草甘膦與微塑料對西方蜜蜂生存和糖反應行為的影響

李 強,李華金,黃宏博,劉 芳,劉慧平,趙紅霞*

(1.廣東省科學院動物研究所,廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室,廣州 510260;2.云浮市城鄉(xiāng)規(guī)劃編制研究中心,廣東云浮 527300)

蜜蜂是生態(tài)系統(tǒng)中重要的傳粉者之一,能通過采集行為進行短距離與長距離的傳粉。蜜蜂除了為自然界植物傳粉外,還能把采集到的花蜜花粉帶回蜂巢生產(chǎn)蜂蜜、蜂王漿和蜂膠等營養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品(胡浩等,2022)。目前研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜、蜂毒和蜂王漿等蜜蜂產(chǎn)品具有很高的應用價值。例如,蜂蜜具有抗菌特性,蜂毒可用于治療疾病,蜂王漿可促進健康和長壽(Marrazzo, 2021)。早在2006年,Nature公布了西方蜜蜂Apismellifera基因組的測序和分析結(jié)果,指出“如果沒有蜜蜂及其授粉的行為,整個自然生態(tài)系統(tǒng)將會崩潰”(Erika, 2006)。在中國,蜜蜂的傳粉對36種的作物生產(chǎn)貢獻了高達8 860.5億元的經(jīng)濟價值(歐陽芳等,2019)。據(jù)統(tǒng)計,2020年我國出口的蜂蜜高達132 469.35噸,其價值高達25 404.496萬美元(杜夏等,2021)。

由于農(nóng)林牧業(yè)病蟲害的頻繁發(fā)生,種植戶為了減少損失,普遍使用了化學農(nóng)藥(Wuetal., 2012)。但這也導致農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染日漸嚴重,使蜜蜂和其他傳粉者生命受到威脅。市場上銷售的除草劑種類眾多,草甘膦是使用最為廣泛的除草劑,草甘膦在1950年被瑞士化學家亨利·馬丁博士發(fā)現(xiàn),具有高效、低成本的特點(Franzetal., 1997; Giesyetal., 2000; Dilletal., 2010; Benbrooketal., 2016)。在用草甘膦處理過的農(nóng)作物相關產(chǎn)品中,都檢測到了草甘膦的殘留,除了植物,在動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了草甘膦的存在,這是由于被草甘膦污染過的植物和水源會通過食物鏈進入動物體內(nèi)。已有研究發(fā)現(xiàn)殘留在蜜蜂體內(nèi)的草甘膦會對蜜蜂造成負面影響,例如在蜂蠟中發(fā)現(xiàn)的草甘膦會導致新工蜂的觸角上的鞭毛和觸角產(chǎn)生縮短等畸形(Tometal., 2020)。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)草甘膦能夠?qū)е旅鄯溲氏孪偌毎某⒔Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變,但是對蜂王漿的產(chǎn)量沒有明顯影響(Faitaetal., 2018)。

除化學殺蟲劑外,自上世紀起,塑料的生產(chǎn)和使用都在高速增加,但是塑料在自然生態(tài)系統(tǒng)中降解性極低,會導致嚴重的環(huán)境污染。污染環(huán)境的塑料主要被分為巨塑料與微塑料,微塑料是直徑小于5 mm的顆粒(Anitaetal., 2021)。微塑料會進入生物體內(nèi),對生物生存造成影響,在生態(tài)環(huán)境中普遍存在微塑料。中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所蜂產(chǎn)品質(zhì)量與風險評估創(chuàng)新團隊發(fā)現(xiàn),微塑料暴露是危害蜜蜂健康的重要風險因子。相關研究發(fā)現(xiàn),微塑料的暴露會降低蜜蜂的取食量和體重,高濃度的微塑料還會顯著降低蜜蜂腸道的微生物多樣性并改變腸道的微生物群的組成(沈宇濤,2022)。另外,微塑料的存在還影響蜜蜂腸道的氧化應激、解毒和免疫系統(tǒng)相關基因的表達。例如,微塑料增加了氧化應激相關基因Cat的表達、降低了解毒基因CypQ1和GstS3的表達,免疫相關基因Domeless、Hopscotch和Symplekin也會隨著微塑料的劑量反應趨勢受到抑制(Wangetal., 2021)。

目前關于農(nóng)藥與蜜蜂的研究大多針對毒性較大的殺蟲劑如吡蟲啉和噻蟲嗪開展的,而對微塑料和毒性較低的除草劑草甘膦的研究相對較少。本研究利用含400 mg/L草甘膦、50 mg/L微塑料和兩者混合的50%蔗糖溶液飼喂1日齡的西方蜜蜂,通過飼喂20 d記錄生存率和進行糖反應試驗來探究草甘膦與微塑料對西方蜜蜂的影響,研究結(jié)果有助于提供除草劑草甘膦和微塑料對蜜蜂潛在風險的一些主要信息,以期為除草劑草甘膦的合理使用提供理論依據(jù),并為研究微塑料對生態(tài)系統(tǒng)的毒性作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲的準備

試驗于2021年10月至2021年12月在廣東省科學院動物研究所進行,供試昆蟲為西方蜜蜂,取自廣東省科學院動物研究所試驗蜂場,取3張不同蜂群的即將出房的封蓋子子脾,于培養(yǎng)箱(30±1℃,相對濕度80%)培養(yǎng)至出房后,收集24 h以內(nèi)出房的蜜蜂(作為1日齡蜜蜂)。

1.2 微塑料和草甘膦濃度設置

根據(jù)Paride(2022)檢測微塑料和多磺酸粘多糖(MPs)對西方蜜蜂的存活、食物攝取、蔗糖反應性、蔗糖習慣性和食欲嗅覺學習和記憶的影響,本研究的微塑料濃度定位50 mg/L;根據(jù)Lou(2021)檢測商業(yè)草甘膦對蜜蜂嗅覺學習和記憶的影響,本研究配置的草甘膦濃度為400 mg/L。

1.3 試驗處理

將羽化的1日齡西方蜜蜂工蜂采集到經(jīng)過處理的透明塑料航空杯里(航空杯上有喂糖水和呼吸的孔),平均分成4個組,每組設置3個重復,每個重復飼養(yǎng)130頭蜜蜂,放入培養(yǎng)箱(29±1℃,相對濕度80%)。對照組(CK組)用50%蔗糖溶液飼養(yǎng),微塑料處理組(PE組)在50%蔗糖溶液的基礎上添加50 mg/L微塑料飼養(yǎng),草甘膦處理組(SA組)在50%蔗糖溶液的基礎上添加400 mg/L草甘膦飼養(yǎng),微塑料和草甘膦聯(lián)合處理組(PEA組)在50%蔗糖溶液的基礎上添加50 mg/L微塑料和400 mg/L草甘膦飼養(yǎng)。每個組蔗糖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配,兩天更換一次食物。每天統(tǒng)計死亡的蜜蜂數(shù)量并及時更換蜜蜂排泄物(圖1)。

圖1 飼養(yǎng)西方蜜蜂的裝置Fig.1 A device for keeping Apis mellifera worker bees

1.4 PER行為實驗

在飼養(yǎng)的第20天,從每個處理組隨機選取60頭蜜蜂進行伸吻反應(PER)行為測試,將選取出來的蜜蜂低溫麻醉,把蜜蜂固定在空心透明塑料管中,身體固定在管里,頭部外露可以自由活動。固定好的蜜蜂每頭喂5 μL 50%蔗糖溶液后放在培養(yǎng)箱里(29±1℃,相對濕度80%),饑餓處理2 h。

利用梯度濃度增加的糖水觸發(fā)PER反應檢測蜜蜂的糖反應行為(Pageetal., 1998)。配制各不同濃度梯度的蔗糖溶液:0.1%、0.3%、1%、3%、10%、30%和50%(W∶W)。蜜蜂饑餓2 h后,首先進行蜜蜂對不同濃度蔗糖敏感性的測試,根據(jù)蔗糖濃度由低到高依次檢測。具體步驟:第一,先用蘸有清水的牙簽輕輕觸碰蜜蜂的兩只觸角,觀察蜜蜂伸吻情況;第二,用蘸有0.1%糖水的牙簽觸碰蜜蜂觸角,觀察伸吻情況;第三,接著用蘸有水的牙簽輕輕觸碰蜜蜂的兩只觸角,再用蘸有0.3%糖水的牙簽觸碰蜜蜂觸角,依次進行蔗糖溶液10%、30%和50%。最后,每次用不同濃度糖水檢測后都用清水檢測一遍,不同濃度的糖水刺激間隔在2～3 min。蜜蜂正常表現(xiàn)出伸吻反應的標準:當糖水依次、輪流地接觸被檢測蜜蜂的兩只觸角時,蜜蜂能夠完全伸展出它的吻,則記錄該只蜜蜂對該濃度糖水做出反應;如果蜜蜂的吻沒有完全伸展開,則記錄該只蜜蜂未做反應。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的整合處理分析和繪圖利用WPS Office 2020、IBM SPSS Statistics 25和GraphPad Prism 9共3種軟件,其中利用WPS Office中的Excel處理存活率和糖反應數(shù)據(jù),采用Duncan法分析數(shù)據(jù),用GraphPad作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦與微塑料對西方蜜蜂存活的影響

草甘膦和微塑料無論是單一還是協(xié)同,均對西方蜜蜂有潛在的風險。從1日齡西方蜜蜂飼養(yǎng)第1天到第20天,每天記錄西方蜜蜂的存活情況,進行單因素方差分析,每個處理(CK、PE、SA、PEA)都有3個生物學重復(圖2)。與對照組CK相比,實驗組PE、SA和PEA都降低了蜜蜂工蜂的存活率。PE組與CK相比,蜜蜂的存活率在第12天和第20天分別下降了5%和9%(P>0.05),說明微塑飼料不會對蜜蜂的存活率造成影響;SA組與CK相比,蜜蜂的存活率在第12天和第20天分別下降了14%和22%(P<0.05),400 mg/L草甘膦與50 mg/L微塑料相比,400 mg/L草甘膦對蜜蜂存活率影響更加大,兩者之間存活率差異顯著(P<0.05);微塑料與草甘膦協(xié)同處理蜜蜂的試驗組,蜜蜂生存狀況最差,存活率最低,與CK相比,蜜蜂的存活率在第12天和第20天分別下降了17%和30%(P<0.05),與單一飼養(yǎng)的PE和SA組相比,其存活率均差異顯著(P<0.05)

圖2 草甘膦與微塑料對西方蜜蜂存活的影響Fig.2 Effects of glyphosate and microplastics on the survival of Apis mellifera

2.2 微塑料對西方蜜蜂糖反應的影響

蜜蜂糖反應檢測結(jié)果顯示50 mg/L微塑料處理組蜜蜂對糖的反應顯著低于對照組,說明在飼養(yǎng)20 d出房蜜蜂階段接觸50 mg/L微塑料會降低蜜蜂對糖水溶液的敏感性,這種影響集中表現(xiàn)在0.1%、0.3%、1%、3%和10%的蔗糖溶液中,糖水濃度為3%時,微塑料處理組的伸吻反應比例與對照組相比下降了19%,而當糖水濃度增加到30%時,兩組蜜蜂的伸吻反應率相差僅9%,說明50 mg/L微塑料處理對高濃度糖水的伸吻反射影響有所降低(圖3)。

圖3 50 mg/L微塑料對西方蜜蜂糖反應的影響Fig.3 Effect of 50 mg/L microplastics on sugar responses in Apis mellifera注:誤差線為平均值±標準誤,*P<0.05表示處理組與對照組蜜蜂喙伸反應率經(jīng)χ2檢驗差異顯著。Note: Error lines were mean±SE, *P<0.05 indicated that there was significantly different in proportion of bees showing PER in sucrose concentrations by χ2 test between the treatment and control groups.

2.3 草甘膦對西方蜜蜂糖反應的影響

與對照組相比,400 mg/L飼養(yǎng)的SA組蜜蜂的伸吻反應顯著降低P<0.05。在0.3%～3%的糖水區(qū)間,試驗組的伸吻反應降低不明顯;當糖水濃度為3%時,試驗組的伸吻反應與對照組相比降低了21%;在高濃度糖水(10%、30%),試驗組與對照組對糖水的伸吻反應分別降低了33%和30%,說明草甘膦降低了蜜蜂的伸吻反應,在糖濃度為10%時影響最顯著(圖4)。

圖4 400 mg/L草甘膦對西方蜜蜂糖反應的影響Fig.4 Effect of 400 mg/L glyphosate on sugar responses in Apis mellifera注:誤差線為平均值±標準誤,*P<0.05表示處理組與對照組蜜蜂喙伸反應率經(jīng)χ2檢驗差異顯著,**P<0.01表示處理組與對照組蜜蜂喙伸反應率經(jīng)χ2檢驗差異極顯著。Note: Error lines were mean±SE, *P<0.05 indicated that there was significantly different in proportion of bees showing PER in sucrose concentrations by χ2 test between the treatment and control groups, **P<0.01 indicated that there was extremely different in proportion of bees showing PER in sucrose concentrations by χ2 test between the treatment and control groups.

2.4 微塑料與草甘膦協(xié)同對西方蜜蜂糖反應影響

CK與PEA試驗組蜜蜂伸吻反應整體上都呈遞增上升趨勢,在0.1%～3%糖水濃度之間,CK在10%和30%糖水的伸吻反應提升明顯,而PEA處理組伸吻反應率整體顯著低于對照組。當糖水濃度為30%時,與對照組相比,PEA伸吻反應率降低了45%,效果極顯著(P<0.001)(圖5)。在低濃度糖水時,對照組與試驗組的伸吻反應沒有顯著差異,對高濃度糖水的伸吻反應差異明顯。這一結(jié)果顯示了草甘膦與微塑料兩者混合在一起,對蜜蜂的毒性是存在的,可能兩者混合對蜜蜂的毒性更強,也可能一方增加了另一方對蜜蜂的毒性,但可以肯定的是草甘膦與微塑料混合不會減少對蜜蜂的毒性,只會增加對蜜蜂的威脅。

圖5 50 mg/L微塑料與400 mg/L草甘膦協(xié)同對西方蜜蜂的影響Fig.5 Synergistic effect of 50 mg/L micro plastic and 400 mg/L glyphosate on Apis mellifera注:誤差線為平均值±標準誤,*P<0.05表示處理組與對照組蜜蜂喙伸反應率經(jīng)χ2檢驗差異顯著,**P<0.01,***P<0.001表示處理組與對照組蜜蜂喙伸反應率經(jīng)χ2檢驗差異極顯著。Note: Error lines were mean±SE, *P <0.05 indicated that there was significantly different in proportion of bees showing PER in sucrose concentrations by χ2 test between the treatment and control groups, **P<0.01, ***P<0.001 indicated that there was extremely different in proportion of bees showing PER in sucrose concentrations by χ2 test between the treatment and control groups.

3 結(jié)論與討論

蜜蜂外出采集花蜜花粉時會不可避免地接觸到有機磷除草劑,采集蜂會將帶有草甘膦殘留的花粉花蜜帶回蜂巢中,導致草甘膦在蜂箱中積累,使其他蜜蜂也暴露其中(Farinaetal., 2019)。同時不少研究發(fā)現(xiàn)在蜜蜂采集花蜜花粉的植物中,發(fā)現(xiàn)其花上有微塑料(Liebezeitetal., 2014),也會對蜜蜂的安全造成潛在威脅。

因此本研究主要探討了草甘膦與微塑料對西方蜜蜂生存及糖反應的影響,結(jié)果顯示400 mg/L的草甘膦處理組與對照組相比,蜜蜂的存活率降低了22%,同時也顯著降低了蜜蜂對蔗糖水的敏感性。與對照組相比,400 mg/L的草甘膦處理組的伸吻反應比率降低了30%。本研究還通過讓蜜蜂食用含有微塑料的50%蔗糖水,讓蜜蜂直接接觸微塑料。試驗結(jié)果表明,用50 mg/L微塑料飼養(yǎng)20 d后,蜜蜂的死亡率為29%,證明微塑料會對蜜蜂的生存有潛在威脅。此外,50 mg/L的微塑料處理后,也觀察到處理組的伸吻反應比率與對照組降低了10%,表明蜜蜂對蔗糖的敏感性顯著降低。這與Herbert(2014)發(fā)現(xiàn)長期和急性暴露于草甘膦均會導致西方蜜蜂工蜂的短期記憶保持能力降低的結(jié)果一致。此外,Luo(2021)發(fā)現(xiàn)商業(yè)草甘膦的應用也產(chǎn)生了類似的結(jié)果。當使用商業(yè)推薦濃度的草甘膦時,都降低了西方蜜蜂工蜂對蔗糖的反應性和嗅覺學習能力。最后,本研究還用400 mg/L草甘膦與50 mg/L微塑料協(xié)同對蜜蜂處理20 d,結(jié)果表明,蜜蜂的存活率降低了30%、蜜蜂的伸吻反應比率下降了45%,與兩者單一相比,蜜蜂存活率顯著降低、對蔗糖水的敏感性顯著降低。因此有理由相信兩者在蜜蜂體內(nèi)共存時會對蜜蜂的生存和日常行為有非常嚴重的影響。

目前除草劑對蜜蜂在生理、行為和壽命等方面已經(jīng)開展相關研究(Helmeretal., 2015; Jumarieetal., 2017; Zhuetal., 2017),而對蜜蜂低毒的草甘膦的研究較少,微塑料對蜜蜂的研究更是少數(shù)。本研究僅從存活率和蔗糖敏感性方面探討了400 mg/L草甘膦與50 mg/L微塑料單一或協(xié)同對西方蜜蜂的影響,通過草甘膦與微塑料單一或協(xié)同對蜜蜂的處理,揭示了對蜜蜂低毒的草甘膦也會對蜜蜂造成生命安全,威脅蜂群的生存。草甘膦與微塑料相結(jié)合,將兩者對蜜蜂的危害放大,揭示了除草甘膦外其他除草劑、殺蟲劑和殺螨劑等化學農(nóng)藥也會同微塑料一起危害蜜蜂的安全。蜜蜂是生存在一個很復雜又很開放的生態(tài)環(huán)境中,其接觸到的農(nóng)藥不單單是草甘膦一種(陳亞南等,2021)。已有研究表明,微塑料雖然不是最強的污染物,但存在其他化學物質(zhì)與微塑料結(jié)合會增加微塑料對蜜蜂的毒性,增加對蜜蜂的致死性(Grazianoetal., 2020)。本研究結(jié)果表明草甘膦與微塑料兩者協(xié)同對蜜蜂的危害要顯著超過單獨的危害,因此其他化學農(nóng)藥與微塑料對蜜蜂健康的協(xié)同效應也是今后的一個研究重點,這有助于更加科學地使用農(nóng)藥。