黃芪桂枝五物湯對(duì)糖尿病大鼠心肌梗死后心肌重塑及TGF-β1/Smad3通路的影響

彭奮飛,陳月銀

(廣東省第二中醫(yī)院,廣東 廣州 510095)

糖尿病是目前臨床中常見(jiàn)的代謝疾病,如果血糖長(zhǎng)期控制不佳,可導(dǎo)致心肌梗死等多種心血管疾病發(fā)生[1-2]。心肌梗死發(fā)生后,心肌組織因缺血損傷會(huì)引發(fā)心室壁增厚、心室容積改變等心肌重塑[3-4],嚴(yán)重影響患者心功能,危及患者生命。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smad3通路是細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖過(guò)程中的重要信號(hào)通路,與心肌重塑的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[5-6],調(diào)節(jié)該通路可能是抑制心肌重塑的有效途徑。黃芪桂枝五物湯是經(jīng)典名方,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方對(duì)糖尿病周?chē)窠?jīng)病變有明顯保護(hù)作用[7-8],其對(duì)糖尿病心肌梗死后心肌重塑是否有影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)基于TGF-β1/Smad3通路探討了黃芪桂枝五物湯對(duì)糖尿病大鼠心肌梗死后心肌重塑的影響,旨在為糖尿病合并心肌梗死后心肌重塑的治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠72只,8周齡,體重200～220 g,購(gòu)自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司,許可證號(hào):SCXK(粵)2021-0057。大鼠飼養(yǎng)于廣東省第二中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房,溫度20～24 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),充分保障了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利。

1.2試劑 黃芪桂枝五物湯由黃芪9 g、桂枝9 g、芍藥9 g、生姜18 g、大棗4枚組成,藥材飲片購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)(批號(hào)分別為190902,191011,191126,190809,191105),將藥材飲品置于1 500 mL水中浸泡4 h,煎煮1.5 h,過(guò)濾,將藥材殘?jiān)俅沃糜? 000 mL水中煎煮1 h,過(guò)濾,合并2次濾液,濃縮成生藥含量為1 g/mL,備用;福辛普利(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):191101);鏈脲佐菌素(STZ,貨號(hào):IS0250)、牛血清白蛋白(貨號(hào):A8010)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BCA試劑盒(碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):P0012);一氧化氮(NO)試劑盒(上海晅科生物科技有限公司;貨號(hào):XK-E10867);內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)試劑盒(貨號(hào):YLK-EDS338,優(yōu)利科生命科學(xué)有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(貨號(hào):ER1878,武漢菲恩生物科技有限公司);內(nèi)皮素(ET)試劑盒(貨號(hào):EK-R37841,北京博沃爾斯生物科技有限公司);RNA提取試劑盒(貨號(hào):R0011)及PCR試劑盒(貨號(hào):D7260)購(gòu)自碧云天生物科技公司;GAPDH(貨號(hào):ab181602)、TGF-β1(貨號(hào):ab215715)、Smad3(貨號(hào):ab40854)兔抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào):ab6734)購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;p-Smad3兔抗體(貨號(hào):abs130987)購(gòu)自愛(ài)必信生物科技有限公司;PCR引物設(shè)計(jì)及合成(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3設(shè)備及儀器 Sigma Vet超聲診斷儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);Microvent小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);EZⅢ血糖儀(艾康生物技術(shù)有限公司);BS-350S全自動(dòng)生化分析儀(南京貝登醫(yī)療股份有限公司);GIS-500凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司);DMi8熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取大鼠12只作為空白組,其余大鼠首先參照文獻(xiàn)[9]方法建立糖尿病模型:高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后,腹腔注射STZ 65 mg/kg,72 h后大鼠禁食12 h,取尾靜脈血測(cè)定血糖,以血糖>11.1 mmol/L視為造模成功。糖尿病造模完成后,參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行心肌梗死模型的建立:大鼠禁食8 h后使用異氟烷進(jìn)行麻醉,胸部備皮,消毒,開(kāi)放胸腔,連接呼吸機(jī),設(shè)定潮氣量為40 mL/kg,呼吸頻率為60次/min,呼吸比率1∶2,使用尼龍繩結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支,關(guān)閉胸腔同時(shí)吸盡胸腔空氣,保持胸腔負(fù)壓,并按照20 000 IU/kg劑量腹腔注射慶大霉素,1次/d,連續(xù)3 d。將50只造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、福辛普利組及黃芪桂枝五物湯低、中、高劑量組,每組10只。黃芪桂枝五物湯低、中、高劑量組分別給予黃芪桂枝五物湯2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg灌胃(給藥劑量參考文獻(xiàn)[7]設(shè)定),福辛普利組給予福辛普利4 mg/kg灌胃(給藥劑量參考文獻(xiàn)[11]設(shè)定),空白組及模型組給予等量生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)8周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1心功能指標(biāo) 末次灌胃24 h后,將大鼠麻醉并仰臥位固定在操作臺(tái)上,使用超聲診斷儀測(cè)定左心室短軸縮短率(LVFS)及左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),每只大鼠測(cè)量3次。

1.5.2血清心肌損傷指標(biāo)及血糖、糖化血紅蛋白水平 超聲檢測(cè)后,取腹主動(dòng)脈血3 mL,使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、腦鈉肽(BNP)、血糖及糖化血紅蛋白水平。

1.5.3心肌組織中NO、eNOS、MDA及ET含量頸椎脫臼處死大鼠,分離心肌組織,研磨勻漿并充分裂解后,4 ℃下8 000 r/min離心10 min,取上清液,使用ELISA試劑盒測(cè)定NO、eNOS、MDA、ET含量。

1.5.4心肌組織病理學(xué)形態(tài) 取大鼠梗死區(qū)心肌組織,置于4%中性甲醛中固定,石蠟包埋后制成5 μm切片,HE染色并在顯微鏡下觀察。

1.5.5心肌組織中TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)情況 取大鼠梗死區(qū)心肌組織,用組織裂解液充分裂解,提取總蛋白,BCA試劑盒定量后取蛋白含量為40 μg的裂解液,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上,牛血清白蛋白封閉后,4 ℃條件下使用GAPDH、TGF-β1、Smad3、p-Smad3兔抗體(1∶500稀釋)孵育過(guò)夜,TBST清洗后,山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h,TBST再次清洗后,滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,凝膠成像儀成像后,使用Image J 1.8.0按照灰度值進(jìn)行定量分析。

1.5.6心肌組織中TGF-β1mRNA表達(dá)情況 使用RNA提取試劑盒提取心肌組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后測(cè)定。引物序列:TGF-β1正向引物為5’-CTCTGTGACTCGTGGGAT-3’,反向引物為5’-CACTTGTTGGCTTATGTTCT-3’,長(zhǎng)度為104 bp;GAPDH正向引物為5’-TCTCTGCTCCTCCC-3’,反向引物為5’-ACACCGACCTTCAC-3’,長(zhǎng)度為67 bp。采用20 μL反應(yīng)體系:PCR Master Mix 10 μL,正反向引物各0.8 μL,模版DNA 2 μL,蒸餾水補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序:預(yù)變性92 ℃ 3 min,92 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠LVFS及LVEF比較 模型組大鼠LVFS及LVEF均明顯低于空白組(P均<0.05);黃芪桂枝五物湯各組及福辛普利組大鼠LVFS及LVEF均明顯高于模型組(P均<0.05),且黃芪桂枝五物湯各組LVFS及LVEF呈劑量依賴性增高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和糖尿病心肌梗死各組大鼠LVFS及LVEF比較

2.2各組大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血紅蛋白水平比較 模型組大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血紅蛋白水平均明顯高于空白組(P均<0.05);黃芪桂枝五物湯各組及福辛普利組大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血紅蛋白水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且黃芪桂枝五物湯各組血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血紅蛋白水平均呈劑量依賴性降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和糖尿病心肌梗死各組大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血紅蛋白水平比較

2.3各組大鼠心肌組織中NO、eNOS、MDA、ET含量比較 與空白組比較,模型組大鼠心肌組織中NO、eNOS含量均明顯降低(P均<0.05),MDA及ET含量均明顯升高(P均<0.05);與模型組比較,黃芪桂枝五物湯各組及福辛普利組大鼠心肌組織中NO、eNOS含量均明顯升高(P均<0.05),MDA及ET含量均明顯降低(P均<0.05);且黃芪桂枝五物湯各組NO、eNOS含量均呈劑量依賴性升高,MDA及ET含量均呈劑量依賴性降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 空白組和糖尿病心肌梗死各組大鼠心肌組織中NO、eNOS、MDA、ET含量比較

2.4各組大鼠心肌組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組大鼠心肌組織無(wú)明顯病理改變;模型組大鼠心肌組織水腫,有明顯炎癥浸潤(rùn)及壞死;與模型組比較,黃芪桂枝五物湯各組及福辛普利組大鼠心肌組織炎癥壞死明顯減輕,心肌組織細(xì)胞排列較整齊。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和糖尿病心肌梗死各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色,×200)

2.5各組大鼠心肌組織中TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)情況比較 模型組大鼠心肌組織中TGF-β1及p-Smad3/Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05);黃芪桂枝五物湯各組及福辛普利組大鼠心肌組織中TGF-β1及p-Smad3/Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),且黃芪桂枝五物湯各組TGF-β1及p-Smad3/ Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈劑量依賴性降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和糖尿病心肌梗死各組大鼠心肌組織中TGF-β1及Smad3 蛋白表達(dá)情況

2.6各組大鼠心肌組織中TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05);黃芪桂枝五物湯各組及福辛普利組TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05),且黃芪桂枝五物湯各組TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈劑量依賴性降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 空白組和糖尿病心肌梗死各組大鼠心肌組織中TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

心肌梗死是糖尿病患者常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥之一,心肌梗死發(fā)生后會(huì)激活體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng),導(dǎo)致心率加快,心肌細(xì)胞增生肥大,心室壁增厚,心室容積減小等心肌重構(gòu),心肌重構(gòu)發(fā)生后,心肌細(xì)胞節(jié)律異常,會(huì)導(dǎo)致射血分?jǐn)?shù)降低,造成心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷[12-13]。樊國(guó)亮等[14]研究表明,血糖升高會(huì)導(dǎo)致心肌梗死模型兔心肌重構(gòu)加速,纖維化加重;黃妍等[9]研究報(bào)道,糖尿病心肌梗死大鼠存在明顯心室重構(gòu),TGF-β1/Smads信號(hào)通路激活參與病情的發(fā)生發(fā)展,抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路可減輕心室重構(gòu)和心肌病理?yè)p傷。

黃芪桂枝五物湯具有益氣溫經(jīng)、和血通痹的作用,方中黃芪健脾補(bǔ)中、益衛(wèi)固表;桂枝發(fā)汗解表、通陽(yáng)化氣;芍藥養(yǎng)血和營(yíng);生姜解表散寒;大棗補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神。凌金穎等[15]和周雯等[16]研究表明,黃芪桂枝五物湯具有顯著的抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用。韋玉娜等[17]報(bào)道,黃芪桂枝五物湯合生脈飲加減能夠顯著改善糖尿病心肌病患者心功能,抑制心肌組織纖維化和心肌重塑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,黃芪桂枝五物湯各組大鼠LVFS及LVEF明顯高于模型組,血清CK、CK-MB、BNP、血糖及糖化血紅蛋白水平明顯低于模型組,提示芪桂枝五物湯能夠顯著改善糖尿病心肌梗死大鼠的心功能,減輕心肌損傷,且有降糖作用。

NO、ET是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì),維持血管的舒縮平衡,NOS是合成NO的前體物質(zhì),eNOS是NOS的亞型之一,其能夠改善心肌梗死后血管的生成并調(diào)節(jié)心室功能。心肌梗死后血管內(nèi)皮受損,導(dǎo)致NO合成減少,ET釋放增多,而ET與心肌梗死后心肌重塑的發(fā)生有關(guān),其水平升高提示預(yù)后不良[18-19]。MDA是氧自由基代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物,其水平升高提示組織細(xì)胞氧化損傷[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌組織中NO、eNOS含量明顯降低,MDA及ET含量明顯升高;與模型組比較,黃芪桂枝五物湯各組大鼠心肌組織中NO、eNOS含量明顯升高,MDA及ET含量明顯降低。提示黃芪桂枝五物湯能夠減輕心肌組織自由基損傷,抑制心肌重塑。

TGF-β1/Smad3通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖等密切相關(guān),TGF-β1作為一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,能夠與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)受體結(jié)合,形成復(fù)合物,進(jìn)而激活下游Smad3相關(guān)蛋白,Smad3蛋白被激活后,移入細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)而激活膠原蛋白,導(dǎo)致膠原蛋白沉積,誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生[21]。潘海敏等[22]研究證實(shí)TGF-β1/Smad3通路參與大鼠心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)增生等病理過(guò)程,而抑制心肌組織TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)則能夠顯著改善心肌重塑;趙地等[23]研究表明,TGF-β1、p-Smad3升高與心力衰竭大鼠心室重構(gòu)及心肌纖維化有關(guān),調(diào)控TGF-β1/Smad3通路可明顯抑制心室重構(gòu)及心肌纖維化;閆娜等[24]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1/Smad3通路參與急性心肌梗死大鼠的心室重塑,抑制TGF-β1/Smad3通路可減少心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原蛋白沉積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)量及TGF-β1mRNA表達(dá)量均顯著升高,黃芪桂枝五物湯各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)量及TGF-β1mRNA表達(dá)量均明顯低于模型組,提示黃芪桂枝五物湯能夠抑制糖尿病心肌梗死大鼠TGF-β1/Smad3通路,進(jìn)而抑制心肌重塑。

綜上所述,黃芪桂枝五物湯能夠抑制糖尿病大鼠心肌梗死后心肌重塑,抑制心肌組織氧化損傷,改善大鼠心功能,且可控制血糖水平,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。