復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征病人自身抗體在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞促炎作用和功能紊亂

一、研究背景

復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征(complex regional pain syndrome, CRPS)是一種罕見(jiàn)的肢體外傷性手術(shù)并發(fā)癥，可導(dǎo)致受累肢體嚴(yán)重疼痛，除此之外，還表現(xiàn)為感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙，并伴有自主神經(jīng)和營(yíng)養(yǎng)變化，例如水腫和體溫調(diào)節(jié)血流受損。在大約1/3 的病人中，慢性疼痛導(dǎo)致無(wú)法使用受影響的肢體。此外，血管改變和內(nèi)皮功能障礙在CRPS 的病理生理中起主要作用。據(jù)既往研究報(bào)道，在患有慢性CRPS 疾病的病人皮膚組織中存在著血管完整性喪失、皮膚神經(jīng)支配改變和皮膚脈管系統(tǒng)的病理變化。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了進(jìn)一步的病理生理機(jī)制：①外周免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活（如促炎細(xì)胞因子的釋放）和初級(jí)傳入纖維的致敏；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元加工的紊亂，可能與疼痛致敏、運(yùn)動(dòng)障礙和身體知覺(jué)紊亂有關(guān)。此外，已經(jīng)描述了交感神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)支配模式的變化，這可能是由周圍炎癥，對(duì)創(chuàng)傷的中央神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)或由于最近確定的周圍免疫機(jī)制引起的。該研究小組和其他小組已經(jīng)確定了直接針對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)受體的自身抗體包括：M2 受體 (M2R)、腎上腺素β2 受體 (β2AR) 和去甲腎上腺素 α1 受體。除了作為有用的診斷工具外，一些受體自身抗體在體外還具有致病作用，例如自身免疫性心肌病的抗β1 受體和自身免疫性自主神經(jīng)病變的抗α3 乙酰膽堿受體。有趣的是，乙酰膽堿和腎上腺素受體均參與傷害感受、炎癥和自主神經(jīng)功能。HLA-DQ1 和HLA-DR13 與CRPS 的關(guān)聯(lián)進(jìn)一步支持了免疫生理學(xué)的假設(shè)。

β2AR 和M2R 主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞。由于內(nèi)皮功能障礙在CRPS 的病理生理中起主要作用，并且CRPS-IgG 的被動(dòng)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致小鼠后肢切口模型水腫形成增加，針對(duì)β2AR 或M2R 的自身抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響似乎很可能。既往描述了通過(guò)腎上腺素能和毒蕈堿受體激活第二信使途徑（如ERK1/2 或p38）。ERK1/2 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，而p38 在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中的內(nèi)皮細(xì)胞功能中起著核心作用，STAT 是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要致病機(jī)制，使它們成為內(nèi)皮功能的重要調(diào)節(jié)劑。細(xì)胞間黏附分子1 (ICAM-1) 和血管細(xì)胞黏附分子1 (VCAM-1) 參與白細(xì)胞遷移和與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。這些細(xì)胞黏附標(biāo)志物在炎癥事件期間上調(diào)，過(guò)度激活可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞永久性功能障礙。因此，應(yīng)詳細(xì)研究自身抗體對(duì)第二信使途徑和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的影響。該試驗(yàn)研究了針對(duì)β2AR 和M2R 的CRPS 病人的自身抗體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的功能作用，以及這種作用是如何介導(dǎo)的。

二、研究方法

為了測(cè)試病人血清中與內(nèi)皮細(xì)胞的表面結(jié)合自身抗體，分離了IgG 組分，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在2種內(nèi)皮細(xì)胞系上評(píng)估了結(jié)合：人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系 (hCMEC/D3) 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (huvec)?？功?AR 和M2R 的受體自身抗體在CRPS 中已有描述。該研究使用轉(zhuǎn)染這些受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO) 來(lái)評(píng)估IgG 組分的結(jié)合特異性。此外，通過(guò)添加特異性受體拮抗劑（用于M2 的阿托品和用于β2 受體的普萘洛爾）進(jìn)行藥理學(xué)阻斷來(lái)證明結(jié)合特異性。由于結(jié)合研究具有可比性，并且hCMEC/d3顯示β2 和M2 受體的表達(dá)高于HUVEC，因此使用hCMEC/d3 進(jìn)行功能測(cè)定。

進(jìn)行增殖和細(xì)胞毒性測(cè)定以確定自身抗體是否能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞活力。接下來(lái)，檢測(cè)了自身抗體對(duì)不同第二信使途徑（尤其是MAPK 途徑）的影響，以及在功能障礙或炎癥后激活的內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的ICAM-1 和VCAM-1 的變化。補(bǔ)充材料（可在http://links.lww.com/PAIN/B615 獲得）中詳細(xì)描述了常見(jiàn)的技術(shù)（如細(xì)胞培養(yǎng)、IgG 純化和實(shí)時(shí)PCR）。

1.IgG 純化

根據(jù)IASP 研究診斷標(biāo)準(zhǔn)，獲得德國(guó)（批準(zhǔn)編號(hào)：4208 [2004]）萊茵蘭當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的書面知情同意和批準(zhǔn)。血清來(lái)自13 例臨床定義的CRPS 病人（7名女性和6 名男性，平均年齡49.0±16.1 歲，招募間隔：4 年）；11 名健康對(duì)照者（HCs；6 名女性和5 名男性，平均年齡51.5±7.7 歲），7 名radial骨骨折病人（RF；4 名女性和3 名男性，平均年齡50.5±9.9 歲）和10 名周圍動(dòng)脈血管疾病病人（VD；5 名男性和5 名女性，平均年齡53.3±5.9 歲，無(wú)自身免疫病史）作為對(duì)照受試者。使用HiTrapProtein-G柱進(jìn)行IgG 純化，并將IgG 稀釋至最終濃度為1 g/L。HCs 或radial 骨骨折病人均無(wú)慢性疼痛史。

2.自身抗體的表征

為了分析病人的IgG 是否具有針對(duì)人β2AR和人M2R 的功能性自身抗體，使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞過(guò)表達(dá)這些受體（hβ2AR-CHO 和hM2RCHO），HUVEC，hCMEC/D3，16 和HEK293 作為對(duì)照細(xì)胞系。受體表達(dá)通過(guò)免疫印跡證實(shí)。HEK293顯示出hM2R 的高表達(dá)；因此，用CHRM2-siRNA（膽堿能受體毒蕈堿2，編碼hM2R）轉(zhuǎn)染它們，以防止與M2R 的非特異性抗體結(jié)合。

純化的IgG (1 g/L) 與野生型CHO 細(xì)胞吸收以減少非特異性結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)用于檢測(cè)表面結(jié)合抗體，如前所述。與細(xì)胞表面結(jié)合的抗體表示為平均熒光強(qiáng)度。當(dāng)它們顯示出比HCs 的平均值12.5倍SD 更高的抗體結(jié)合時(shí)受試者被認(rèn)為是陽(yáng)性的。

為了驗(yàn)證特異性IgG 結(jié)合，將hβ2AR-CHO，hM2RCHO 和hCMEC/D3 細(xì) 胞 與βAR antagonist（1 mM (±)-鹽酸普萘洛爾；SigmaAldrich，圣路易斯，密蘇里州）或M2R 拮抗劑 (1 mM atropine;Sigma-Aldrich)孵育，然后添加IgG 組分。再將細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞外流式細(xì)胞術(shù)，如上所述。

為了選擇最有效的細(xì)胞系進(jìn)行分析，首先研究了2 種不同的內(nèi)皮細(xì)胞系：永生化hCMEC/D3 和原代分離臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并分析了目標(biāo)受體hβ2AR 和hM2R 的表達(dá)。由于hCMEC/D3 細(xì)胞與HUVEC 相比，這兩種受體的表達(dá)都要高得多，而CRPS-IgG 與hCMEC/D3 細(xì)胞的結(jié)合要強(qiáng)得多，因此功能影響的試驗(yàn)是在hCMEC/D3 細(xì)胞上進(jìn)行的。VD 病人被排除為對(duì)照組，因?yàn)樗麄兊腎gG 完全不與內(nèi)皮細(xì)胞表面結(jié)合，因此不應(yīng)該影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能。為了減少非特異性作用，CRPSIgG 與HEK293 細(xì)胞預(yù)孵育以減少非特異性結(jié)合（詳細(xì)數(shù)據(jù)可在http://links.lww.com/PAIN/B615 上獲得）。

三、研究結(jié)果

1.CRPS 病人的臨床和流行病學(xué)資料

納入的13 例CRPS 病人；在沒(méi)有事先了解臨床或血清學(xué)特性的情況下，盲法選擇血清。女性7例，男性6 例，平均年齡(49.0±16.1)歲，發(fā)病至抽取血清1～170 周。疼痛評(píng)分在2～9 之間，這可能提示一些長(zhǎng)期CRPS 病人的疼痛癥狀部分緩解。大多數(shù)病人病程為3～6 個(gè)月（中位數(shù)為13 周），大多數(shù)病人的CRPS 為I 型。有10 例病人出現(xiàn)了明顯的水腫，但還沒(méi)有進(jìn)一步的量化。

2.CRPS 病人具有針對(duì)腎上腺素能受體和毒蕈堿受體及內(nèi)皮細(xì)胞的特異性自身抗體

RFs 或hcc 病人的CRPS-IgG 與hβ2AR 和hM2R特異性結(jié)合：hβ2AR-CHO 細(xì)胞和hM2R-CHO 細(xì)胞。經(jīng)β 受體阻滯劑心得安或M 受體阻斷劑阿托品預(yù)孵育后，CRPS-IgG 與hβ2AR-CHO 和hM2R-CHO 細(xì)胞的結(jié)合顯著降低。

3.來(lái)自CRPS 病人的IgG 與hCMEC/D3 內(nèi) 皮 細(xì)胞上的hβ2AR 和hM2R 結(jié)合

檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞株hCMEC/D3 和HUVEC 中hβ2AR和hM2R 的蛋白水平和mRNA 水平。兩種細(xì)胞系均在mRNA 和蛋白水平上表達(dá)hβ2AR 和hM2R，但hCMEC/D3 細(xì)胞中hβ2AR 和hM2R 的表達(dá)高于HUVEC。與HC、RF 和VD 相 比，CRPS 病人的IgG 與hCMEC/D3 和HUVEC 的結(jié)合明顯更高。當(dāng)細(xì)胞與hβ2AR 和hM2R 拮抗劑預(yù)孵育時(shí)，CRPS-IgG與hCMEC/D3 細(xì)胞的結(jié)合親和力強(qiáng)度顯著降低，表明觀察到的結(jié)合是hβ2AR 和hM2R 特異性的。

4.來(lái)自CRPS 病人的IgG 會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性，降低內(nèi)皮細(xì)胞的活性

通過(guò)LDH 釋放、WST-1 對(duì)細(xì)胞增殖率的影響，分析HC-IgG、CRPS-IgG、RF-IgG 對(duì)hCMEC/D3細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。與HC-IgG 和RF-IgG 相比，CRPS-IgG 孵育hCMEC/D3 細(xì)胞可誘導(dǎo)明顯更高的細(xì)胞毒作用（CRPS 14.9±5.64vs.HC 1.49±3.87vs.RF 12.81±2.71，P< 0.001）。βAR 和M2R 拮抗劑預(yù)孵育可降低這一效應(yīng)，但不顯著（CRPS 14.90±5.64vs.CRPS + 1 mM 普萘洛爾8.84±7.66vs.CRPS +1 mM 馬特洛平9.88±7.24，P= 0.07）。CRPS-IgG刺激hCMEC/D3 細(xì)胞的增殖率低于HCIgG 和RF-IgG（CRPS 11.55±3.14vs.HC 16.74±0.54vs.RF 16.94±0.40，P< 0.001）。當(dāng)在CRPS-IgG 之前加入bAR 或M2R 拮抗劑時(shí)，對(duì)增殖的抑制作用被顯著拮抗，表明這種作用是通過(guò)這些抗體介導(dǎo)的（CRPS 11.55±3.143vs.CRPS 11 mM(±)-普萘洛爾13.95±2.021，P< 0.01 和CRPS 11.55±3.143vs.CRPS + 1 mM 阿托品14.58± 1.747，P< 0.001）。

5.CRPS-IgG 導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞向促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變

用HC-IgG、CRPS-IgG 和RF-IgG 刺激hCMEC/D3細(xì)胞24 h，RT-PCR 檢測(cè)促炎表面蛋白ICAM-1 和VCAM-1 的相對(duì)基因表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均歸一化為GAPDH。此外，還分析了CRPS-IgG 對(duì)第二信使通路ERK1/2、p38、STAT-1 和AKT 磷酸化的影響。

所有數(shù)據(jù)使用BIO-ID 軟件進(jìn)行量化，并歸一化為各自的總蛋白，如總STAT-1、p38、AKT 和ERK1/2?？瞻自O(shè)置為1（單個(gè)結(jié)果見(jiàn)補(bǔ)充S2-S5，可在http://links.lww.com/PAIN/ B615 上獲得）。

CRPS-IgG 刺 激 的hCMEC/D3 細(xì) 胞 在mRNA 水平上表達(dá)ICAM-1 (P< 0.001)和VCAM-1 (P< 0.05)。與HC-IgG 刺激的細(xì)胞相比，CRPS-IgG 刺激的hCMEC/D3 細(xì)胞促進(jìn)ERK1/2 磷酸化顯著增加3～4 倍(P< 0.001)。用CRPS-IgG 而不是HC-IgG 處理細(xì)胞后，也觀察到類似的磷酸化p38 水平升高3 倍(P<0.001)。還分析了促炎介質(zhì)pSTAT-1 的水平，并觀察到內(nèi)皮細(xì)胞與CRPS-IgG 孵育后磷酸化增加了4～5 倍，而HC-IgG 沒(méi)有顯示出任何影響。此外，CRPS-IgG 刺激的hCMEC/D3 細(xì)胞顯示AKT 磷酸化顯著下調(diào)(P< 0.001)。此外，分析了這些對(duì)炎癥標(biāo)志物的影響是否可以使用各自的拮抗劑逆轉(zhuǎn)。用βAR 拮抗劑（1 mM 鹽酸普萘洛爾）或M2R 拮抗劑（1 mM 阿托品）預(yù)處理hCMEC/D3 細(xì)胞能夠消除對(duì)pERK1/2 磷酸化(P< 0.001)、磷酸化p38 (P< 0.001)、pSTAT-1 (P< 0.001)和pAKT (P< 0.001)的影響。

四、討論

CRPS 是一種慢性疼痛綜合征，其病理生理學(xué)機(jī)制只了解一部分。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明自身免疫性創(chuàng)傷過(guò)程已被檢測(cè)到。這包括局部創(chuàng)傷后炎癥，也包括免疫紊亂。針對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)受體（β2-腎上腺素受體、α1-腎上腺素受體和M2 毒蕈堿乙酰膽堿受體）的自身抗體在體外對(duì)交感神經(jīng)元具有功能影響，既往已被發(fā)現(xiàn)。將CRPS-IgG 轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)導(dǎo)致痛覺(jué)感受器的致敏性增加，不僅在后腿切口動(dòng)物模型中如此，而且在使用CRPS-IgG處理的小鼠皮膚神經(jīng)制劑的離體實(shí)驗(yàn)中也是如此。此外，被動(dòng)地將CRPS-IgG 轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)會(huì)引起行為障礙，支持了這些抗體具有功能活性的假設(shè)。病人的IgG 被動(dòng)轉(zhuǎn)移到小鼠誘導(dǎo)典型癥狀，這強(qiáng)調(diào)了自身抗體在CRPS 發(fā)展中的相關(guān)性。CRPS 中自身抗體的來(lái)源尚不清楚。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，創(chuàng)傷使生理上惰性蛋白質(zhì)或其片段暴露于免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生。分子擬態(tài)可能是這些自身抗體靶向的原因。在該研究中證實(shí)了早期的發(fā)現(xiàn)，CRPS 病人產(chǎn)生了針對(duì)自主神經(jīng)系統(tǒng)受體的IgG 自身抗體。進(jìn)一步研究表明，這些自身抗體在HCs 或橈骨骨折或血管疾病病人的血清中檢測(cè)不到。盡管炎癥在血管疾病的病理生理學(xué)中起著重要的作用，而且自身抗體也在血管疾病中被描述（如抗心磷脂的自身抗體），但這些情況似乎不會(huì)引發(fā)針對(duì)該研究分析的受體的自身抗體。

抗β2AR 和M2R 抗體也在其他自身免疫性疾病中發(fā)現(xiàn)（如自身免疫性心肌病），因此它們似乎不是CRPS 特異性的。腎上腺素受體和毒蕈堿受體可能在痛覺(jué)中起作用。腎上腺素能受體與疼痛之間的相關(guān)性已經(jīng)在前面描述過(guò)，并且已經(jīng)證明疼痛敏感性的增加是通過(guò)β2AR 和β3AR 介導(dǎo)的。這些發(fā)現(xiàn)支持了CRPS 中的自身抗體通過(guò)腎上腺素能或毒蕈堿受體影響疼痛發(fā)展的假設(shè)。

長(zhǎng)期以來(lái)，IgM 自身抗體在CRPS 中的作用一直未被關(guān)注，但最近研究表明，來(lái)自脛骨骨折CRPS 模型小鼠的IgM 被動(dòng)轉(zhuǎn)移到缺乏成熟B 細(xì)胞和免疫球蛋白的小鼠中，導(dǎo)致痛覺(jué)疼痛增加。此外，IgM 在患肢皮膚、坐骨神經(jīng)和腰脊髓中沉積，表明IgM 作為一種促覺(jué)因子的作用。IgM 激活補(bǔ)體系統(tǒng)的能力較強(qiáng)可能是維持這一過(guò)程的重要因素。CRPS的發(fā)展似乎比迄今為止所認(rèn)為的更為復(fù)雜。IgG 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的作用可能是促進(jìn)免疫過(guò)程所必需的，同時(shí)IgM 對(duì)痛覺(jué)神經(jīng)元的敏化可能在疼痛發(fā)展中起作用。為了闡明CRPS-IgM 和CRPS-IgG的作用，還需要進(jìn)一步的動(dòng)物模型研究和更多病人的臨床研究。

血管紊亂包括血管張力調(diào)節(jié)不平衡和毛細(xì)血管功能障礙，已在CRPS 病人中表現(xiàn)出來(lái)，而CRPS通常與患肢水腫有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CRPS-IgG 與內(nèi)皮細(xì)胞表面的hβ2AR 和hM2R 結(jié)合。hM2R 和hβ2AR的藥物阻斷顯著降低了抗原的結(jié)合，證明了抗原的特異性。眾所周知，針對(duì)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的自身抗體可能具有功能性活性（如在重癥肌無(wú)力中）；因此，抗hβ2AR 和hM2R 的自身抗體可能在CRPS 中具有功能性活性。該研究分析了CRPS-IgG 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和第二信使通路激活的影響。CRPS-IgG 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性和較低的增殖率，β2AR 拮抗劑普萘洛爾或M2R 拮抗劑阿托品可特異性拮抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖，證明其作用是通過(guò)這兩種受體介導(dǎo)的。系統(tǒng)性硬化癥（一種自身免疫性風(fēng)濕?。┎∪艘矔?huì)產(chǎn)生抗內(nèi)皮細(xì)胞自身抗體，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這一發(fā)現(xiàn)并非是CRPS 自身抗體所特有的，它也可以出現(xiàn)在其他自身免疫性疾病中。

CRPS-IgG 引起hCMEC/D3 中第二信使ERK1/2、p38 和STAT1 的更高磷酸化，這些信使ERK1/2、p38和STAT1 均參與凋亡、炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。與此同時(shí)，參與增殖的AKT 磷酸化通過(guò)CRPS-IgG被抑制，毒蕈堿和腎上腺素能拮抗劑抵消了這些發(fā)現(xiàn)。ERK1/2 參與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，p38 在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的功能中起核心作用，STAT 是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要致病機(jī)制。這些第二信使的明顯激活提示自身抗體正在影響體外內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)。但必須指出的是，在該研究中使用的是永生細(xì)胞，這可能與原代培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)不同。在早期的研究中，關(guān)于自身抗體功能效應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)是使用表達(dá)感興趣受體的細(xì)胞（如心肌細(xì)胞）進(jìn)行的，因此這種研究體外效應(yīng)的方法是可靠的。

最近報(bào)道了一個(gè)從CRPS 病人被動(dòng)轉(zhuǎn)移IgG到小鼠的動(dòng)物模型，表明IgG 對(duì)小鼠的負(fù)面影響可以通過(guò)IL-1 拮抗劑阿那白滯素治療消除。發(fā)現(xiàn)CRPS-IgG 在體外hCMEC/D3 細(xì)胞中增加了ICAM-1和VCAM-1 的表達(dá)。這些基因的過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致永久性內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙；因此，此處發(fā)現(xiàn)的明顯過(guò)表達(dá)可能導(dǎo)致血管滲漏情況的增加。由于ICAM-1 和VCAM-1 通 過(guò)IL-1 和IL-4 上 調(diào)，IL-1拮抗劑阿那白滯素能夠減少動(dòng)物模型中CRPS 樣癥狀的發(fā)現(xiàn)可能與通過(guò)CRPS-IgG 上調(diào)ICAM-1 和VCAM-1 有關(guān)。

綜上所述，該研究證實(shí)了早期的發(fā)現(xiàn)，CRPS病人產(chǎn)生了針對(duì)自主hβ2AR 和hM2R 的特異性自身抗體，這些抗體也結(jié)合到微血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面受體上。這些自身抗體在體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有功能性影響：①誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，降低內(nèi)皮細(xì)胞活力；②誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子上調(diào)，通過(guò)顯著磷酸化包括MAPK通路在內(nèi)的幾個(gè)促炎通路下游靶點(diǎn)，激活各種轉(zhuǎn)錄因子，從而使內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞生存狀態(tài)急劇下降。因hβ2AR 和hM2R 主要在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞上表達(dá)，這可能部分解釋了潛在的，可能是抗體介導(dǎo)的CRPS 病理。然而，該研究的局限性是這些發(fā)現(xiàn)僅在體外進(jìn)行，樣本數(shù)較少，因此進(jìn)一步在更大的病人群體中進(jìn)行研究，并在動(dòng)物模型中確認(rèn)這些作用，將有助于進(jìn)一步了解CRPS的病理生理學(xué)機(jī)制。