PBMC中PPARγ、CD68和CD163表達(dá)水平在乳腺疾病診斷中的價值

錢世寧,張 潔,朱小飛

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,江蘇南京 210029

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一,近年來其在我國的患病率呈上升趨勢,現(xiàn)已居于女性惡性腫瘤首位。目前,臨床上乳腺癌的早期診斷主要依靠B超、核磁和鉬靶等影像學(xué)手段,臨床實驗室指標(biāo)和組織穿刺等病理學(xué)手段均不能在乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷中發(fā)揮良好作用。因此,尋找和建立一種能早期預(yù)測和診斷乳腺癌的方法顯得尤為重要。過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)是Ⅱ型核激素受體超家族的成員之一,屬于配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子[1]。研究證明[2],PPARγ在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,其經(jīng)配體激活后可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡,抑制腫瘤血管侵襲,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲力。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是外周循環(huán)血液中的單核細(xì)胞在腫瘤來源的細(xì)胞因子和趨化因子作用下遷移到腫瘤微環(huán)境中增殖、分化形成的[3]。TAMs根據(jù)功能和狀態(tài)不同分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1型)和替代活化的巨噬細(xì)胞(M2型)。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)促炎因子并激活免疫細(xì)胞,殺傷吞噬微生物和腫瘤細(xì)胞,并將產(chǎn)生的毒素中間體提呈給T細(xì)胞;而M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子,如:IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等抑制機體免疫反應(yīng),促進腫瘤進展。有研究表明[4],TAMs進入腫瘤微環(huán)境后誘導(dǎo)形成M2型巨噬細(xì)胞,TAMs通過分泌和調(diào)控多種細(xì)胞因子,促進乳腺癌細(xì)胞分裂和轉(zhuǎn)移、癌血管生成以及淋巴管的生成,已逐漸成為乳腺癌研究的新靶點。CD68是巨噬細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物之一,已被廣泛用于標(biāo)志實質(zhì)性腫瘤浸潤的TAMs中,主要識別M1型巨噬細(xì)胞[5],而CD163在乳腺癌M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá),可作為M2型標(biāo)志物[6]。既往研究表明,TAMs的檢測可作為判斷乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后的重要指標(biāo)[7]。本文通過檢測CD68和CD163在乳腺疾病患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)差異性,闡明TAMs相關(guān)分子標(biāo)志在乳腺良惡性疾病診斷中的價值。孕激素受體(PR)是目前乳腺癌免疫組織化學(xué)的重要指標(biāo)之一,作為乳腺癌診斷和判斷預(yù)后的重要影響因素。本文研究PPARγ、CD68和CD163在乳腺疾病患者外周血PBMC中的表達(dá)差異,并結(jié)合三者與PR表達(dá)相關(guān)性,可以為臨床乳腺疾病的診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)臨床病例信息收集2018年1月至2020年12月于本院因乳腺疾病就診的患者及健康女性的EDTA抗凝外周血樣本共47例,均為女性,平均年齡43.2歲。其中經(jīng)病理學(xué)確診為乳腺癌者33例,未經(jīng)手術(shù)治療者13例,術(shù)后患者20例;乳腺纖維瘤患者6例,同期選取健康體檢女性33例,作為健康對照組,4組間年齡、性別等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.13)。本研究涉及的病患數(shù)據(jù)和樣本均通過南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 淋巴細(xì)胞分離液(上海新睿生物科技有限公司)、三氯甲烷、異丙醇溶液、75%乙醇、TRIzol Reagent(Invitrogen公司)、Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄PCR試劑(大連寶生物工程有限公司),SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑(大連寶生物工程有限公司),PCR引物合成由大連寶生物工程有限公司完成;高速臺式離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海煜南儀器有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(基隆)、恒溫混勻儀(杭州瑞誠儀器有限公司),ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1PBMC的分離 取新鮮EDTA抗凝外周血,吸取2 mL淋巴細(xì)胞分離液加入10 mL分離管中,混勻備用全血標(biāo)本,沿分離管管壁緩慢加入到分離液上,1 500 r/min離心30 min,吸取灰白層即單個核細(xì)胞層至1.5 mL EP管中,再于高速冷凍離心機中13 000 r/min,4 ℃離心5 min,收集細(xì)胞沉淀于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2RNA提取和qPCR檢測PPARγ、CD68、CD163的表達(dá)水平 使用Trizol試劑提取PBMC總RNA。通過qPCR方法檢測PPARγ、CD68、CD163的mRNA水平,引物序列如下。PPARγ,上游:5′-TGGAGTTCATGCTTGTGAAG-3′,下游:5′-GCA TTA TGAGACATCCCCAC-3′;CD68,上游:5′-TTCCCCTATGGACACCTCAG-3′,下游:5′-TTGTACTCCACCGCCATGTA-3′;CD163,上游:5′-AAAAAGCCACAACAGGTCGC-3′,下游:5′-CTTGAGGAAACTGCAAGCCG-3′。采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)水平。

1.3.3收集CEA和CA153檢測數(shù)據(jù) 從醫(yī)院的電子病歷系統(tǒng)中收集乳腺癌患者術(shù)前、術(shù)后及乳腺纖維瘤患者CA153檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1CEA和CA153在良惡性乳腺疾病中表達(dá)水平的比較 本文比較了CEA和CA153這兩種腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者三組之間的表達(dá)水平。CEA在乳腺癌術(shù)前組較術(shù)后組表達(dá)水平(P=0.31),在乳腺癌術(shù)后組較乳腺纖維瘤組表達(dá)水平(P=0.22),在乳腺癌術(shù)前組較乳腺纖維瘤組表達(dá)水平(P=0.74),差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;同樣,CA153在乳腺癌術(shù)前組較術(shù)后組表達(dá)水平(P=0.67),在乳腺癌術(shù)后組較乳腺纖維瘤組表達(dá)水平(P=0.58),在乳腺癌術(shù)前組較乳腺纖維瘤組表達(dá)水平(P=0.82),差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。CEA和CA153不能作為乳腺疾病鑒別診斷和預(yù)后判斷的有效指標(biāo)。

圖1 CEA和CA153在乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者中的表達(dá)。

2.2PPARγ、CD68和CD163在乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者之間的表達(dá)水平和差異 本研究檢測了PPARγ、CD68和CD163在健康對照人群,乳腺癌術(shù)前、術(shù)后患者和乳腺纖維瘤患者樣本中的表達(dá)水平,以健康對照人群的表達(dá)水平作為基準(zhǔn)。與健康對照人群相比,乳腺癌術(shù)前患者的PPARγ表達(dá)顯著降低(P<0.001),而乳腺纖維瘤患者的PPARγ表達(dá)則明顯增高(P<0.05)。不僅如此,PPARγ在乳腺癌術(shù)后患者樣本中的表達(dá)明顯增高,與乳腺癌術(shù)前患者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CD68在三組之間的表達(dá)水平和差異與PPARγ相似。除此之外,CD163在三組之間的表達(dá)也存在差異。其中,CD163在乳腺癌術(shù)前患者的表達(dá)水平最高,顯著高于健康對照組(P<0.05)、術(shù)后組(P<0.05)和乳癌纖維瘤組患者(P<0.05)。見圖2。上述結(jié)果提示,PPARγ、CD68和CD163可能是鑒別乳腺疾病良惡性和預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。

圖2 PPARγ、CD68和CD163在健康對照、乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者中的表達(dá)水平和差異情況

2.3ROC分析PPARγ、CD68和CD163對乳腺癌的診斷效率 PPARγ在乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者中的ROC曲線分析顯示,ROC曲線下面積分別為0.89、0.93和0.93,臨界值分別為0.77、1.08和0.78,靈敏度分別為88.89%、80.00%和85.71%,特異度分別為87.50%、87.50%和88.89%。CD68在乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者中的ROC分析顯示,ROC曲線下面積分別為0.79、0.83和0.90,臨界值分別0.77、1.08和1.16,靈敏度分別為77.78%、80.00%和57.14%,特異度分別為87.50%、87.50%和88.89%;CD163在乳腺癌術(shù)前、術(shù)后和乳腺纖維瘤患者中的ROC分析顯示,ROC曲線下面積分別為0.86、0.54和0.85,臨界值分別為1.08、1.08和1.28,靈敏度分別為77.78%、33.33%和85.71%,特異度分別為87.50%、87.50%和77.78%。根據(jù)ROC曲線分析的結(jié)果,PPARγ在乳腺癌和乳腺纖維瘤中均具有較高的靈敏度和特異度,診斷效能較高;而CD68對于乳腺癌和乳腺纖維瘤的診斷均具有較高的特異度,在乳腺癌中也具有較高靈敏度,但對于乳腺纖維瘤的診斷靈敏度較低;CD163在乳腺癌和乳腺纖維瘤診斷中的特異度較高,但對乳腺癌術(shù)后患者的靈敏度過低。因此,PPARγ、CD68和CD163在乳腺癌和乳腺纖維瘤的鑒別診斷和預(yù)后判斷中具有一定作用。

2.4PPARγ、CD68和CD163表達(dá)水平與乳腺癌組織中PR表達(dá)的相關(guān)性分析 乳腺癌患者PBMC中PPARγ表達(dá)水平與癌組織中PR的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.92,P<0.001);CD68表達(dá)水平與癌組織中PR的表達(dá)也呈正相關(guān)性(r=0.96,P<0.001);而CD163表達(dá)水平與癌組織中PR的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.91,P<0.001)。上述結(jié)果表明,PPARγ、CD68和CD163表達(dá)水平與乳腺癌組織中PR的表達(dá)存在著相關(guān)性,提示三者可能作為乳腺癌診斷和判斷預(yù)后的潛在指標(biāo)。見圖3。

注:左、中、右依次為PPARγ、CD68和CD163表達(dá)水平與PR的相關(guān)性分析。

3 討 論

過氧化物酶增殖物激活受體(PPARs)根據(jù)結(jié)構(gòu)特征分為三種亞型:PPARα、PPARβ、PPARγ,其中PPARγ是研究最多的亞型[2]。PPARγ經(jīng)與配體結(jié)合后激活,從而與維A酸類X受體(RXR-α)形成異源二聚體,入核與目標(biāo)基因的過氧化物酶體增殖體反應(yīng)元件(PPRE)結(jié)合,激活目的基因轉(zhuǎn)錄,引起相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[8]。有實驗研究證明[9],PPARγ激動劑羅格列酮(ROZ)可抑制乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)增殖并誘導(dǎo)其凋亡。江穎等[1]實驗證明PPARγ與TNM分期、腫瘤組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān),PPARγ在良性乳腺組織中的表達(dá)強度高于乳腺癌組織。這些發(fā)現(xiàn)與本實驗中觀察到的PPARγ在乳腺纖維瘤患者PBMC中表達(dá)水平高于乳腺癌患者的現(xiàn)象一致。另多項研究證明[1,10-12],PPARγ與PR表達(dá)呈正相關(guān),其高表達(dá)與乳腺癌患者總生存率正相關(guān),是預(yù)后良好的重要指標(biāo)。本文同樣也觀察到乳腺癌患者PBMC中PPARγ的表達(dá)水平與癌組織中PR的表達(dá)存在著正相關(guān)性,說明患者外周血PBMC中的PPARγ同樣能夠反映腫瘤本身的特性。

TAMs與腫瘤的發(fā)生和進展存在相關(guān)性。既往研究顯示[3,13-16],TAMs在乳腺癌中的浸潤程度與腫瘤分級、激素狀態(tài)有關(guān)。良性乳腺疾病中TAMs的浸潤密度明顯低于其在乳腺癌組織中的密度,提示TAMs可能具有用于乳腺癌診斷篩查的潛在價值。TAMs主要包括M1和M2兩種類型的巨噬細(xì)胞,其中M1型巨噬細(xì)胞可表達(dá)促炎因子并激活免疫細(xì)胞,具有增強免疫反應(yīng)和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能;而M2型巨噬細(xì)胞主要產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子抑制免疫反應(yīng),促進腫瘤進展。由于腫瘤血供和機體血流存在著聯(lián)通交換的病理特征,因此外周血中的PBMC可能通過腫瘤血供進入腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)化成為M2型巨噬細(xì)胞,促進腫瘤進展;而另一方面腫瘤微環(huán)境中的TAMs也可能通過血流途徑進入外周循環(huán),從而使得通過監(jiān)測外周血PBMC的極性狀態(tài)預(yù)測腫瘤發(fā)生發(fā)展成為可能。本文首次通過檢測外周血PBMC中TAMs標(biāo)志分子CD68和CD163的表達(dá)水平,同樣發(fā)現(xiàn)了CD68和CD163分子在健康人群、乳腺癌患者和良性乳腺纖維瘤患者之間的顯著差異,并通過ROC曲線分析提示兩種分子對乳腺癌和乳腺纖維瘤患者具有較高的診斷效率。值得注意的是,CD68在乳腺癌患者PBMC中的表達(dá)水平顯著低于其在正常組織和良性乳腺疾病組織中的水平,可能原因在于PBMC由單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等單個核細(xì)胞組成,乳腺癌患者外周循環(huán)池中的單核巨噬細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞招募至腫瘤微環(huán)境極化形成M2型巨噬細(xì)胞參與腫瘤進展[17-18],從而導(dǎo)致外周PBMC中CD68相對表達(dá)水平降低。

除此之外,TAMs還與腫瘤組織中ER、PR和Her2等受體表達(dá)有關(guān)[19]。盡管PR作為單獨指標(biāo)對乳腺癌診斷價值不大,與患者年齡、腫瘤體積、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及組織學(xué)類型的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義,但其與ER、p53及c-erbB-2等聯(lián)合檢測可用來指導(dǎo)臨床用藥和預(yù)后判斷[20]。本實驗結(jié)果表明外周血PBMC中CD68和CD163分別與乳腺癌組織中PR表達(dá)呈正、負(fù)相關(guān)性,因此可將CD68和CD163納入早期聯(lián)合診斷指標(biāo)之中,提高乳腺癌診斷的準(zhǔn)確性。

本文同時研究PPARγ和TAMs相關(guān)標(biāo)志在乳腺良惡性疾病中的表達(dá)及診斷價值是基于二者在乳腺疾病中作用機制的共通之處。研究表明:M2型巨噬細(xì)胞受低氧刺激分泌VEGF,誘導(dǎo)血管生成并招募更多的巨噬細(xì)胞至腫瘤微環(huán)境[4],以正反饋方式調(diào)控腫瘤微環(huán)境的血管生成,而PPARγ配體15d-PGJ2等能有效抑制腫瘤細(xì)胞VEGF及其受體表達(dá),從而抑制腫瘤血管生成[21]。在對乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化和侵襲的調(diào)控方面,TAMs可被MCF-7刺激分泌大量IL-6,經(jīng)JAK2-STAT3通路活化后,增加靶基因TGF-β1、HIF-1a轉(zhuǎn)錄,激活癌干細(xì)胞,促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[22],而配體介導(dǎo)的PPARγ激活可阻滯TAMs向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,抑制M2型“促癌”作用發(fā)揮[22-23]。種種跡象表明,PPARγ在TAMs極化過程中發(fā)揮了重要作用。因此本實驗聯(lián)合檢測TAMs分子標(biāo)志(CD68和CD163)以及PPARγ在乳腺良惡性疾病中的表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)PPARγ表達(dá)水平與TAMs極化狀態(tài)存在密切關(guān)聯(lián)。

綜上所述,本文研究了外周血PBMC中PPARγ和TAMs標(biāo)志分子(CD68和CD163)在乳腺疾病患者的差異性表達(dá),初步探討了三種分子與腫瘤組織PR表達(dá)的相關(guān)性,為臨床乳腺疾病的診斷和預(yù)后判斷提供了新方法和新思路。