基于HPLC-CAD法對(duì)羅漢果配方顆粒特征圖譜的研究

楊學(xué)芳 蘇萬(wàn)福 吳 菲

（1.濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225441；2.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225321）

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang 的干燥果實(shí)，味甘、性涼，歸肺、大腸經(jīng)，具有清熱潤(rùn)肺、利咽開(kāi)音、滑腸通便的功效［1］，作為衛(wèi)生部首批公布的藥食同源的中藥材之一，其素有“良藥佳果”之稱。羅漢果本身含有三萜苷類、黃酮類、多糖類、油脂類等多種化學(xué)成分，研究結(jié)果［2，3］表明，其具有潤(rùn)肺止咳、潤(rùn)腸通便、降糖調(diào)脂、保肝、抗氧化等多種藥理作用。臨床上多用于治療支氣管炎、肺炎、哮喘、高血壓病等疾病，此外還可防治冠心病、血管硬化、肥胖癥等。

羅漢果配方顆粒是以羅漢果飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)提取、濃縮、干燥、制粒而成的供臨床配方用的顆粒劑。與傳統(tǒng)湯劑相比，配方顆粒不但可以滿足醫(yī)生辨證論治、隨證加減的需求，還省去了每次煎煮的繁瑣步驟，并且方便保存和攜帶；對(duì)患者而言，因服用量少，故依從性也有較大改善［4，5］。雖然配方顆粒在臨床應(yīng)用上有很多優(yōu)點(diǎn)，但其質(zhì)量控制方面還處于不斷完善的過(guò)程［6］。目前已有報(bào)道的羅漢果配方顆粒的質(zhì)量研究為薄層鑒別及單一含量的質(zhì)量控制［7］，而從藥物整體進(jìn)行的特征圖譜研究未見(jiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜-電噴霧檢測(cè)（HPLC-CAD）法建立了基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑［5，8］的羅漢果配方顆粒特征圖譜的檢測(cè)方法［9，10］，能夠?qū)α_漢果配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行更為全面的控制和整體評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Thermo U3000高效液相色譜儀，四元泵，配置CAD 檢測(cè)器，Chromeleon 7.2 SR5 色譜工作站（賽默飛世爾科技有限公司）；SY8200-T 超聲波清洗機(jī)（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）；XSE205DU 電子天平（METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥羅漢果對(duì)照藥材（批號(hào)121020-201306）和羅漢果皂苷Ⅴ對(duì)照品（批號(hào)111754-201703）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；羅漢果標(biāo)準(zhǔn)湯劑（自制，批號(hào)190322、190324、190326、20200820、20200821、20200822、20200823、20200824、20200825、200401、200402、200403、200404、200405、200406，前9 批飲片產(chǎn)地為廣西，后6批飲片產(chǎn)地為廣東）；羅漢果配方顆粒（自 制，批 號(hào) 1906013、2003013、2003023、2003033）。甲醇（默克股份兩合有限公司，批號(hào)I1082407013，每瓶4 L）、乙腈（默克股份兩合有限公司，批號(hào)JA089730，每瓶4 L）均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照藥材及對(duì)照品參照物溶液取羅漢果對(duì)照藥材1.0 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率720 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。另精密稱取羅漢果皂苷Ⅴ對(duì)照品10 mg，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品參照物溶液。

2.1.2 供試品溶液取本品適量，研細(xì)，取約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率720 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)采用Agilent Po?roshell 120 HILIC-Z（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱；乙腈-甲醇（9∶1）為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，線性梯度洗脫（0～3 min，97%A；3～5 min，97%A→90%A；5～10 min，90%A；10～23 min，90%A→65%A；23～25 min，65%A→5%A；25～35 min，5%A；35～38 min，5%A→97%A；38～45 min，97%A）；流速為0.9 mL/min；柱溫為25 ℃；電噴霧檢測(cè)器（CAD），霧化溫度為35 ℃。對(duì)照品參照物溶液進(jìn)樣10 μL，對(duì)照藥材參照物溶液及供試品溶液進(jìn)樣5 μL。

2.3 精密度試驗(yàn)取羅漢果配方顆粒1.0 g（批號(hào)1906013），按2.1.2 項(xiàng)方法制備供試品溶液，2.2 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄HPLC 色譜圖。以6號(hào)峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其中相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.1%～0.2%，相對(duì)峰面積RSD 為1.0%～3.9%，表明該儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)取羅漢果配方顆粒1.0 g（批號(hào)1906013），按2.1.2項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，2.2項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖，以6號(hào)峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，其中相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.1%～0.3%，相對(duì)峰面積RSD為1.2%～3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取羅漢果配方顆粒1.0 g（批號(hào)1906013），按2.1.2 項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.2 項(xiàng)色譜條件分別于制備后的0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖，以6號(hào)峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，其中相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.3%～1.0%，相對(duì)峰面積RSD 為1.6%～4.7%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 特征圖譜建立及共有峰的標(biāo)定分別取羅漢果皂苷Ⅴ、羅漢果對(duì)照藥材、15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑及4 批羅漢果配方顆粒，按2.1.1、2.1.2 項(xiàng)方法制備對(duì)照品、對(duì)照藥材及供試品溶液，按2.2 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以6 號(hào)峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 15批羅漢果標(biāo)準(zhǔn)湯劑及4批顆粒各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表2 15批羅漢果標(biāo)準(zhǔn)湯劑及4批顆粒各共有峰的相對(duì)峰面積

將15 批羅漢果標(biāo)準(zhǔn)湯劑及4 批配方顆粒的HPLC 圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版，以1906013 批為參照?qǐng)D譜，通過(guò)多點(diǎn)校正及Mark 峰匹配進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，羅漢果配方顆粒特征圖譜有6 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1、圖2，其中峰6 為羅漢果皂苷Ⅴ。各批次間相似度均大于0.90，相似度良好。15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑、4批配方顆粒與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.996～1.000，見(jiàn)表3。

圖1 15批羅漢果標(biāo)準(zhǔn)湯劑及4批配方顆粒特征圖譜

圖2 羅漢果配方顆粒特征圖譜-對(duì)照?qǐng)D譜

表3 15批羅漢果標(biāo)準(zhǔn)湯劑及4批顆粒相似度結(jié)果匯總

3 討論

3.1 特征峰的確認(rèn)研究過(guò)程中，供試品色譜中呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，選擇保留時(shí)間適中且為檢測(cè)指標(biāo)成分的羅漢果皂苷Ⅴ作為S 峰。計(jì)算1～5 號(hào)峰與S 峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)合15 批湯劑及4 批配方顆粒成品6 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間范圍，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍之內(nèi)，規(guī)定值為：0.256（峰1）、0.328（峰2）、0.357（峰3）、0.483（峰4）、0.585（峰5）。

3.2 色譜柱的選擇羅漢果中含有皂苷、黃酮、多糖等多種成分［2，11，12］，且極性偏大，采用常規(guī)反相C18柱的分離模式，色譜峰較為集中，分離度不好，故建議采用親水相互作用色譜HILIC 模式進(jìn)行分離［13］。本研究中選用Agilent Poroshell 120 HILIC-Z （100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱，為HILIC 兩性模式，各色譜峰保留時(shí)間適宜，分離度較好。

3.2 檢測(cè)器的選擇研究過(guò)程中，嘗試使用紫外檢測(cè)器，結(jié)果顯示各峰響應(yīng)較低。后續(xù)更改為CAD 檢測(cè)器，基線平穩(wěn)、靈敏度高、峰形較好。CAD 是一種新型通用型檢測(cè)器，其響應(yīng)不受化合物紫外吸收基團(tuán)的影響，僅與分析物顆粒的質(zhì)量有關(guān)，廣泛應(yīng)用于各類小分子、大分子化合物，且對(duì)大多數(shù)化合物的響應(yīng)一致，具有檢測(cè)限低、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)［14，15］，但由于其本身的設(shè)計(jì)為電噴霧式檢測(cè)器，故流動(dòng)相中不可加入揮發(fā)性差的試劑，建議首選乙腈、甲醇、水等溶劑。

綜上所述，采用HPLC-CAD 法建立的特征圖譜檢測(cè)方法，可以用于羅漢果配方顆粒的質(zhì)量控制，為羅漢果配方顆粒的全面質(zhì)量研究和標(biāo)準(zhǔn)制定提供了技術(shù)支撐。