• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    lncRNA HCG18靶向miR-34b-5p/FOXP1軸促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究

    2023-08-02 02:40:54劉文斌李艷兵周焱濤
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染孔板劃痕

    劉文斌,李艷兵,周焱濤

    骨肉瘤是好發(fā)于兒童及青少年的骨組織惡性腫瘤,易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差[1]。目前,骨肉瘤發(fā)病機(jī)制尚未明確。研究[2]顯示,骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與癌基因的異常激活及抑癌基因的失活有關(guān),探究骨肉瘤中異常表達(dá)的基因分子,可為其治療提供分子靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA,且lncRNA可靶向miRNA進(jìn)而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等生命活動(dòng),為腫瘤的治療提供了分子靶點(diǎn)[3-4]。人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體18(human leukocyte antigen complex 18,HCG18)屬于一種lncRNA,其在胃癌[5]、肝癌[6]、鼻咽癌[7]和肺腺癌[8]等腫瘤中表達(dá)升高,促進(jìn)這些腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。Starbase靶基因軟件預(yù)測顯示,HCG18可能靶向結(jié)合miR-34b-5p,而叉頭框蛋白p1(forkhead box protein p1,FOXP1)可能是miR-34b-5p的靶基因。miR-34b低表達(dá)與骨肉瘤進(jìn)展過程中的生理病理學(xué)活動(dòng)密切相關(guān),通過上調(diào)miR-34b可增強(qiáng)體外骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,延緩腫瘤進(jìn)展[9]。FOXP1是叉頭框家族成員之一,參與心肌細(xì)胞發(fā)育、免疫B細(xì)胞分化等過程。有報(bào)道[10]稱,FOXP1在骨肉瘤組織中表達(dá)升高,促進(jìn)骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移。本研究檢測了骨肉瘤組織中HCG18的表達(dá),然后以骨肉瘤U2OS細(xì)胞為研究對(duì)象,miR-34b-5p/FOXP1軸為切入點(diǎn),探討HCG18對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制。現(xiàn)作報(bào)道。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 收集2017年5月至2019年10月在我院確診并行手術(shù)治療的骨肉瘤病人47例瘤組織及對(duì)應(yīng)的瘤旁組織,液氮保存。其中女19例,男28例;年齡4~25歲,平均(14.29±4.51)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤;合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙。組織樣本取材經(jīng)病人或家屬同意,研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 細(xì)胞和試劑 U2OS細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物);RPMI 1640培養(yǎng)基、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(北京索萊寶);胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司);LipofectamineTM2000試劑盒(美國Invitrogen公司);PCR引物、HCG18小干擾RNA(si-HCG18)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-34b-5p抑制劑(anti-miR-34b-5p)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、HCG18和FOXP1的野生型質(zhì)粒(WT-HCG18、WT-FOXP1)及突變型質(zhì)粒(MUT-HCG18、MUT-FOXP1)、miR-34b-5p 模擬物(mimcs)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、FOXP1過表達(dá)載體(pcDNA-FOXP1)、空載體(pcDNA)(上海生工);兔抗人FOXP1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 RT-qPCR法檢測HCG18和miR-34b-5p表達(dá) 將收集的新鮮組織樣本在液氮保護(hù)下進(jìn)行研磨,用RNA抽提試劑提取組織總RNA。然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,并行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個(gè)循環(huán)。引物序列:HCG18上游5′-GAC CGA GAC CAA TGG CAC AG-3′,下游5′-CGA CTA GAT CCG AGA GGA CAC-3′;miR-34b-5p上游5′-ACG ATA GAC CAA CGG CTG AC-3′,下游5′-CGT GTG CGA GGC GAG CGT AGC-3′;GAPDH上游5′-CGA TAG TCG CGA GCT CGG-3′,下游5′-CGA TAG AGG AAA CCA CG-3′;U6上游5′-CGT GTC GTG AGC GAG CAC-3′,下游5′-CGA GCG CTA GAT TCA GAG G-3′。2-△△Ct法計(jì)算HCG18相對(duì)于內(nèi)參GAPDH、miR-34b-5p相對(duì)于內(nèi)參U6的表達(dá)水平。

    1.3.2 U2OS細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將U2OS細(xì)胞在超凈工作臺(tái)中復(fù)蘇,加含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期U2OS接種于6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-HCG18(si-HCG18組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-34b-5p mimics(miR-34b-5p組)、共轉(zhuǎn)染si-HCG18與anti-miR-NC(si-HCG18+anti-miR-NC組)、si-HCG18與anti-miR-34b-5p(si-HCG18+anti-miR-34b-5p組)、miR-34b-5p mimics與pcDNA(miR-34b-5p+pcDNA組)、miR-34b-5p mimics與pcDNA-FOXP1(miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1組)。轉(zhuǎn)染12 h后,更換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,RT-qPCR法檢測細(xì)胞中HCG18或miR-34b-5p表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,方法同1.3.1,并收集細(xì)胞備用。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Control組),細(xì)胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng),不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作。

    1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將各組細(xì)胞接種于96孔板中(2.5×104個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h后,加10 μL CCK-8試劑。孵育2 h,用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測吸光度值。

    1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×104個(gè)/孔),每2 d換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d后,棄培養(yǎng)基。用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,顯微鏡觀察,對(duì)超過50個(gè)細(xì)胞的克隆記數(shù)。

    1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)基。用200 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板底部平行于中軸線劃兩條平行線,并用PBS清洗掉劃痕間細(xì)胞,測量劃痕間距d,記為d0h。更換為新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,再次測量細(xì)胞間間距d,記為d24h。劃痕愈合率(%)=(d0h-d24h)/d0h×100%。

    1.3.6 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 將Transwell小室置于24孔板中,鋪Matrigel基質(zhì)膠,自然晾干。在上室中加含1.0×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,下室加500 μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,隨后棄培養(yǎng)基,用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色。將基質(zhì)膠下層置于倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)取5個(gè)視野,對(duì)視野下的細(xì)胞記數(shù)。

    1.3.7 免疫印跡法檢測FOXP1蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),培養(yǎng)24 h后,用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白,并用BCA定量。將定量后的蛋白溶液行12% SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)至PVDF膜,并用5%脫脂奶粉封閉1 h。先分別用FOXP1(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液在4 ℃冰箱中將封閉后的蛋白條帶孵育過夜,洗膜后,再用山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液在37 ℃搖床中孵育2 h。最后加顯影液避光顯影,凝膠系統(tǒng)曝光拍照,Image J軟件分析FOXP1相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

    1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) Starbase靶基因預(yù)測軟件顯示,HCG18與miR-34b-5p、FOXP1與miR-34b-5p的核苷酸序列分別存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)(見圖1)。將U2OS細(xì)胞接種于6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與WT-HCG18、miR-NC與WT-HCG18、miR-34b-5p mimics與MUT-HCG18、miR-NC與MUT-HCG18、miR-34b-5p mimics與WT-FOXP1、miR-NC與WT-FOXP1、miR-34b-5p mimics與MUT-FOXP1、miR-NC與MUT-FOXP1,轉(zhuǎn)染時(shí)間為12 h。然后換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞并裂解,經(jīng)離心(3 500 r/min、5 min)后,取上清液,檢測熒光素酶活性,結(jié)果以螢火蟲熒光強(qiáng)度與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析、q檢驗(yàn)及相關(guān)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 骨肉瘤組織中HCG18和miR-34b-5p的表達(dá)及相關(guān)性 骨肉瘤組織中HCG18表達(dá)量高于瘤旁組織(P<0.01),而miR-34b-5p表達(dá)量低于瘤旁組織(P<0.01)(見表1)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中HCG18與miR-34b-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.812,P<0.05)。

    表1 骨肉瘤組織中HCG18與miR-34b-5p的表達(dá)

    2.2 下調(diào)HCG18對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染si-HCG18的U2OS細(xì)胞中HCG18表達(dá)量明顯低于Control組和si-NC組(P<0.05),而Control組和si-NC組HCG18表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明下調(diào)HCG18的U2OS細(xì)胞構(gòu)建成功;與Control組或si-NC組比較,si-HCG18組U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)降低(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)降低(P<0.05),而Control組和si-NC組各檢測指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

    表2 下調(diào)HCG18對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

    2.3 HCG18靶向負(fù)調(diào)控miR-34b-5p 共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與WT-HCG18的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-HCG18的U2OS細(xì)胞(P<0.01),而共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與MUT-HCG18的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-HCG18的U2OS細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。與Control組或si-NC組比較,si-HCG18組U2OS細(xì)胞中HCG18表達(dá)量降低(P<0.05),而miR-34b-5p表達(dá)量升高(P<0.05)(見表4)。

    表3 熒光素酶活性檢測結(jié)果

    表4 下調(diào)HCG18對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中miR-34b-5p表達(dá)的影響

    2.4 HCG18靶向miR-34b-5p影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與si-HCG18組和si-HCG18+anti-miR-NC組比較,si-HCG18+anti-miR-34b-5p組U2OS細(xì)胞中miR-34b-5p表達(dá)量降低,U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)升高(P<0.05),而si-HCG18組與si-HCG18+anti-miR-NC組各檢測指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表5和圖2)。

    表5 HCG18靶向miR-34b-5p影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

    2.5 miR-34b-5p靶向負(fù)調(diào)控FOXP1 雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與WT-FOXP1的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-FOXP1的U2OS細(xì)胞(P<0.01),而共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics與MUT-FOXP1的U2OS細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-FOXP1的U2OS細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表6)。同時(shí),與Control組或miR-NC組比較,miR-34b-5p組U2OS細(xì)胞中miR-34b-5p表達(dá)量升高(P<0.05),而FOXP1蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)(見表7和圖3)。

    表6 熒光素酶活性檢測結(jié)果

    表7 上調(diào)miR-34b-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中FOXP1蛋白表達(dá)的影響

    2.6 miR-34b-5p靶向FOXP1影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 與miR-NC組比較,miR-34b-5p組U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)降低(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)降低(P<0.05);而與miR-34b-5p+pcDNA組比較,miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1組U2OS細(xì)胞吸光度值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05),劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲數(shù)升高(P<0.05),miR-34b-5p組與miR-34b-5p+pcDNA組各檢測指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表8和圖4)。

    表8 miR-34b-5p靶向FOXP1影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

    3 討論

    骨肉瘤是一種間質(zhì)細(xì)胞來源的惡性腫瘤,其侵襲性強(qiáng),易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[11]。骨肉瘤細(xì)胞的異常增殖及遷移和侵襲是其發(fā)生發(fā)展的主要原因[12],抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲可起到治療骨肉瘤的作用。近年來,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,發(fā)掘影響骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的基因分子對(duì)骨肉瘤的診斷和治療具有重要意義。lncRNA在真核生物中廣泛存在,其可發(fā)揮miRNA分子海綿作用,調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞生命活動(dòng)。KCNQ1OT1[13]、ROR1-AS1[14]和CCAT1[15]等多種lncRNA在骨肉瘤中表達(dá)升高,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型,可能是骨肉瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)。

    作為一種lncRNA,HCG18在多種腫瘤中表達(dá)增加,對(duì)腫瘤發(fā)展起促進(jìn)作用。例如,胃癌中HCG18表達(dá)上調(diào),其可通過靶向抑制miR-141-3p的表達(dá)間接調(diào)控Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲,進(jìn)而促進(jìn)胃癌發(fā)展[16];HCG18在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào),其可通過靶向 miR-1271/MTDH軸和Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和侵襲[17];下調(diào)HCG18可通過靶向上調(diào)miR-34a降低口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,HCG18可作為口腔鱗癌治療的分子靶點(diǎn)[18]。本研究結(jié)果顯示,骨肉瘤組織中HCG18的表達(dá)明顯高于瘤旁組織,而下調(diào)HCG18阻礙了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,提示HCG18在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用,其可能是骨肉瘤治療的分子靶點(diǎn)。

    為了進(jìn)一步探討HCG18促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制,本研究證實(shí)了HCG18可靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-34b-5p,骨肉瘤組織中HCG18與miR-34b-5p呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。miR-34b-5p在結(jié)腸癌[19]、胰腺導(dǎo)管腺癌[20]、乳腺癌[21]和膀胱癌[22]等腫瘤中均表達(dá)降低,通過上調(diào)miR-34b-5p的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型,進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示,miR-34b-5p在骨肉瘤中表達(dá)減低,而上調(diào)miR-34b-5p降低了骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性,說明miR-34b-5p對(duì)骨肉瘤發(fā)展起抑制作用。本研究還顯示,下調(diào)miR-34b-5p逆轉(zhuǎn)了下調(diào)HCG18對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,進(jìn)一步提示HCG18通過靶向抑制miR-34b-5p來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

    此外,本研究證實(shí)了FOXP1是miR-34b-5p的靶基因。FOXP1基因位于染色體3p14.1,是一種轉(zhuǎn)錄因子,其蛋白產(chǎn)物在不同腫瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。FOXP1在食管癌[23]、卵巢癌[24]和肺癌[25]等腫瘤中表達(dá)升高,發(fā)揮促癌基因作用;而FOXP1在結(jié)腸癌[26]和膀胱癌[27]等腫瘤中表達(dá)降低,作為抑癌基因起作用。本研究顯示,下調(diào)HCG18降低骨肉瘤細(xì)胞中FOXP1蛋白表達(dá),而上調(diào)FOXP1逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-34b-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,進(jìn)而提示HCG18通過競爭性結(jié)合miR-34b-5p進(jìn)而上調(diào)FOXP1的表達(dá)來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

    綜上,HCG18在骨肉瘤組織中表達(dá)升高,其可靶向miR-34b-5p/FOXP1軸促進(jìn)體外骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其可能是骨肉瘤治療的分子靶點(diǎn)。但本研究尚需要在體內(nèi)證實(shí)HCG18/miR-34b-5p/FOXP1軸對(duì)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響。

    猜你喜歡
    共轉(zhuǎn)染孔板劃痕
    核電廠高壓安注系統(tǒng)再循環(huán)管線節(jié)流孔板的分析與改進(jìn)
    富馬酸盧帕他定治療皮膚劃痕癥的療效觀察
    長鏈非編碼RNA-ATB對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究
    EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介導(dǎo)的AP-1 信號(hào)通路的機(jī)制研究
    限流孔板的計(jì)算與應(yīng)用
    廣州化工(2020年6期)2020-04-18 03:30:20
    長距離礦漿管道系統(tǒng)中消能孔板的運(yùn)行優(yōu)化
    冰上芭蕾等
    犀利的眼神
    綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究
    光滑表面淺劃痕對(duì)光反射特性
    亚洲人成网站在线观看播放| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本黄色视频三级网站网址| 97超视频在线观看视频| 国产在视频线精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 秋霞伦理黄片| 边亲边吃奶的免费视频| 成年女人永久免费观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲在线自拍视频| av天堂中文字幕网| 亚洲伊人久久精品综合 | 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美日本视频| 91久久精品电影网| 欧美性猛交黑人性爽| 一级毛片我不卡| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲,欧美,日韩| 欧美一区二区精品小视频在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 两个人视频免费观看高清| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美xxxx性猛交bbbb| 一级爰片在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 色噜噜av男人的天堂激情| 观看美女的网站| 人妻系列 视频| 看黄色毛片网站| 国产乱人视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲av.av天堂| av卡一久久| 99热这里只有精品一区| 亚洲成色77777| 精品久久久久久电影网 | 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品一及| 在现免费观看毛片| 国产精品人妻久久久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 久久鲁丝午夜福利片| 日本午夜av视频| 天美传媒精品一区二区| 亚洲人成网站在线播| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲伊人久久精品综合 | 看免费成人av毛片| av国产免费在线观看| 免费观看性生交大片5| 国产亚洲一区二区精品| 色综合色国产| 亚洲精品色激情综合| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99久久成人亚洲精品观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 26uuu在线亚洲综合色| 视频中文字幕在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲在久久综合| 亚洲精品乱久久久久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 白带黄色成豆腐渣| 国产在线男女| 久久久欧美国产精品| 免费av观看视频| 亚洲无线观看免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲av电影不卡..在线观看| 如何舔出高潮| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 日韩欧美国产在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲人与动物交配视频| 久久亚洲国产成人精品v| 欧美日韩在线观看h| 深爱激情五月婷婷| 亚洲图色成人| 22中文网久久字幕| av视频在线观看入口| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费av不卡在线播放| 免费电影在线观看免费观看| 1024手机看黄色片| 亚洲性久久影院| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲av熟女| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 韩国av在线不卡| 一级av片app| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产久久久一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 午夜福利网站1000一区二区三区| 91av网一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 在线天堂最新版资源| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美清纯卡通| 国产午夜精品一二区理论片| 色噜噜av男人的天堂激情| 一级毛片久久久久久久久女| 精品人妻一区二区三区麻豆| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 舔av片在线| 亚洲精品456在线播放app| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲综合色惰| 国产精品国产三级国产专区5o | 性插视频无遮挡在线免费观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品一区二区三区人妻视频| 观看美女的网站| 久久久久久久久久久丰满| 免费观看在线日韩| 免费观看人在逋| 亚洲人成网站在线播| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 久久精品影院6| 秋霞在线观看毛片| 一级黄色大片毛片| 舔av片在线| 免费黄网站久久成人精品| 身体一侧抽搐| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 九九在线视频观看精品| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲在线观看片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 乱人视频在线观看| 观看免费一级毛片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精华一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲国产精品专区欧美| 成人鲁丝片一二三区免费| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲av免费在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| www.av在线官网国产| 日韩大片免费观看网站 | 熟女电影av网| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲在线自拍视频| av免费观看日本| av国产久精品久网站免费入址| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 午夜福利高清视频| 一区二区三区免费毛片| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日韩在线观看h| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| 午夜福利视频1000在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜精品在线福利| 久久久久久久久久成人| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久久久午夜电影| 国产乱人偷精品视频| 男的添女的下面高潮视频| 一个人免费在线观看电影| 国产乱人偷精品视频| 国产爱豆传媒在线观看| videossex国产| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区在线观看日韩| 国产麻豆成人av免费视频| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩大片免费观看网站 | 免费观看在线日韩| 少妇丰满av| 国产黄a三级三级三级人| 99热网站在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产成人一区二区在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 中文天堂在线官网| 69av精品久久久久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一级爰片在线观看| 国产一区二区三区av在线| 丰满少妇做爰视频| 伦精品一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲最大成人中文| 亚洲国产欧美在线一区| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久欧美国产精品| 亚洲欧洲国产日韩| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费av不卡在线播放| 九九热线精品视视频播放| 内地一区二区视频在线| av在线观看视频网站免费| 好男人视频免费观看在线| 看片在线看免费视频| 精品久久久久久久久亚洲| 春色校园在线视频观看| 天天一区二区日本电影三级| 淫秽高清视频在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 欧美bdsm另类| 一级黄片播放器| 女人久久www免费人成看片 | 最近中文字幕2019免费版| 丰满乱子伦码专区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 69av精品久久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 干丝袜人妻中文字幕| av.在线天堂| 精品免费久久久久久久清纯| 国产亚洲精品av在线| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品不卡国产一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费人成在线观看视频色| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜激情欧美在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品女同一区二区软件| 一级毛片aaaaaa免费看小| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美另类亚洲清纯唯美| 村上凉子中文字幕在线| 人妻系列 视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 免费搜索国产男女视频| 久久精品夜色国产| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲欧美精品专区久久| 美女内射精品一级片tv| АⅤ资源中文在线天堂| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 精品久久久久久久久亚洲| 在线观看美女被高潮喷水网站| 特大巨黑吊av在线直播| 小说图片视频综合网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产高清有码在线观看视频| 国产高清三级在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 午夜福利高清视频| 一级毛片久久久久久久久女| 如何舔出高潮| 人体艺术视频欧美日本| 国产成人福利小说| 干丝袜人妻中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 国产av不卡久久| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲最大成人中文| 亚洲自偷自拍三级| 99热这里只有是精品在线观看| 大香蕉久久网| 日韩制服骚丝袜av| 春色校园在线视频观看| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久午夜欧美精品| 国产高清国产精品国产三级 | 久久精品夜色国产| 国产精品电影一区二区三区| 只有这里有精品99| 国产视频首页在线观看| 国产视频内射| 欧美+日韩+精品| 成人三级黄色视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 极品教师在线视频| 亚洲在久久综合| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美精品国产亚洲| 欧美色视频一区免费| 国产av一区在线观看免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本爱情动作片www.在线观看| 丝袜喷水一区| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 久久人妻av系列| 日韩人妻高清精品专区| 日本免费a在线| 内地一区二区视频在线| 在线a可以看的网站| 亚洲自偷自拍三级| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 伦理电影大哥的女人| 国产一区亚洲一区在线观看| 婷婷色av中文字幕| 国产极品精品免费视频能看的| 一边亲一边摸免费视频| 一级av片app| av.在线天堂| 男女国产视频网站| 别揉我奶头 嗯啊视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲人成网站在线播| 国产高潮美女av| 免费电影在线观看免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久精品91蜜桃| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产成人一精品久久久| 伊人久久精品亚洲午夜| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲va在线va天堂va国产| 中文在线观看免费www的网站| 日韩欧美精品v在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 91狼人影院| 日韩制服骚丝袜av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美区成人在线视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 成人综合一区亚洲| www日本黄色视频网| 最近手机中文字幕大全| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲av男天堂| 久久精品国产亚洲网站| 免费看a级黄色片| av女优亚洲男人天堂| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久久久久久大av| 51国产日韩欧美| 久久久久免费精品人妻一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产日韩欧美在线精品| 深夜a级毛片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产 一区精品| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 18禁动态无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品三级大全| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 综合色av麻豆| 99热这里只有精品一区| 一级黄色大片毛片| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 久久韩国三级中文字幕| 国产在视频线在精品| 男人舔奶头视频| 一夜夜www| 观看免费一级毛片| 午夜日本视频在线| 国产精品久久视频播放| 中文字幕久久专区| 男人舔女人下体高潮全视频| 最后的刺客免费高清国语| 国产伦理片在线播放av一区| 美女国产视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 精品国产露脸久久av麻豆 | 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品,欧美精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 特级一级黄色大片| www.色视频.com| 久久99热6这里只有精品| 日本免费在线观看一区| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲欧美日韩东京热| АⅤ资源中文在线天堂| 在线播放国产精品三级| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 色综合站精品国产| 免费看av在线观看网站| 不卡视频在线观看欧美| 日日撸夜夜添| 免费黄色在线免费观看| 看免费成人av毛片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲三级黄色毛片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 嫩草影院新地址| 女人被狂操c到高潮| 国产午夜精品论理片| 免费观看在线日韩| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 青青草视频在线视频观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 在现免费观看毛片| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲无线观看免费| 久久99热这里只有精品18| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一夜夜www| 中文字幕制服av| 国产伦理片在线播放av一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 女人久久www免费人成看片 | 亚洲最大成人av| 国产人妻一区二区三区在| 青春草视频在线免费观看| 日本免费在线观看一区| 精品国产三级普通话版| 性色avwww在线观看| 内地一区二区视频在线| 搞女人的毛片| 日韩欧美精品v在线| 我要看日韩黄色一级片| 51国产日韩欧美| 欧美97在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲欧洲国产日韩| 成人漫画全彩无遮挡| 久久鲁丝午夜福利片| 国产色爽女视频免费观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 精品不卡国产一区二区三区| 舔av片在线| 久久久精品大字幕| 亚洲精品亚洲一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久久久久久久久丰满| 国内精品美女久久久久久| 国产成年人精品一区二区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久欧美国产精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产免费一级a男人的天堂| 最近最新中文字幕免费大全7| 韩国高清视频一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品久久久久久精品电影| 秋霞在线观看毛片| 女人久久www免费人成看片 | 国产一级毛片在线| 看十八女毛片水多多多| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产午夜福利久久久久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 黄色欧美视频在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久国产成人精品二区| 22中文网久久字幕| 国产真实乱freesex| 欧美+日韩+精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 丝袜喷水一区| av播播在线观看一区| 99久国产av精品国产电影| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 22中文网久久字幕| 久久久精品94久久精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 日本一二三区视频观看| 国产成人freesex在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 少妇丰满av| 水蜜桃什么品种好| 精品不卡国产一区二区三区| 淫秽高清视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 1000部很黄的大片| 深爱激情五月婷婷| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩精品青青久久久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品影院6| 欧美丝袜亚洲另类| 白带黄色成豆腐渣| 欧美精品国产亚洲| 在线播放国产精品三级| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 美女黄网站色视频| 如何舔出高潮| 国产精品综合久久久久久久免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品一及| 欧美成人午夜免费资源| av在线观看视频网站免费| 男人的好看免费观看在线视频| 伦精品一区二区三区| 久久久久久大精品| 联通29元200g的流量卡| 国产男人的电影天堂91| 男女那种视频在线观看| 国产精品一及| av黄色大香蕉| 在线观看一区二区三区| 久久久国产成人精品二区| 久久99蜜桃精品久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美日本视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 人人妻人人看人人澡| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产精品福利在线免费观看| 亚洲国产色片| 网址你懂的国产日韩在线| 我要搜黄色片| a级一级毛片免费在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲自拍偷在线| 久久久国产成人精品二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲五月天丁香| 欧美激情国产日韩精品一区| av在线天堂中文字幕| 国产免费男女视频| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲性久久影院| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲性久久影院| 嫩草影院新地址| 日本熟妇午夜| 69人妻影院| 精品酒店卫生间| 嫩草影院入口| 国产老妇女一区| 国产亚洲精品久久久com| 日本免费在线观看一区| 日本欧美国产在线视频| 国产精品一区二区性色av| 久久久国产成人免费| 中文字幕av成人在线电影| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 免费无遮挡裸体视频| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 日韩视频在线欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇高潮的动态图| 熟女人妻精品中文字幕| 精品国产三级普通话版| 午夜视频国产福利| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品自拍成人| 99久久成人亚洲精品观看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美精品国产亚洲| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 草草在线视频免费看| 国产精品人妻久久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 99久久精品一区二区三区| 能在线免费看毛片的网站| av播播在线观看一区| 一级爰片在线观看| 日本av手机在线免费观看| 1000部很黄的大片|