羥氯喹減輕腎缺血/再灌注損傷的機(jī)制研究

李文，王光策，王鎖剛 （.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450003）

腎缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是引起急性腎損傷（acute kidneyinjury，AKI）、急性腎小管壞死（acute tubular necrosis，ATN）和急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）等嚴(yán)重腎臟疾病的重要原因，已成為影響移植受者/腎長(zhǎng)期存活的主要障礙［1］。腎IRI 的防治是腎移植研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)，但是目前治療方法對(duì)腎IRI 的保護(hù)并不理想。氯喹（chloroquine，CQ）及其衍生物羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）于80 余年前推出，在臨床主要用于抗瘧疾、治療慢性炎癥反應(yīng),后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)的藥理作用，經(jīng)過發(fā)展開始用于一些自身免疫性疾病，現(xiàn)臨床主要用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等疾病。近年來，越來越多的研究表明HCQ 在腎IRI 中的保護(hù)作用，但是其作用機(jī)制尚不明確，現(xiàn)對(duì)HCQ 的藥理作用以及在腎IRI 的發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 腎缺血/再灌注病理生理機(jī)制

IRI 是組織或器官缺血及重獲血流灌注或氧供應(yīng)后，對(duì)組織或器官所產(chǎn)生的損傷作用。事實(shí)上，廣泛的缺血和再灌注會(huì)導(dǎo)致相關(guān)的病理組織損傷。而相對(duì)與心、腦等重要器官，腎臟血供會(huì)被削減以滿足心腦等重要器官的血供，也因此更容易發(fā)生IRI［2］。目前腎IRI 已經(jīng)明確的機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、凋亡、自噬、鈣超載等。腎IRI 急性期內(nèi)主要表現(xiàn)為AKI，常出現(xiàn)尿量減少、代謝物異常蓄積、水電解質(zhì)紊亂等癥狀，臨床表現(xiàn)有水腫、高血壓以及血尿等。遠(yuǎn)期將會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)和缺氧，隨后可能出現(xiàn)腎小管萎縮、上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，腎間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)生成分解不平衡，最終導(dǎo)致以腎纖維化為病理基礎(chǔ)的慢性腎臟?。?］。

國內(nèi)外眾多專家在腎 IRI 的發(fā)生機(jī)制方面做了一些研究并取得了重要進(jìn)展。已明確IRI 共經(jīng)歷4 個(gè)階段：① 起始階段的缺血性損傷會(huì)導(dǎo)致腎組織級(jí)聯(lián)的壞死和凋亡。② 第二階段主要經(jīng)歷再灌注所帶來的的炎癥過程，各種細(xì)胞因子的釋放并伴隨中性粒細(xì)胞的到來，刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的產(chǎn)生，同時(shí)產(chǎn)生趨化作用和吞噬作用。③ 第三階段又稱為維持階段，微環(huán)境變化不大，腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）穩(wěn)定、尿量正常。④ 最后，血肌酐值下降，腎小管功能增加，腎結(jié)構(gòu)改善［4］。

2 羥氯喹藥理學(xué)

HCQ 是 1946 年合成的 4-氨基喹啉衍生物，是一類抗瘧疾藥。由 CQ 添加羥基衍生而來。這種變化使 HCQ 比 CQ 更易溶解和更安全，使其在保持CQ 生物效應(yīng)的同時(shí)，大大降低了生物毒性。臨床上，多用它治療風(fēng)濕性疾病，如幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎 （juvenile idiopathic arthritis，JIA）、SLE、RA 和干燥綜合征等［5］。其在IRI 中的生理作用也逐漸受到重視。

HCQ 具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、免疫抑制、預(yù)防血栓、保護(hù)血管內(nèi)皮、降糖調(diào)脂、抗感染等多種藥理作用［6］，HCQ 還可以抑制 Toll 樣受體信號(hào)傳導(dǎo)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞死亡、自噬等［7］。HCQ 免疫調(diào)節(jié)的的主要作用機(jī)制可能包括：① 干擾溶酶體酸化和抑制蛋白水解、趨化，干擾吞噬作用和抗原呈遞。② 減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，主要是白細(xì)胞介素 （interleukin，IL）-1 和 IL-6。③ 抑制磷脂酶A2，從而拮抗前列腺素的作用。④ 吸收和阻斷紫外線皮膚損傷。⑤ 結(jié)合并穩(wěn)定DNA。⑥ 抑制 T 和 B 細(xì)胞受體鈣信號(hào)傳導(dǎo)［8］。并且HCQ 部分免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)與IRI 有著密切的聯(lián)系。

3 羥氯喹在腎IRI 中可能作用機(jī)制

3.1 NLRP3 炎癥小體是含有NACHT、LRR 和PYD結(jié)構(gòu)域的蛋白，是一種細(xì)胞質(zhì)大分子復(fù)合物，可以通過誘導(dǎo)半胱天冬酶-1（caspase-1）激活和促使IL-1β 成熟來參與調(diào)節(jié)固有免疫。NLRP3 炎癥小體可以被線粒體ROS、鉀外流和溶酶體組織蛋白酶的釋放激活［9-10］。目前大量研究證實(shí)NLRP3 炎性小體在調(diào)節(jié)IgA 腎病等原發(fā)性腎小球疾病，以及腎IRI所引起的繼發(fā)性腎小球腎小管疾病方面有重要作用［11-12］。Iyer 等［13］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明壞死小管細(xì)胞能夠通過釋放存活的線粒體激活巨噬細(xì)胞中的NLRP3 炎性小體，NLRP3 炎性小體的減少對(duì)小鼠腎臟IRI 所致的炎癥和組織損傷具有保護(hù)作用。Bakker 等［14］報(bào)道NLRP3 具有組織特異性的作用，白細(xì)胞相關(guān)NLRP3 與小管細(xì)胞凋亡有密切相關(guān)，而腎相關(guān)NLRP3 則對(duì)創(chuàng)面愈合有拮抗作用。腎小管細(xì)胞相關(guān)NLRP3 的缺乏對(duì)細(xì)胞再生具有改善作用。Tang T 等［15］通過鼠和HK-2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，IRI 可導(dǎo)致NLRP3 炎癥小體激活的增加，這種病理現(xiàn)象可被HCQ 所抑制，因此HCQ 對(duì)IRI 中炎癥的改善可能是通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活。這些發(fā)現(xiàn)表明NLRP3 炎癥小體可能是治療腎IRI 的潛在靶點(diǎn)。

3.2 羥氯喹通過拮抗Toll樣受體9 （toll-like receptor 9，TLR9）抑制中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）形成緩解腎IRI：研究表明NETs 在IRI 中具有重要的病理學(xué)作用。NETs 是由中性粒細(xì)胞形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由DNA 和組蛋白（包括細(xì)胞外組蛋白和中性粒細(xì)胞顆粒蛋白）組成，中性粒細(xì)胞可以通過它捕獲和殺死入侵的微生物［16］。在IRI 中組蛋白和中性粒細(xì)胞可以直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而影響腎功能，同時(shí)組蛋白作為一種損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）可以激活TLR9 促進(jìn)NETs 形成，NETs 可激活NLRP3 炎癥小體使免疫系統(tǒng)增強(qiáng)免疫反應(yīng)來損傷相關(guān)組織細(xì)胞［17］。TLR9 是免疫系統(tǒng)和NETs、DAMPs 和IRI 惡性循環(huán)中的重要模式識(shí)別受體。Zhang 等［18］通過SCID 小鼠和c57BL/6 小鼠模型，表明HCQ 可以通過抑制肽?；彼崦搧啺访?（peptidylarginine deiminase type 4，PAD4）和Rac 家族小GTP 酶2 （rac family small GTPase 3，Rac 2）的表達(dá)抑制NETs 的形成減輕肝臟IRI，并且該作用可被TLR9 激動(dòng)劑所逆轉(zhuǎn)。除此之外，HCQ 還可以通過抑制TLR9 的信號(hào)傳導(dǎo)影響樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）的成熟，進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能［19］。這可能表明HCQ 和其他TLR9 拮抗劑在臨床中可以用于預(yù)防肝臟IRI。

3.3 羥氯喹預(yù)處理通過增強(qiáng)ERK1/2 磷酸化減輕心肌缺血/再灌注損傷：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2 （ERK 1/2）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于促分裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，廣泛存在于真核細(xì)胞中。ERK 1/2 通常位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激（生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥、缺血、缺氧等）通過經(jīng)典的 Ras-Raf-MEKERK 1/2 通路誘導(dǎo) ERK 1/2 Ⅷ 區(qū)域的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而導(dǎo)致 ERK 1/2 的激活?；罨腅RK 1/2 可以使細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的底物磷酸化，從而在表面受體到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵關(guān)鍵作用，誘導(dǎo)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)或活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和其他過程［20］。研究證實(shí)，ERK 1/2 在各個(gè)器官的IRI 中均有異常表達(dá)，并在IRI 發(fā)揮重要作用［21］。ERK1/2 和另一種蛋白激酶Akt 可以構(gòu)成再灌注損傷挽救性激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）通路，RISK 相關(guān)通路已經(jīng)被證實(shí)在心肌IRI 中發(fā)揮重要作用［22］。Bourke 等通過羥氯喹預(yù)處理體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HCQ 對(duì)大鼠IRI 的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并且其保護(hù)可以被ERK1/2 抑制劑 U0126 所阻斷，并通過劑量依賴實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HCQ 是通過以劑量依賴性方式增強(qiáng) ERK1/2 磷酸化來發(fā)揮保護(hù)作用。除此之外，HCQ 和西地那非可以通過模仿 RISK 途徑，在心肌梗塞 （myocardial infarction，MI）時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞保護(hù)作用［23-24］。

3.4 羥氯喹通過缺血后期抑制自噬減輕腎IRI：自噬（autophagy）在腎IRI 中發(fā)揮重要作用，自噬是對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的處理加工的過程，清除受損或不需要的細(xì)胞器或大分子蛋白質(zhì)，其是一種細(xì)胞抵抗外界刺激或損傷的自適應(yīng)防御的方式，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有著重要作用。在腎IRI 中，缺氧可以誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生，線粒體自噬（mitophagy）是一種特異性自噬，通過自噬機(jī)制特異識(shí)別受損或功能異常的線粒體，將其包裹后傳輸?shù)阶允审w中并與溶酶體融合進(jìn)行線粒體裂解，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程［25-26］。線粒體自噬是目前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，越來越多的證據(jù)提示，在腎IRI 中，自噬是把雙刃劍，自噬在激活固有免疫和適應(yīng)性免疫中具有重要作用，不僅能增強(qiáng)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，還能與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子、受體和配體同時(shí)增強(qiáng)自噬作用［27］。與此同時(shí)，自噬蛋白可以觸發(fā)一些特定的免疫反應(yīng)，限制一些不受控制的免疫激活和炎癥的發(fā)生［28］。因此，在正常自噬存在的情況下，免疫和炎癥反應(yīng)是平衡的，但如果自噬異常，自噬的自我吞噬與促生存功能失衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而自噬可能保護(hù)作用和有害作用取決于缺血的嚴(yán)重程度、自噬激活程度、IRI 的階段和一些其他未知因素。Decuypere 等［29］提出在缺血時(shí)間較短 （20 ～40 min）時(shí)，自噬具有保護(hù)作用；但在較長(zhǎng)時(shí)間缺血（40 ～60 min）后，自噬水平的提高是有害的。研究證明，HCQ 是溶酶體依賴性自噬的有力抑制劑，可以通過抑制溶酶體與自噬體的結(jié)合和堿化溶酶體，影響缺氧誘導(dǎo)的線粒體自噬過程，損害自噬蛋白質(zhì)降解［30］，HCQ 抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生已經(jīng)成為治療腫瘤一個(gè)新的熱點(diǎn)，同時(shí)，它也可能成為治療腎IRI 的新的切入點(diǎn)。

3.5 羥氯喹通過抗血小板、抗血栓形成減輕腎IRI：腎再灌注可啟動(dòng)對(duì)血流、細(xì)胞有害的炎癥通路。在血管系統(tǒng)中，再灌注可以引起內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致細(xì)胞粘附受體激活，血小板和循環(huán)炎癥細(xì)胞黏附在血管壁上，進(jìn)而刺激血栓形成并減少毛細(xì)血管血流量。在某些情況下，血流雖然在大血管系統(tǒng)中可以得到恢復(fù)，但在微血管系統(tǒng)卻難以重新建立，繼而發(fā)生一系列的血栓形成伴炎癥。因此，血栓形成在腎IRI 中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)，HCQ可能是通過花生四烯酸途徑抑制血小板聚集來發(fā)揮抗血小板功能，HCQ 還能有效改善動(dòng)脈壁彈性，減少血流阻力。除此之外，HCQ 還可能通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5，直接保護(hù)血管內(nèi)皮，減少SLE相關(guān)血管血栓事件發(fā)生。研究證實(shí)，HCQ 抗血栓形成作用可能與HCQ 抑制磷脂雙分子膜聯(lián)蛋白A5 影響抗凝血蛋白的活性有關(guān)，HCQ 可以降低抗磷脂綜合征血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［31］。Rand 等［32］通過使用橢圓光度法和原子力顯微鏡技術(shù)，證明 HCQ 可以抑制抗磷脂抗體 - β2-糖蛋白 Ⅰ 復(fù)合物與磷脂雙分子層的結(jié)合，降低抗磷脂抗體的作用。因此目前認(rèn)為HCQ 是治療抗磷脂綜合征的一種潛在的額外有效療法。

3.6 羥氯喹的其他生物作用：IRI 是腎移植過程中不可避免的重要挑戰(zhàn)，為避免移植腎嚴(yán)重?fù)p害，常以減輕腎IRI 為切入點(diǎn)。腎移植維持階段，為保證移植腎的長(zhǎng)期存活，常需終身服用免疫抑制劑，例如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、雷帕霉素（mTOR 抑制劑）、霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）和激素等，但免疫抑制劑的長(zhǎng)期使用，也伴隨著一些不良反應(yīng)的發(fā)生，例如一些代謝綜合征（高血脂、高血糖）、骨質(zhì)疏松等。而HCQ 還可通過降低血栓事件的發(fā)生率，減少接受類固醇治療的患者的代謝不良反應(yīng)，例如，有效降低總膽固醇和降低空腹血糖濃度，降低動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素［33］，還可以預(yù)防類固醇長(zhǎng)期治療引起的骨質(zhì)疏松癥［34］。除此之外，Virdis等［35］在SLE 小鼠模型中，證實(shí)HCQ 可以減輕由ROS 引起的內(nèi)皮損傷，并且早期施用HCQ 可通過抗氧化作用發(fā)揮血管保護(hù)作用。Gómez-Guzmán M等［36］在狼瘡小鼠中發(fā)現(xiàn)，盡管SLE 特異性抗體抗雙鏈DNA 持續(xù)升高，但經(jīng)過長(zhǎng)期的HCQ 治療，可減少內(nèi)皮功能障礙和器官損傷。

4 總結(jié)及展望

腎臟作為人體重要的器官，是 IRI 最易感的器官之一，腎IRI 是急性腎損傷（acute renal injury，AKI）和繼發(fā)性腎功能喪失的主要原因，并伴隨著嚴(yán)重的發(fā)病率和病死率［37］。IRI 也是器官移植和心胸、血管和普通外科手術(shù)中的主要挑戰(zhàn)，特別在器官移植中發(fā)生率高達(dá) 20%～50% ，并進(jìn)一步導(dǎo)致移植腎功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）、急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）和影響移植腎的長(zhǎng)期存活［38-39］。在過去10 年中，對(duì)IRI 的機(jī)制有了一定的進(jìn)展，涉及炎癥反應(yīng)和一系列的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，例如自噬、凋亡、纖維化和細(xì)胞增殖等。在這一背景下使得在制定相關(guān)治療措施有了更多的新的切入點(diǎn)。HCQ 早期作為抗瘧疾藥廣泛用于臨床，后發(fā)現(xiàn)還可以用于一些自身免疫疾病，如幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎 （juvenile idiopathic arthritis，JIA）、SLE、RA 和干燥綜合征，應(yīng)用于生殖免疫領(lǐng)域也有一定的進(jìn)展［40］，藥理作用得到了更深一步的研究，結(jié)合HCQ 長(zhǎng)期用于臨床，HCQ 通常被認(rèn)為是一種安全的藥物。但是其長(zhǎng)期使用可能會(huì)因?yàn)橐恍﹪?yán)重的不良反應(yīng)而復(fù)雜化，并以視網(wǎng)膜病變?yōu)橹鳎?1］。近年來發(fā)現(xiàn)HCQ 對(duì)IRI 有一定的保護(hù)作用，其相關(guān)機(jī)制可能與一些HCQ 誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，在一系列復(fù)雜的機(jī)制中，基于一系列基礎(chǔ)研究，HCQ 有幾個(gè)比較突出的優(yōu)點(diǎn)。它可以降低器官損傷的風(fēng)險(xiǎn)，還有助于穩(wěn)定基礎(chǔ)代謝（血壓、血脂、血糖等），還可以減少類固醇類免疫抑制劑所帶來的副作用。不過，盡管HCQ 通過一些基礎(chǔ)研究取得了預(yù)料中的有利結(jié)果，但是需要后期更大規(guī)模的后續(xù)研究來確認(rèn)初步的結(jié)果。雖然一些小型臨床試驗(yàn)效果不佳，但我們知道臨床試驗(yàn)總是基于特定的治療策略（例如給藥的劑量和給藥時(shí)間等），這可能會(huì)導(dǎo)致藥物無法達(dá)到預(yù)期的效果。所以我們可以繼續(xù)對(duì)HCQ 保護(hù)腎IRI 保持持續(xù)的關(guān)注。盡管面臨挑戰(zhàn)，但我們希望腎IRI 的新療法能很快融入臨床實(shí)踐。