)了土壤和根際土壤細(xì)菌的群落構(gòu)建，二年生黨參隨機(jī)過程的相對(duì)貢獻(xiàn)最大。根內(nèi)細(xì)菌受隨機(jī)過程影響最大（圖3-B），中性模型分別解釋了一年生、二年生、三年生根內(nèi)細(xì)菌65.4%、79.7%、79%的群落變化，而二年生黨參根內(nèi)細(xì)菌擴(kuò)散能力也高于一年生和三年生細(xì)菌。

3.3.2 真菌菌群分布 真菌群落組裝的隨機(jī)性過程的貢獻(xiàn)度低于細(xì)菌。中性模型分別解釋了一年生、二年生、三年生黨參根系真菌61.7%、64.3%、66.7%的群落變化，其中三年生黨參根系真菌擴(kuò)散能力高于一年生和二年生真菌?；谏鷳B(tài)位寬度的觀察，圖3-B結(jié)果顯示土壤細(xì)菌和根內(nèi)細(xì)菌的生態(tài)位寬度隨生長年限的增加而增加，相對(duì)于其他2種根際土壤，二年生黨參根際土壤細(xì)菌的生態(tài)位寬度更高。對(duì)于真菌而言，土壤和根際土壤生態(tài)位寬度變化趨勢(shì)相同，隨生長年限的增加，生態(tài)位寬度先增加后減少，這與根際土壤細(xì)菌的變化趨勢(shì)相同。根內(nèi)真菌的生態(tài)位寬度最小。

3.4 不同生長年限黨參根系微生物與土壤環(huán)境因子的相關(guān)性

不同生長年限黨參根系微生物的組成和多樣性受環(huán)境因素驅(qū)動(dòng)，進(jìn)一步探究強(qiáng)相關(guān)性的環(huán)境因子的驅(qū)動(dòng)作用，進(jìn)行如下分析。圖4為分別以土壤和根際土壤微生物為一組，根內(nèi)微生物為一組的物種組成與環(huán)境因子的Mantel分析。圖4-A結(jié)果顯示，土壤和根際土壤的細(xì)菌物種與SUC、TN、AK、MC、MBN呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與CAT呈顯著負(fù)相關(guān)（＝0.91），且AK與TN之間有強(qiáng)相關(guān)性，真菌與PHP、TN、MC呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與NR呈顯著負(fù)相關(guān)（＝1.00）。圖4-B結(jié)果顯示，根內(nèi)細(xì)菌物種與NiRs、TN呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與CE呈顯著負(fù)相關(guān)（＝0.95），真菌與PHP、NiRs、TN、MBC、SOM呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與SUC呈顯著負(fù)相關(guān)（＝0.95）。

選取屬水平優(yōu)勢(shì)微生物與環(huán)境因子進(jìn)行RDA，結(jié)果如圖5所示。圖5-A顯示RDA1和RDA2共解釋該模型的23.63%，TN（＝0.007）、AK（＝0.001）和WC（＝0.001）是影響不同生長年限黨參土壤和根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要影響因素。AK與和呈顯著正相關(guān)，TN與呈顯著正相關(guān)。圖5-B顯示RDA1和RDA2共解釋該模型的20.46%，PRO（＝0.003）、AK（＝0.006）、AP（＝0.001）和SOM（＝0.001）是影響不同生長年限黨參根內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要因素，PRO和AK與呈顯著正相關(guān)，而AP和SOM與呈顯著正相關(guān)。圖5-C顯示RDA1和RDA2共解釋該模型的21.92%，TN（＝0.033）和TK（＝0.011）是影響不同生長年限黨參根系真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要因素，TN與呈顯著正相關(guān)，pH與呈顯著正相關(guān)。

SF-SS-土壤和根際土壤 SR-根內(nèi) C1-一年生黨參 C2-二年生黨參 C3-三年生黨參

A-根系相關(guān)微生物與環(huán)境因子的相關(guān)性 B-土壤和根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性與環(huán)境因子的Mantel分析

A-根系屬水平優(yōu)勢(shì)物種與環(huán)境因子的RDA B-根內(nèi)細(xì)菌與環(huán)境因子的RDA C-土壤和根際土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與環(huán)境因子的RDA

3.5 共生網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步探究不同生長年限黨參根系相關(guān)微生物之間的相互關(guān)系，對(duì)不同樣本繪制共生網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。將節(jié)點(diǎn)按照模塊化分組并以不同顏色填充，圖6顯示，細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)圖共分為9個(gè)模塊，真菌網(wǎng)絡(luò)圖共分為5個(gè)模塊，土壤和根際土壤細(xì)菌共有155個(gè)節(jié)點(diǎn)和497條邊，根內(nèi)細(xì)菌有78個(gè)節(jié)點(diǎn)和131條邊，真菌共有120個(gè)節(jié)點(diǎn)和1465條邊。表3顯示土壤和根際土壤細(xì)菌的模塊化系數(shù)最高，為0.645，真菌的模塊化系數(shù)最低，為0.165。平均聚類系數(shù)最高的是真菌，為0.704，最低的是根內(nèi)細(xì)菌，為0.384。平均加權(quán)度最高的是真菌，為16.811，最低的是根內(nèi)細(xì)菌，為2.609。

4 討論

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在本研究中，不同生長年限黨參土壤和根際土壤pH值呈弱堿性（pH值7.7～8.0），理想黨參生長pH值為弱酸性或中性[36]，有研究表明，受空間格局和季節(jié)變化的影響，甘肅省大多數(shù)土壤情況為堿性沉淀[37]。除SOM外，所測(cè)土壤理化因子存在組間差異（＜0.05），二年生和三年生非根際土壤、根際土壤樣本的MBN含量都低于一年生樣本，且表現(xiàn)顯著差異（＜0.05），可能與土壤物種多樣性有關(guān)，有研究表明高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤細(xì)菌和真菌多樣性與土壤微生物生物量呈負(fù)相關(guān)[38]，微生物生物量和群落組成而非多樣性也會(huì)影響多年生苜蓿根際土壤的氮含量[39]。SOM含量在不同生長年限黨參土壤樣本中表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)穩(wěn)定，可能與腐生微生物組成和氮磷肥的施用有關(guān)。

A-黨參根系微生物的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò) B-土壤和根際土壤細(xì)菌的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò) C-根內(nèi)細(xì)菌的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)

表3 共生網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

不同生長年限黨參根系優(yōu)勢(shì)微生物豐度處于動(dòng)態(tài)變化之中，這種動(dòng)態(tài)變化可能導(dǎo)致代謝物差異和積累。許多內(nèi)生菌，如、和也有利于藥用植物中人參皂苷、倍半萜和生物堿的生成[40]。根部微生物群落變化除微生物間相互作用外，也受植物生長階段的影響，例如不同豆科植物在種植過程中，根瘤內(nèi)生菌的富集遵循分級(jí)過濾，根瘤內(nèi)生菌的細(xì)菌群落根據(jù)植物種類發(fā)生變化[41-42]。從土壤向根內(nèi)圈過渡，物種多樣性和豐度減少，隨黨參生長年限增加，物種多樣性和豐度也有減少趨勢(shì)，有研究表明草莓和馬鈴薯在種植的不同年根際群落表現(xiàn)出不同[43]，這表明黨參根系具有一般植物根系微生物的共性。在不同生長的黨參根際土壤中，本研究發(fā)現(xiàn)了一些植物促進(jìn)生長的根際細(xì)菌（PGPR），例如和[44]?？梢援a(chǎn)生鐵載體和胞外多糖，有助于調(diào)節(jié)離子平衡、在植物組織中運(yùn)輸水分并抑制病原微生物生長[45]，這可能解釋了黨參生長早期病原菌豐度低的原因。觀察不同生長年限黨參根系微生物群落組裝過程，結(jié)果顯示群落組裝過程受隨機(jī)性過程影響，二年生黨參根系細(xì)菌和三年生黨參根系真菌受隨機(jī)性影響更大，在同一種植基地栽培的黨參，生長環(huán)境相似，隨機(jī)過程可能會(huì)壓倒確定性過程[46]。此外，在群落水平對(duì)不同生長年限根系生態(tài)寬度進(jìn)行分析，結(jié)果表明根內(nèi)細(xì)菌和真菌相比土壤和根際土壤表現(xiàn)出更窄的生態(tài)位寬度，有研究表明，具有更廣泛生態(tài)位寬度的群落受環(huán)境因素影響較小[47]。

不同生長年限植物可以保護(hù)耕地土壤，減少土壤流失和水分流失[48]，也可能導(dǎo)致環(huán)境因素驅(qū)動(dòng)微生物群落影響轉(zhuǎn)變。土壤理化因子與黨參根系微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性顯著相關(guān)，在本研究中，分析結(jié)果顯示與TN呈顯著正相關(guān)，可能是具有促進(jìn)黨參根系吸收氮元素的功能，有研究表明促進(jìn)植物固氮和增加非生物脅迫耐受性[49]。AK與和呈顯著正相關(guān)，其作為植物促生菌具有良好的解鉀作用[50]。TN與呈顯著正相關(guān)，由此推測(cè)該病原菌會(huì)因有機(jī)質(zhì)增加或隨土壤中氮含量下降而降低[51-52]。

土壤和根際土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜度高于根內(nèi)細(xì)菌，植物的根系分泌物可能改變了根內(nèi)菌和根際土壤細(xì)菌群落的組成。根際真菌群落被認(rèn)為對(duì)植物健康至關(guān)重要[53]。在本研究中，病原菌占總體注釋物種的29.94%，土壤和根際土壤中含有植物病原菌豐度高于根內(nèi)，而且屬作為引起根腐病的病原菌，在三年生黨參中豐度最高，該物種在多種作物包括小麥[54]、菠蘿[55]、馬鈴薯[56]中存在。在植物生長早期的集約化管理農(nóng)業(yè)土壤中，真菌主要定殖于健康的植物根系[57]，而在后期階段，病原體逐漸積累，聚集于根內(nèi)。排泄物腐生菌在土壤和根際土壤中的含量高于根內(nèi)，可能與糞肥的施用和腐殖質(zhì)的含量有關(guān)。綜上，本研究通過甘肅地區(qū)不同生長年限黨參根系樣本分析，探討了不同生長年限黨參根系土壤的理化性質(zhì)和根系相關(guān)微生態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了在黨參生長過程中，對(duì)根系微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有顯著影響的土壤環(huán)境因子，為后續(xù)深入研究黨參病害防治，提高黨參品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 周武先, 熊琳珂, 張雅娟, 等. 化感作用對(duì)川黨參種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2022, 54(11): 76-85.

[2] 李芳, 楊扶德. 黨參多糖提取分離、化學(xué)組成和藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2023, 41(4): 42-49.

[3] Bai R B, Li W Y, Li Y D,. Cytotoxicity of two water-soluble polysaccharides fromNannf. var.(Nannf.) L. T. Shen against human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its mechanism [J]., 2018, 120(Pt B): 1544-1550.

[4] 李成義, 劉書斌, 李碩, 等. 甘肅黨參栽培現(xiàn)狀調(diào)查分析 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2016, 18(1): 102-105.

[5] Li Y M, Liu Y, Zhang H,. The composition of root-associated bacteria and fungi ofand their relationship with the bioactive ingredients [J]., 2021, 12: 642730.

[6] 姜茗軒, 張紅兵, 李冉, 等. 金銀花主要活性成分及內(nèi)生菌研究進(jìn)展 [J]. 河北省科學(xué)院學(xué)報(bào), 2022, 39(5): 7-13.

[7] 丁兆軍, 白洋. 根系發(fā)育和微生物組研究現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢(shì) [J]. 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2021, 51(10): 1447-1456.

[8] Zheng Q, Hu Y T, Zhang S S,. Soil multifunctionality is affected by the soil environment and by microbial community composition and diversity [J]., 2019, 136: 107521.

[9] 祝蕾, 嚴(yán)輝, 劉培, 等. 藥用植物根際微生物對(duì)其品質(zhì)形成的影響及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(13): 4064-4073.

[10] 王繼蓮, 李明源, 周茜, 等. 鹽脅迫下植物與根際微生物互作研究進(jìn)展 [J]. 北方園藝, 2021(17): 143-149.

[11] 全鑫, 楊艷艷, 梁娟, 等. 小麥-玉米輪作一體化保護(hù)栽培期間土壤微生物群落變化 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32(12): 132-138.

[12] Li Y Y, Dang H, Lv X,. High-throughput sequencing reveals rhizosphere fungal community composition and diversity at different growth stages ofin the lower reaches of the Tarim River [J]., 10: e13552.

[13] 冼康華, 蘇江, 付傳明, 等. 不同生長年限華重樓根際土壤微生物多樣性研究 [J]. 廣西植物, 2022, 42(12): 2087-2098.

[14] 李勇, 應(yīng)益昕, 趙東岳, 等. 人參及西洋參栽培土壤微生物種群遺傳多樣性的RAPD分析 [J]. 中草藥, 2010, 41(11): 1871-1875.

[15] Li X G, Ding C F, Zhang T L,. Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing [J]., 2014, 72: 11-18.

[16] 劉詩蓉, 王紅蘭, 孫輝, 等. 半夏連作對(duì)根際土壤微生物群落的影響研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(4): 1148-1155.

[17] 吳清瑩, 林宇龍, 孫一航, 等. 根系分泌物對(duì)植物生長和土壤養(yǎng)分吸收的影響研究進(jìn)展 [J]. 中國草地學(xué)報(bào), 2021, 43(11): 97-104.

[18] 李敏, 趙熙州, 王好運(yùn), 等. 干旱脅迫及外生菌根菌對(duì)馬尾松幼苗根系形態(tài)及分泌物的影響 [J]. 林業(yè)科學(xué), 2022, 58(7): 63-72.

[19] 李月明, 楊帆, 韓沛霖, 等. 植物根系分泌物響應(yīng)非生物脅迫機(jī)理研究進(jìn)展 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2022, 28(5): 1384-1392.

[20] Hobson D J, Harty M A, Langton D,. The establishment of winter wheat root system architecture in field soils: The effect of soil type on root development in a temperate climate [J]., 2023, 39(1): 198-208.

[21] Langenfeld A, Prado S, Nay B,. Geographic locality greatly influences fungal endophyte communities in[J]., 2013, 117(2): 124-136.

[22] Zhou Y, Coventry D R, Gupta V V S R,. The preceding root system drives the composition and function of the rhizosphere microbiome [J]., 2020, 21(1): 89.

[23] 楊陽, 李海亮, 馬凱麗, 等. 連作對(duì)黨參根際土壤理化性質(zhì)、微生物活性及群落特征的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2023: 1-15.

[24] 楊?yuàn)檴? 仲彩萍, 王儀, 等. 草甘膦對(duì)黨參生長根腐病及根際土壤微生物的影響 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2022, 24(10): 1932-1938.

[25] Dong Y M, Gao M L, Qiu W W,. Effect of microplastics and arsenic on nutrients and microorganisms in rice rhizosphere soil [J]., 2021, 211: 111899.

[26] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析 [M]. 第3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 26.

[27] Bremner J M, Mulvaney C S.[M] Madison: Agronomy Monographs, 2015: 595-624.

[28] Olsen B S R.[M]. Washington D C: U.S. Dept. of Agriculture, 1954: 23.

[29] Lu R.[M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 1999, 107: 147-68.

[30] Jenkinson D S, Powlson D S. The effects of biocidal treatments on metabolism in soil—V [J]., 1976, 8(3): 209-213.

[31] Brookes P C, Landman A, Pruden G,. Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: A rapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil [J]., 1985, 17(6): 837-842.

[32] 關(guān)松蔭. 土壤酶及其研究法 [M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1986: 56.

[33] Gil-Sotres F, Trasar-Cepeda C, Leirós M C,. Different approaches to evaluating soil quality using biochemical properties [J]., 2005, 37(5): 877-887.

[34] Bokulich N A, Kaehler B D, Rideout J R,. Optimizing taxonomic classification of marker-gene amplicon sequences with QIIME 2’S q2-feature-classifier plugin [J]., 2018, 6(1): 90.

[35] Sloan W T, Lunn M, Woodcock S,. Quantifying the roles of immigration and chance in shaping prokaryote community structure [J]., 2006, 8(4): 732-740.

[36] Moon K G, Um I S, Jeon S H,. Effect of organic fertilizer application on growth characteristics and saponin content in[J]., 2018, 59(1): 125-130.

[37] Zhang F X. Spatial pattern and seasonal variation of alkaline precipitation observed in the Gansu Province, NW China [J]., 2019, 78(14): 1-11.

[38] Zhang Y, Dong S K, Gao Q Z,. Soil bacterial and fungal diversity differently correlated with soil biochemistry in alpine grassland ecosystems in response to environmental changes [J]., 2017, 7: 43077.

[39] 孫建波, 暢文軍, 李文彬, 等. 香蕉不同生育期根際微生物生物量及土壤酶活的變化研究 [J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2022, 31(6): 1169-1174.

[40] Dong L L, Li Y, Xu J,. Biofertilizers regulate the soil microbial community and enhanceyields [J]., 2019, 14: 20.

[41] Xiao X A, Chen W M, Zong L,. Two cultivated legume plants reveal the enrichment process of the microbiome in the rhizocompartments [J]., 2017, 26(6): 1641-1651.

[42] Wang P P, Yang L F, Sun J L,. Structure and function of rhizosphere soil and root endophytic microbial communities associated with root rot of[J]., 2022, 12: 752683.

[43] Murphy C, Foster B, Gao C L. Temporal dynamics in rhizosphere bacterial communities of three perennial grassland species [J]., 2016, 6(1): 17.

[44] Backer R, Rokem J S, Ilangumaran G,. Plant growth-promoting rhizobacteria: Context, mechanisms of action, and roadmap to commercialization of biostimulants for sustainable agriculture [J]., 2018, 9: 1473.

[45] Bhandari P, Garg N. Plant-microbe communication: New facets for sustainable agriculture [A] // Singh D, Gupta V, Prabha R.[M]. Singapore: Springer, 2019: 547-573.

[46] Wang J J, Shen J, Wu Y C,. Phylogenetic beta diversity in bacterial assemblages across ecosystems: Deterministic versus stochastic processes [J]., 2013, 7(7): 1310-1321.

[47] Jiao S, Yang Y F, Xu Y Q,. Balance between community assembly processes mediates species coexistence in agricultural soil microbiomes across Eastern China [J]., 2020, 14(1): 202-216.

[48] Salah A M A, Prasse R, Marschner B. Intercropping with native perennial plants protects soil of arable fields in semi-arid lands [J]., 2016, 130: 1-13.

[49] Zboralski A, Filion M. Genetic factors involved in rhizosphere colonization by phytobeneficialspp. [J]., 2020, 18: 3539-3554.

[50] 黃濤. 玉米根際促生細(xì)菌的篩選及其促生機(jī)理初步研究 [D]. 沈陽: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019.

[51] 曾廣娟, 馮陽, 吳舒, 等. 基于高通量測(cè)序的有機(jī)種植蔬菜地土壤微生物多樣性分析 [J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2022, 53(9): 2403-2414.

[52] Li H Y, Qiu Y Z, Yao T,. Nutrients available in the soil regulate the changes of soil microbial community alongside degradation of alpine meadows in the northeast of the Qinghai-Tibet Plateau [J]., 2021, 792: 148363.

[53] 任氫欣, 曾齊, 張必弦, 等. 基于高通量測(cè)序的大豆根際真菌群落動(dòng)態(tài)變化分析 [J]. 分子植物育種, 2021, 19(14): 4836-4845.

[54] 李燕, 張玉鳳, 林海濤, 等. 木醋液對(duì)小麥根腐病致病菌及小麥發(fā)芽的影響 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 49(4): 96-99.

[55] Ibrahim N F, Mohd M H, Mohamed Nor N M I,. Characterization ofspp. associated with pineapple fruit rot and leaf spot in[J]., 2017, 165(11/12): 718-726.

[56] 姚凡, 王喜剛, 郭成瑾, 等. 繩狀青霉P-19不同固體發(fā)酵浸提液對(duì)馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌的抑制作用 [J]. 植物保護(hù), 2022, 48(6): 368-373.

[57] Loit K, Soonvald L, Astover A,. Temporal and cultivar-specific effects on potato root and soil fungal diversity [J]., 2020, 10(10): 153.

Root microbial community structure and diversity ofin different growth years

MENG Tong-tong1, 3, CUI Xing-shuai2, ZHU Ning2, LENG Fei-fan2, WANG Yong-gang2, CHEN Ji-xiang1, 2

1. College of Energy and Power Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 2. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 3. Gansu Water Conservancy Research Institute, Lanzhou 730050, China

To explore the changes of root microbial community structure of Dangshen [(Franch.) Nannf.] in different growth years and its correlation with soil environmental factors in order to improve the quality of.The soil, rhizosphere soil and roots ofin the first, second and third years were analyzed by high-throughput sequencing and bioinformatics.With the increase of growth years of, theof dominant bacteria in soil and rhizosphere soil was in dynamic balance, while the abundance of bacterialin root was decreased. The abundance of fungalin soil and rhizosphere soil decreased year by year, while the abundance of pathogenic fungusinroot increased year by year. The microbial community assembly ofroots with different growth years is more affected by random processes, and the functional stability of root bacteria is higher than that of fungi. Protease, total nitrogen, available potassium, water content, available phosphorus and soil organic matter are the main factors affecting the bacterial community structure and diversity ofroots in different growth years. Total nitrogen and total potassium are main factors affecting the structure and diversity of fungal community.The composition and diversity of root microbial community ofchanged with the growth years, and responded to different soil environmental factors, which provided a theoretical basis for the later in-depth study ofdisease control and improving its quality.

(Franch.) Nannf.; high-throughput sequencing; environmental factors; root system; microbial diversity

R286.12

A

0253 - 2670(2023)15 - 4992 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.024

2022-12-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（32160066）；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20JR5RA475）；蘭州理工大學(xué)青年人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（2018）

孟彤彤，男，博士研究生，研究方向?yàn)樗Y源利用與環(huán)境工程。E-mail: 61734210@qq.com

通信作者：陳吉祥，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境工程研究。E-mail: chenjixiang@lut.edu.cn

王永剛，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生態(tài)效應(yīng)對(duì)藥用植物生長及代謝物研究。E-mail: wangyg@lut.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]