清火梔麥片中化學(xué)成分的SPE—HPLC—ESI—MSⁿ快速識別與鑒定

張加余,喬延江,高曉燕,張倩,馬群,盧建秋

[摘要] 目的：建立一種固相萃取-高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-HPLC-ESI-MSn）分析方法，對清火梔麥片中主要的化學(xué)成分進(jìn)行快速識別與鑒定。方法：根據(jù)HPLC-ESI-MSn負(fù)離子模式下的分子離子峰以及碎片離子獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息，并通過與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)或?qū)φ掌穼φ?，確定化合物可能的結(jié)構(gòu)。結(jié)果：通過對清火梔麥片及其組方藥味進(jìn)行比較分析，歸屬并鑒定了其中的39個化學(xué)成分，包括7個咖啡?？崴帷?個環(huán)烯醚萜、6個二萜內(nèi)酯、5個高異黃酮、13個甾體皂苷以及1個黃酮類成分。結(jié)論：該研究為鑒別清火梔麥片中的化學(xué)成分提供了一種簡便、快速的方法。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜；固相萃取；清火梔麥片；化學(xué)成分鑒定

中藥是通過“多成分、多靶點、多途徑”模式來發(fā)揮整體藥效的。因此，闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥現(xiàn)代研究的重點基礎(chǔ)性工作。近年來，液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS）聯(lián)用技術(shù)將高效液相色譜優(yōu)秀的分離能力與質(zhì)譜高靈敏度和高專屬性的檢測有機地結(jié)合在一起，為中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分的快速識別和鑒定提供了重要的方法[1-7]。

清火梔麥片收載于2010年版《中國藥典》一部，由穿心蓮、梔子、麥冬3味藥組成，方中穿心蓮清熱解毒、涼血消腫，梔子瀉火除煩、清肝明目，麥冬養(yǎng)陰生津、潤肺清心，3味藥合用共奏清熱解毒、涼血消腫之功效，主要用于肺胃熱盛所致的咽喉腫痛、發(fā)熱、牙痛、目赤等[8]。目前，該制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究工作比較薄弱，僅有數(shù)篇針對制劑中主要成分穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心內(nèi)酯、梔子苷的含量測定方法研究[9-10]。為了闡明清火梔麥片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用SPE-HPLC-ESI-MSn對其中主要的化學(xué)成分進(jìn)行了快速歸屬和鑒定。

1 材料

Agilent 1100 series液相色譜儀系統(tǒng)；Agilent XCT plus型電噴霧離子阱質(zhì)譜儀系統(tǒng)；KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， Waters Sep-Pak-C18固相萃取柱。色譜級乙腈和甲醇均購自Fisher Scientific，乙酸購自Sigma Aldrich，超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore， USA）制得。

梔子苷（批號 110749-200714），穿心蓮內(nèi)酯（批號 110797-200307），脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號 110854-200306）購自中國食品藥品檢定研究院；綠原酸，新綠原酸，異綠原酸A，異綠原酸C，山梔苷，京尼平苷等對照品購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均大于98%；麥冬皂苷D，麥冬皂苷C，sprengerinin C，14-hydroxy sprengerinin C，麥冬黃烷酮A，甲基麥冬高異黃酮A，甲基麥冬二氫高異黃酮B等對照品均為從麥冬藥材中分離得到，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR，13C-NMR等手段得以確定，經(jīng)HPLC歸一化法檢測，純度均大于95%，可作對照品使用。清火梔麥片購自廣西圣民制藥有限公司，批號110301；穿心蓮Andrographis paniculata和梔子Gardenia jasminoides Ellis購自北京同仁堂藥店，麥冬Ophiopogon japonicus購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院喬延江教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》規(guī)定。

2 方法

2.1 色譜條件

采用Agilent-Zorbax Extend C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相A為乙腈-甲醇（3∶1）混合溶液，B為0.2%乙酸水溶液；線性梯度洗脫，0～5 min，2%～8% A；5～10 min，8%～12% A；10～20 min，12%～15% A；20～25 min，15%～21% A；25～36 min，21%～24% A；36～42 min，24%～24% A；42～56 min，24%～36% A；56～72 min，36%～36% A；72～90 min，36%～49% A；90～120 min，49%～81% A。流速1.0 mL·min^-1；柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器（DAD）記錄200～400 nm紫外光譜圖，檢測波長為254 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

負(fù)離子模式檢測；霧化氣和干燥氣均為氮氣，碰撞氣為氦氣；干燥氣流速11 L·min^-1；霧化室壓力275.79 kPa；霧化溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓3 500 eV；目標(biāo)質(zhì)量數(shù)m/z 500，全掃描范圍為m/z 100～1 400；多級質(zhì)譜為3級；化合物穩(wěn)定性（compound stability）為100%；離子阱驅(qū)動水平（trap drive level）為50%。流動相進(jìn)入質(zhì)譜檢測器的量為0.25 mL·min^-1。

2.3 對照品溶液的配制

分別取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成約0.1 g·L-1的儲備液。將對照品儲備液用甲醇稀釋10倍后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為5 μL。

2.4 清火梔麥片及其組方藥味供試品溶液的制備

取清火梔麥片，除去糖衣，研細(xì)，取2.0 g，精密稱定，置50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，超聲提取30 min，放冷，搖勻，濾過，水浴揮至近干后用2 mL水溶解，過固相萃取小柱（預(yù)先以2 mL甲醇和2 mL水平衡），依次用水和90%甲醇各5 mL洗脫，收集90%甲醇洗脫部分，水浴濃縮，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得制劑供試品溶液。按處方量分別稱取單味藥材，同法制成梔子、穿心蓮、麥冬供試品溶液。所有供試品溶液均以0.22 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣量為5 μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 供試品溶液制備條件的優(yōu)化

清火梔麥片處方中梔子和穿心蓮（處方量一半）是原粉形式入藥的，而麥冬和另一半的穿心蓮藥材則是以水提物制成制劑的。由于麥冬藥材中含有大量的多糖，其主要的指標(biāo)性成分甾體皂苷和高異黃酮都極易被掩蓋而難以被檢測到。為了在HPLC-ESI-TIC圖中更好地體現(xiàn)出3味中藥的配伍應(yīng)用，實驗采用固相萃取法除去制劑中的糖類等的干擾，從而檢出麥冬中的甾體皂苷和高異黃酮類成分。

3.2 液質(zhì)分析條件的優(yōu)化

常規(guī)的反相色譜流動相多采用甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)，但實驗結(jié)果表明，采用乙腈-甲醇-水三元系統(tǒng)時樣品的色譜峰數(shù)量最多，且各色譜峰分離度好，保留時間適中，故選擇乙腈-甲醇-水梯度系統(tǒng)為流動相。同時，為減少黃酮等酸性成分在色譜柱上的拖尾情況，并提高各類成分的質(zhì)譜檢測響應(yīng)強度，實驗采用乙酸作為改性劑。制劑中的高異黃酮、環(huán)烯醚萜以及咖啡?？崴岬瘸煞衷贒AD上響應(yīng)較強，而甾體皂苷類成分在MS上響應(yīng)較好，綜合考慮以上因素，并優(yōu)化了液相分析條件，選擇254 nm作為檢測波長，結(jié)果見圖1。

實驗還對質(zhì)譜的干燥氣流速、霧化室壓力、霧化溫度以及毛細(xì)管電壓等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。制劑中的各類成分均有較高的響應(yīng)值，利于后續(xù)的LC-MS數(shù)據(jù)分析，見圖2。

3.3 化學(xué)成分的鑒定

清火梔麥片是由3味中藥原粉或提取物制成的，所含的化學(xué)成分類型繁多，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜。在HPLC-ESI-MSn分析過程中，通過分析ESI-MS/MS提供的化合物分子量信息、多級質(zhì)譜裂解碎片的種類以及相對豐度等信息，并結(jié)合文獻(xiàn)報道，從其中快速鑒定了39個化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

3.3.1 咖啡奎尼酸類成分的鑒定 咖啡酰奎尼酸類（caffeoylquinic acids）化合物是一類由奎尼酸和不同數(shù)目的咖啡酸通過酯化反應(yīng)縮合而成的酚酸類化合物，廣泛存在于自然界植物中，具有顯著的抗氧化活性[11]。從制劑和各藥味的TIC色譜圖對比可以看出，成方中的該類成分均來源于穿心蓮和梔子藥材。

化合物1的t_R為2.9 min，表明其極性非常大，其[M-H]^-離子在MS ²譜和MS ³譜中均可見中性丟失水分子（18 Da）的反應(yīng)，說明該化合物結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基基團，因此將其鑒定為咖啡?？崴犷惓煞稚锖铣傻脑现弧崴帷?/p>

化合物4，8，9均產(chǎn)生相同的[M-H]^-離子m/z 353，同時在MS ²譜中還產(chǎn)生m/z 191 [奎尼酸-H] ^-離子或m/z 179 [咖啡酸-H] ^-等，表明它們?yōu)閱慰Х弱？崴犷惓煞?。一般說來，當(dāng)咖啡?；〈?或5位時，都會產(chǎn)生m/z 191的基峰離子，但前者產(chǎn)生的m/z 179豐度較后者要高，而當(dāng)咖啡酰基取代在4位時，m/z 173 [191-H₂O]^-是其MS ²譜的基峰離子[12]。據(jù)此推斷它們分別為新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸，這和通過與對照品比對得出的結(jié)論一致。

化合物13，14，16均產(chǎn)生相同的[M-H]^-離子m/z 515以及m/z 353離子，據(jù)此可斷定它們?yōu)槎Х弱？崴犷惓煞帧乃槠x子的種類以及數(shù)量來看，三者基本相同，但所產(chǎn)生的離子豐度存在較大差異。化合物14的MS ³譜中只產(chǎn)生了m/z 191的基峰離子，推斷咖啡酰基取代位置位于3，5位，因此可以將其鑒定為異綠原酸A。而其他2個化合物，ESI-MS ³譜均產(chǎn)生m/z 179，173的碎片離子，可確定它們結(jié)構(gòu)中的一個咖啡?；〈恢梦挥?位。由于異綠原酸A在反相柱上較異綠原酸C容易被洗脫下來[13]，因此推斷化合物13，16分別為異綠原酸B和異綠原酸C。上述推斷也與通過與對照品比對得出的結(jié)論相符。

3.3.2 環(huán)烯醚萜類成分的鑒定 環(huán)烯醚萜類（iridoids）化合物是一類具有環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)單元的單萜衍生物，是梔子的主要有效成分。在清火梔麥片的ESI-TIC譜中，化合物3和6的[M-H]^-離子分別為m/z 389，373，裂解方式也存在差異：后者在MS ²譜中先中性丟失CO₂，形成m/z 345，其后在MS ³譜中繼續(xù)丟失1分子葡糖糖殘基和1分子H₂O，得到m/z 165，而前者的裂解順序正好顛倒。在上述裂解過程中，前者中性丟失了2分子CO₂，而后者只脫掉了1分子CO₂，表明后者分子結(jié)構(gòu)中有可能比后者少1個羧基，故將兩者分別鑒定為secologanoside和 secologanic acid[14]?；衔?，5，7，10，11在負(fù)離子模式下的二級碎片多為丟失葡萄糖殘基 （162 Da），生成穩(wěn)定的[M-H-glu]^-或[M-H-2glu]^-離子，同時伴有中性丟失H₂O和CO₂等。根據(jù)對照品比對結(jié)果和文獻(xiàn)報道[15]，上述化合物的結(jié)構(gòu)均得到了準(zhǔn)確鑒定或推斷。

3.3.3 二萜內(nèi)酯類成分的鑒定 二萜內(nèi)酯類（diterpenoid lactones）化合物是穿心蓮主要的藥理活性成分。在負(fù)離子模式下，該類化合物極易產(chǎn)生豐度最大的[M+CH3COO]^-離子，同時通過中性丟失乙酸（60 Da）、葡萄糖殘基（162 Da）或H₂O（18 Da）等而產(chǎn)生診斷離子m/z 331（穿心蓮內(nèi)酯類）或m/z 317（新穿心蓮內(nèi)酯類）。根據(jù)ESI-MS/MS提供的分子量和離子碎片信息，結(jié)合已知化合物穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的ESI-MS/MS裂解特征，對制劑中的二萜內(nèi)酯類化合物進(jìn)行了鑒定或嘗試性指認(rèn)[16-18]。

3.3.4 高異黃酮類成分的鑒定 高異黃酮類（homoisoflavonoids）化合物是麥冬藥材的特征性化學(xué)成分。有關(guān)高異黃酮類化合物電噴霧離子阱質(zhì)譜的裂解規(guī)律已有較多的文獻(xiàn)研究[19-21]。研究表明，其裂解途經(jīng)與普通黃酮類化合物有顯著的差別，二氫高異黃酮及高異黃酮有各自獨特的裂解途徑，見圖3。結(jié)合上述裂解規(guī)律，從制劑中檢測到5個高異黃酮類成分，通過與對照品對照比對準(zhǔn)確鑒定了3個化合物的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合保留時間、質(zhì)譜裂解規(guī)律對其余2個化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測。

3.3.5 甾體皂苷類成分的鑒定 甾體皂苷類（steroidal saponins）成分是麥冬藥材的另一類特征性化學(xué)成分。在負(fù)離子模式下，它們的ESI-MS譜主要生成[M-H]^-及[M+CH3COO]^-準(zhǔn)分子離子。不同化合物準(zhǔn)分子離子的多級質(zhì)譜裂解途徑非常相似，均表現(xiàn)為一系列糖殘基（葡萄糖、鼠李糖、木糖等）的丟失。對于糖鏈部分有乙?；〈幕衔?，[M-H]^-離子在它們的MS/MS譜中會丟失乙烯酮基（42 Da）特征碎片，此外尚可觀察到[M-H-CH2CO-H₂O]^-離子信號。根據(jù)上述規(guī)律，共從制劑中檢測到了13個甾體皂苷類成分。通過與對照品比對保留時間以及多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確鑒定了4個甾體皂苷的結(jié)構(gòu)，并參考文獻(xiàn)對其余9個化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷[22-24]。

3.3.6 其他類成分的鑒定 在制劑中，尚有其他類成分存在。如化合物12（tR=30.6 min），其ESI-MS中的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 609，其在進(jìn)一步的裂解中通過丟失蕓香糖殘基而產(chǎn)生m/z 301，并接著發(fā)生一系列與黃酮類成分相似的ESI-MS/MS裂解反應(yīng)。因此將其鑒定為蘆?。╮utin）。

4 討論

實驗表明，本文應(yīng)用建立的SPE-HPLC-ESI-MSn從清火梔麥片中快速鑒定了39個化合物，包括7個咖啡?？崴帷?個環(huán)烯醚萜、6個二萜內(nèi)酯、5個高異黃酮、13個甾體皂苷以及1個黃酮類成分。在這些化合物中，來源于穿心蓮藥材的有14個，來源于梔子藥材的有15個，來源于麥冬藥材的有18個，其中有8個化合物來源于穿心蓮和梔子2味藥材。

同時，由于紫外檢測器的局限和對照品的缺乏，采用傳統(tǒng)的HPLC根本無法闡明該中藥制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)。而本研究所建立的SPE-HPLC-ESI-MSn不僅將固相萃取法應(yīng)用于樣品前處理過程中，而且將靈敏度高、檢測范圍廣的ESI-MS/MS技術(shù)應(yīng)用于成分的快速識別和鑒定中，通過質(zhì)譜檢測器提供的分子離子峰以及離子碎片獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合文獻(xiàn)報道的化學(xué)成分以及質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)，對清火梔麥片中的化學(xué)成分進(jìn)行了深入研究，為闡明清火梔麥片的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一種簡便、快速的方法。

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Rapid recognition and identification of chemical constituents in

Qinghuo Zhimai tablets by SPE-HPLC-ESI-MSn

ZHANG Jia-yu1，2， QIAO Yan-jiang1*， GAO Xiao-yan2， ZHANG Qian1， MA Qun1， LU Jian-qiu2*

（1.School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2.Center of Scientific Experiment， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] Objective： To establish a method for analyzing solid phase extraction-high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry （SPE-HPLC-ESI-MSn）， in order to recognize and identify the main chemical constituents in Qinghuo Zhimai tablets.Method： The possible structures of the compounds were determined according to the structure information of compounds observed from molecular ion peaks and fragment ions in HPLC-ESI-MSn negative ion mode and by comparing with literature data or control samples.Result： Through the comparative analysis on Qinghuo Zhimai Tablets and components of its formula， 39 chemical constituents were identified， including 7 caffeoylquinic acids， 7 iridoids， 6 diterpenoid lactones， 5 homoisoflavonoids， 13 steroidal saponins and 1 flavone glycoside.Conclusion： This study provides a simple and rapid method for identifying chemical components in Qinghuo Zhimai tablets.

[Key words] HPLC-ESI-MSn； SPE； Qinghuo Zhimai tablets； identification of chemical constituents

doi：10.4268/cjcmm20130209

[責(zé)任編輯 曹陽陽]