小兒柴桂退熱口服液對發(fā)熱模型大鼠的退熱作用和機(jī)制研究

洪 倩 馬增春 王增慧 韓 莉 王 青 楊 陽

(1 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院/解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院,徐州,221004; 2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京,100850)

小兒柴桂退熱口服液是小兒外感發(fā)熱后臨床常用的退熱中藥復(fù)方制劑,由柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黃芩、白芍、蟬蛻7味藥材組方制備而成,主要用于治療小兒發(fā)熱、頭身痛、流涕、口渴、咽紅、溲黃、便干等癥[1]。該藥功效確切、不良反應(yīng)較小且質(zhì)量穩(wěn)定,已被2020版《中華人民共和國藥典(一部)》成方制劑收載。

本研究擬探討小兒柴桂退熱口服液對酵母發(fā)熱模型大鼠的退熱作用,并通過檢測大鼠血清炎癥介質(zhì)以及下丘腦發(fā)熱中樞介質(zhì)的含量變化,闡明其作用機(jī)制,以期為臨床合理用藥提供數(shù)據(jù)支撐及參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠70只,2～3周齡,體質(zhì)量160～180 g,購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,實驗動物合格證號:2008001649301。飼養(yǎng)于醫(yī)院實驗中心動物房,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)溫度24～28 ℃,相對濕度60%～80%,通風(fēng)良好。實驗通過醫(yī)院動物福利倫理委員會審核并批準(zhǔn)(倫理審批號:LL-2019DW01)。

1.1.2 藥物 小兒柴桂退熱口服液(吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司,批號:1810014),規(guī)格10 mL/支;右旋布洛芬口服混懸液(湖北唯森制藥有限公司,批號:20180705),規(guī)格100 mL:2 g。

1.1.3 試劑與儀器 高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司,批號:20181128W),5 g/袋;白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(北京晶美生物科技有限公司,批號:20161223);一氧化氮(Nitric Oxide,NO)檢測試劑盒(硝酸還原酶法)(南京建成生物工程研究所,批號:20170227);髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)檢測試劑盒(硝酸還原酶法)(南京建成生物工程研究所,批號:20170802);大鼠前列腺素E2(地諾前列酮,Prostaglandin E2,PGE2)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,批號:20161225);大鼠環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所,批號:20160915);電子體溫計[歐姆龍(大連)有限公司,型號:MC-686型];電子分析天平(最大載荷220 g,分度值0.1 mg)(Sartorius公司,德國,型號:Quintix 224-1CN);冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司,德國,型號:Centrfuge 5840);全自動放免計數(shù)儀(中國科技大學(xué)實業(yè)總公司,型號:r-911);酶聯(lián)免疫檢測儀(常州三豐儀器科技有限公司,型號:BG-XM496)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 稱取10 g干酵母,置于玻璃研缽,逐漸加入生理鹽水研磨成均勻混懸液,定容,配制成20%酵母混懸液,現(xiàn)配現(xiàn)用。于造模實驗前1 d測量大鼠肛溫,將電子體溫計末端涂少量開塞露,輕緩送入大鼠肛門約2 cm處,待溫度計穩(wěn)定發(fā)出蜂鳴聲后讀數(shù),間隔30 min后再次測量1次,取2次測量的平均值作為大鼠基礎(chǔ)體溫。通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取9只大鼠作為空白組。造模實驗開始前,其余大鼠以10 mL/kg劑量于大鼠皮下注射20%酵母混懸液,6 h后同法測量大鼠體溫,選擇體溫較基礎(chǔ)體溫升高0.6 ℃以上者為造模成功大鼠。篩選造模成功大鼠45只,通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組,分別為模型組、布洛芬組(陽性藥物對照組)、柴桂低劑量組、柴桂中劑量組、柴桂高劑量組,每組9只。

1.2.2 給藥方法 分組后立即進(jìn)行給藥,空白組和模型組均給予0.75 mL/kg生理鹽水溶液灌胃,布洛芬組給予0.75 mL/kg右旋布洛芬口服混懸液灌胃,柴桂低、中、高劑量組分別以1.25 mL/kg、2.5 mL/kg、5 mL/kg小兒柴桂退熱口服液灌胃。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 于注射酵母混懸液7 h(即藥物干預(yù)后1 h)、8 h(即藥物干預(yù)后2 h)后分別同法測量并記錄各組大鼠體溫。隨后,以0.03 mL/kg劑量將10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉各組大鼠,迅速于腹主動脈穿刺采血5 mL,靜置30 min后,置于離心機(jī)內(nèi),960×g,離心10 min,吸取上層血清,檢測IL-1β、NO、MPO含量。采血后,立即斷頭處死大鼠,于冰上迅速剝離大鼠下丘腦部位,置于-70 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。稱取各組大鼠下丘腦腦組織約5 mg，精密稱定，置于玻璃勻漿器中，定量加入生理鹽水溶液(腦組織與生理鹽水質(zhì)量比為1∶9)，研磨制成勻漿，置于離心機(jī)內(nèi)，4 ℃，960×g，離心15 min，吸取上清液，檢測PGE2、cAMP含量。

2 結(jié)果

2.1 小兒柴桂退熱口服液對酵母發(fā)熱模型大鼠體溫的影響 實驗結(jié)果表明,皮下注射20%酵母混懸液6 h后,各組大鼠體溫均升高(>0.6 ℃)。與模型組比較,退熱治療1 h、2 h后各給藥組大鼠體溫升高幅度均有所降低(均P<0.01),且隨著時間延長體溫下降趨勢越顯著;退熱治療1 h后,柴桂各劑量組大鼠體溫均顯著高于布洛芬組(均P<0.01),退熱治療2 h后,柴桂低、中劑量組大鼠體溫仍顯著高于布洛芬組(均P<0.01),而柴桂高劑量組大鼠與布洛芬組大鼠體溫差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠治療前后體溫比較注:與模型組比較,**P<0.01;與布洛芬組比較,△△P<0.01

2.2 小兒柴桂退熱口服液對酵母發(fā)熱模型大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量的影響 與空白組比較,除布洛芬組大鼠血清IL-1β外,其余各給藥大鼠血清IL-1β、NO、MOP含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較,布洛芬組、柴桂各劑量組大鼠血清IL-1β、NO、MOP含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);柴桂各劑量組的效應(yīng)強(qiáng)度與劑量正相關(guān),但均弱于布洛芬組。僅柴桂高劑量組與布洛芬組大鼠血清IL-1β差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 治療后2 h各組大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量比較注:與空白組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與布洛芬組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.3 小兒柴桂退熱口服液對模型大鼠下丘腦腦組織PGE2、cAMP含量的影響 與空白組比較,除布洛芬組大鼠腦組織PGE2外,其余各給藥大鼠下丘腦腦組織PGE2、cAMP含量均顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較,布洛芬組、柴桂各劑量組大鼠腦組織PGE2、cAMP含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);柴桂各劑量組的效應(yīng)強(qiáng)度與劑量正相關(guān),但均弱于布洛芬組。柴桂高劑量組與布洛芬組大鼠腦組織cAMP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 治療后2 h各組大鼠下丘腦腦組織PGE2、cAMP含量比較注:與空白組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,**P<0.01;與布洛芬組比較,△△P<0.01

3 討論

發(fā)熱是由于疾病或病原體入侵機(jī)體引起的常見臨床癥狀[2],其發(fā)生機(jī)制為外源性致熱源激活機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的內(nèi)源性致熱源,通過發(fā)熱中樞介質(zhì)作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞,引起機(jī)體發(fā)熱[3-4]。兒童正處于身體生長階段,體溫中樞系統(tǒng)發(fā)育不夠健全,調(diào)節(jié)功能比較差,加之對疾病的抵抗能力偏弱,容易受到各種疾病及炎癥等不良因素的侵襲,以致引起發(fā)熱。通常情況下,父母親會非常擔(dān)心發(fā)熱對孩子產(chǎn)生不良影響[5]。在臨床實踐中,使用解熱類藥物治療兒童發(fā)熱性疾病較為普遍。例如,布洛芬是發(fā)熱兒童退熱最廣泛可用和最常用的非處方藥之一,可有效退熱且耐受性良好[6]。但是,解熱類藥物容易產(chǎn)生胃腸道出血、胃灼熱、消化不良、惡心嘔吐等不良反應(yīng);也有可能增加嚴(yán)重感染的死亡率、延長病毒消除時間并減弱機(jī)體對感染的反應(yīng)[7]。且解熱類藥物還存在多種與藥物相關(guān)的危害,例如:布洛芬等藥物具有引起藥物不良反應(yīng)的可能[8];過量服用對乙酰氨基酚會導(dǎo)致心腎、血細(xì)胞損傷和新陳代謝紊亂,其還是引起急性肝功能衰竭最常見的原因[9];兒童使用阿司匹林會引發(fā)代謝性酸中毒、低血糖、嗜睡、昏迷和痙攣等,嚴(yán)重者甚至死亡。英國等國家已正式禁止使用阿司匹林治療兒童發(fā)熱[10-11]。因此,如何在兒童發(fā)熱時選擇較為安全有效的退熱藥物是兒科醫(yī)護(hù)人員及患兒父母亟待解決的重要課題。

小兒柴桂退熱口服液以《傷寒論》中柴胡桂枝湯為基礎(chǔ),加減部分性味中藥組方,處方含有柴胡、桂枝、葛根、白芍、黃芩、浮萍、蟬蛻7味藥材。柴胡性辛、苦,微寒,疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣;葛根性甘、辛,涼,解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉;二者同為君藥[1,18]。桂枝辛甘溫煦、溫通經(jīng)脈、解肌散寒,協(xié)同白芍味酸斂陰、益陰斂營、緩急止痛;二者合用調(diào)和營衛(wèi),為臣藥[12-13]。黃芩降泄燥濕、瀉火解毒、善清邪郁之熱,為佐藥[14-15]。浮萍性辛寒,祛風(fēng)行水、清熱解毒;蟬蛻性甘寒,疏散風(fēng)熱、利咽透疹;二者合用退肺熱,為使藥[15-16]。以上諸藥配伍合用,具有發(fā)汗解表、清里退熱的功效。臨床研究已證實,使用小兒柴桂退熱口服液治療小兒外感發(fā)熱,可明顯解除體內(nèi)郁熱,緩解頭身痛、鼻塞、流涕等癥狀,具有退熱平穩(wěn)持續(xù)、起效快、恢復(fù)正常體溫時間短、退熱后體溫不回升、安全可靠的特點[17-18];治療小兒上呼吸道感染、外感高熱驚風(fēng)有效安全[15,19]。

常用的發(fā)熱動物模型主要有酵母發(fā)熱模型、脂多糖發(fā)熱模型以及2,4-二硝基苯酚發(fā)熱模型[20-21]。酵母屬真菌類,其致熱成分是全菌體及菌體內(nèi)含的莢膜多糖和蛋白質(zhì);皮下注射可引起注射部位潰爛并引發(fā)劇烈炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱。其主要機(jī)制為破壞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素之間的動態(tài)平衡,誘導(dǎo)發(fā)熱,且發(fā)熱能夠持續(xù)較長時間[22-23]。酵母發(fā)熱模型能夠較好地模擬病理狀態(tài)下的發(fā)熱癥狀,適用于解熱作用持久、藥效較為顯著的解熱類藥物研究[20],更適合用來考察清熱藥的解熱作用[24]。

為進(jìn)一步觀察和闡明小兒柴桂退熱口服液的退熱作用和機(jī)制,本研究選擇酵母發(fā)熱模型大鼠進(jìn)行動物實驗。實驗中,皮下注射20%酵母后6 h,大鼠體溫顯著上升,且在隨后的2 h內(nèi)保持上升且趨于穩(wěn)定。使用小兒柴桂退熱口服液灌胃給藥后1～2 h,大鼠體溫持續(xù)降低,表明小兒柴桂退熱口服液具有較好的退熱效果,但作用較為溫和;且高劑量小兒柴桂退熱口服液的退熱效果與臨床常用解熱類藥物布洛芬相當(dāng),故其較為適用于治療兒童發(fā)熱性疾病。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體受到外界刺激后產(chǎn)生的病理反應(yīng)。發(fā)熱現(xiàn)象則是炎癥和其他炎癥狀況的繼發(fā)性影響[25]。IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)均是重要的內(nèi)源性致熱源,能夠直接或間接增加下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞PGE2、cAMP等發(fā)熱中樞介質(zhì)含量,上調(diào)體溫調(diào)定點,導(dǎo)致體溫升高[26-27]。NO存在于多種細(xì)胞及組織中,可參與多種病理生理反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體發(fā)熱時,體內(nèi)IL-1β及NO含量明顯增加[28]。MPO主要存在于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等髓系祖細(xì)胞中,能夠抵抗機(jī)體內(nèi)細(xì)菌和真菌蔓延、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),其活性高低可反映中性粒細(xì)胞浸潤的程度及活性[29]。PGE2、cAMP均是下丘腦正向調(diào)節(jié)發(fā)熱中樞介質(zhì)。PGE2相關(guān)通路是致熱源引起發(fā)熱的必經(jīng)共同路徑,能夠通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)體溫調(diào)定,其水平升高是感染性發(fā)熱最主要的誘因之一[27]。在感染和損傷組織中IL-1β大量形成,通過增加PGE2合成從而觸發(fā)下丘腦升高體溫[30]。cAMP是接近體溫調(diào)節(jié)終末環(huán)節(jié)的發(fā)熱中樞介質(zhì)[31];PGE2可誘導(dǎo)cAMP表達(dá)量顯著增加,并相應(yīng)調(diào)高溫度設(shè)定點[32-33]。本動物實驗結(jié)果表明,酵母發(fā)熱模型大鼠血清IL-1β、NO、MPO炎癥介質(zhì)以及下丘腦腦組織PGE2、cAMP的含量均顯著升高,可見模型大鼠血清中產(chǎn)生大量的內(nèi)源性致熱源,其腦組織中也相應(yīng)產(chǎn)生大量的發(fā)熱介質(zhì),二者皆是致熱和誘導(dǎo)發(fā)熱的重要因素。應(yīng)用小兒柴桂退熱口服液干預(yù)后,大鼠血清IL-1β、NO、MPO含量顯著降低,進(jìn)而顯著下調(diào)下丘腦PGE2、cAMP水平,調(diào)低了體溫調(diào)定點,降低了大鼠體溫,即產(chǎn)生退熱作用。

綜上所述,小兒柴桂退熱口服液能夠降低酵母發(fā)熱模型大鼠的體溫升高,其退熱機(jī)制與抑制IL-1β、NO、MOP等炎癥介質(zhì)的生成與釋放,減少下丘腦發(fā)熱中樞介質(zhì)PGE2、cAMP的合成與釋放有關(guān)。小兒柴桂退熱口服液是較為理想的治療小兒發(fā)熱的中藥復(fù)方制劑,值得臨床推廣使用。

利益沖突聲明:無。