干擾NETO2通過調控JAK2/STAT3信號通路抑制肺腺癌細胞增殖和轉移能力

文 禮,李春姍,李 嬌,趙寧生,姚 菲

1廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,廣西南寧 530022;2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院仙葫院區(qū)腫瘤二區(qū),廣西南寧 530022

肺癌具有高發(fā)病率和病死率,非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌常見的亞型,約占肺癌病例的85%,肺腺癌是NSCLC的主要組織學類型[1]。EGFR突變是肺腺癌中最常見的分子突變類型,隨著表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)分子靶向藥物的發(fā)展,患者的臨床治療和預后得到了極大的改善。但是大多數(shù)患者在治療12～24個月后對EGFR-TKI產生一定的耐藥性,因此肺腺癌患者的預后仍然較差[2]。同時其高病死率的主要原因是該疾病的高轉移能力[3]。因此,研究促進肺腺癌進展和轉移的關鍵蛋白質和信號通路有助于開發(fā)抗腫瘤活性的新療法。神經纖毛及唾樣蛋白2(NETO2)基因位于16號染色體上,編碼單通道跨膜蛋白,主要分布于大腦,其在神經特異性過程中發(fā)揮重要生物學功能[4]。越來越多的研究顯示NETO2在惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用,食管癌中NETO2高表達,并通過上調ERK和PI3K/AKT信號通路促進食管癌的惡性進展[5]。在胰腺癌中NETO2通過激活STAT3信號通路促進腫瘤細胞增殖和轉移[6],以及在鼻咽癌和結直腸癌中NETO2均發(fā)揮促癌作用,可作為抗腫瘤治療的潛在分子靶點[7-8]。ZHANG等[9]研究報道在肺腺癌組織中,SNHG17通過靶向miR-193a-5p/NETO2軸來發(fā)揮腫瘤促進作用,但是NETO2在肺腺癌中的表達及發(fā)揮的具體作用未知,因此本文對此進行了研究,以期獲得NETO2作為抗肺腺癌治療的分子靶點。

1 材料與方法

1.1試劑 甲醛、無水酒精及二甲苯購自山東華昱化工科技有限公司;肺腺癌組織芯片購自西安泰博斯生物科技有限公司;免疫組化檢測試劑盒購自丹麥DAKO公司;枸櫞酸鈉抗原修復液和PARP蛋白裂解試劑購自北京索萊寶試劑公司;DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Gibco試劑公司;肺腺癌細胞系A549購自美國ATCC細胞庫;NETO2 siRNA購自上海瑞博試劑有限公司;Lip2000購自美國Invitrogen公司;BCA蛋白水平檢測試劑盒購自美國Thermo公司;PVDF膜購自美國millipore試劑公司;ECL化學發(fā)光試劑盒購自北京百奧萊博公司;MTS試劑購自美國sigma公司;Transwell小室購自美國coring公司;NETO2、JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3和GAPDH一抗抗體購自英國Abcam公司。

1.2研究對象 組織芯片包括肺腺癌組織和其配對的癌旁組織標本(距離腫瘤3 cm內的非腫瘤)135例,每例組織最大徑1.5 mm,每張組織均經病理證實診斷為肺腺癌,并由公司提供完整的病理資料,包括年齡、性別、T分期、淋巴結轉移和TNM分期,以及術后5年的隨訪資料。

1.3方法

1.3.1免疫組化實驗 組織芯片于30 min內放入4%甲醛中充分固定6 h,通過乙醇脫水、石蠟浸沒,包埋成組織蠟塊。并切成4 μm的石蠟切片,放入烤箱1 h熔蠟后,將切片放入二甲苯中30 min進行脫蠟,并依次放入無水乙醇、90%乙醇、80%、75%和70%的乙醇中各5 min,以及雙蒸水中30 min進行水化,隨后放置枸櫞酸鈉抗原修復液中高溫煮沸30 min。將切片與過氧化氫孵育30 min以封閉非特異性抗原后,將切片與NETO2一抗稀釋液(稀釋比例1∶200)孵育,并4 ℃孵育過夜。二抗稀釋液(稀釋比例1∶8 000)孵育37 ℃ 30 min,采用試劑盒進行組織染色、蘇木素復染,封片并晾干后在顯微鏡下觀察染色強度及面積進行相應的評分。由兩名獨立的病理學家進行,染色強度評分標準:無著色為0分,淡黃色著色為1分,黃色著色為2分和深黃色著色為3分。染色面積:<5%為0分,5%～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分和>75%為4分。染色強度得分乘以染色百分比評分計算最終得分,高表達或者陽性表達(得分>2分)和低表達或者陰性表達(得分≤2分)。

1.3.2細胞培養(yǎng) 復蘇肺腺癌細胞系A549后,采用含有10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素、鏈霉素的雙抗生素的DMEM-F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng),并放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度為95%時,采用胰酶消化細胞,進行細胞傳代,繼續(xù)培養(yǎng),用于后續(xù)的實驗研究。

1.3.3NETO2 siRNA轉染細胞 肺腺癌細胞A549處于對數(shù)生長期,細胞狀態(tài)較好時,采用胰酶消化并計數(shù),并以2.0×105個細胞鋪至6孔板中,放置在含有5%CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h,細胞貼壁后更換無血清細胞培養(yǎng)基,并隨機分為si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組,依據(jù)Lip2000說明書進行NETO2 siRNA的轉染。si-NC組細胞轉染5 μg NC siRNA和2 μL Lip2000,si-NETO2-1組細胞轉染NETO2 siRNA-1和2 μL Lip2000,si-NETO2-2組細胞轉染5 μg NETO2 siRNA-2和2 μL Lip2000。各組細胞放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后更換含有10% 胎牛血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4Western blot檢測蛋白的表達 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細胞,PBS重懸洗滌細胞2次,獲得細胞斑塊。加入適量的PARP蛋白裂解液裂解細胞,于4℃離心機中高速離心30 min,獲得蛋白質上清液。采用BCA蛋白質檢測試劑盒測得蛋白水平。通過10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白質,并將蛋白濕轉至PVDF膜上。將膜與5%的牛血清清蛋白常溫孵育1 h,然后在4 ℃下與一抗稀釋液(NETO2、JAK2、STAT3、pJAK2、pSTAT3稀釋比例均為1∶500)孵育過夜,TBST洗3次后,與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(稀釋1∶5 000)或山羊抗兔IgG(稀釋1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗3次后,采用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

1.3.5MTS實驗 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細胞,并計數(shù)后鋪至96孔板中,每組6個重復孔,每孔2 000個細胞、150 μL DMEM-F12完全培養(yǎng)基,放置在含有5%CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后的第1、2、3、4和5天時,每孔更換100 μL新鮮培養(yǎng)基,并加入10 μL MTS試劑,放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。采用酶標儀測量各孔細胞490 nm處的吸光度值(A值)。取每組的6個重復孔的A值的平均值,誤差線表示標準偏差。

1.3.6克隆形成實驗 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細胞,并計數(shù)后鋪至6孔板中,每組3個重復孔,每孔500個細胞、2mL DMEM-F12完全培養(yǎng)基,放置在含有5% CO2的37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一天更換一次新鮮培養(yǎng)基。待形成細胞克隆團,并且肉眼可以觀察到時棄掉培養(yǎng)基。將細胞用PBS洗滌兩次,無水乙醇室溫固定30 min,0.5%結晶紫室溫染色10 min。計數(shù)細胞克隆團數(shù)目,取每組細胞的3個重復孔的平均值,誤差線表示標準偏差。

1.3.7Transwell實驗 胰酶消化收集si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組A549細胞,DMEM-F12無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次后,鋪至Transwell小室的上室膜中,每組3個重復孔,每孔1.0×105個細胞、100 μL DMEM-F12無血清培養(yǎng)基,500 μL DMEM-F12完全培養(yǎng)基加入Transwell小室的下室中,放置在含有5% CO2的37 ℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后,棉簽擦掉Transwell上室膜上面殘留的細胞,膜的下室面穿過的細胞采用PBS洗3次后,無水乙醇室溫固定30 min,0.5%結晶紫室溫染色10 min。PBS洗3次后,取下膜后顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)目,取每組的3個重復孔的平均值,誤差線表示標準偏差。

2 結 果

2.1NETO2在肺腺癌組織中的表達 免疫組化結果顯示NETO2在肺腺癌組織中的陽性表達率為45.93%(62/135),在癌旁組織中的陽性表達率為33.33%(45/135),NETO2在肺腺癌組織中的表達高于在癌旁組織中的表達(χ2=4.474,P=0.034),圖1為NETO2在肺腺癌組織中陽性和陰性表達的代表性圖片。

注:A為NETO2在肺腺癌組織中的陽性表達;B為NETO2在癌旁組織中的陰性表達(×200)。

2.2NETO2表達與肺腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系χ2檢驗分析顯示NETO2在不同年齡和性別患者中的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05),NETO2在腫瘤T分期較高、有淋巴結轉移和TNM分期較高的肺腺癌患者腫瘤組織中的表達分別高于在腫瘤T分期較低、無淋巴結轉移和TNM分期較低腫瘤組織中的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 NETO2在肺腺癌組織中的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關系[n(%)]

2.3NETO2表達與肺腺癌患者預后的關系 Log-rank檢驗分析顯示與低表達NETO2的肺腺癌患者相比,高表達NETO2的肺腺癌患者預后較差(χ2=4.507,P=0.034),見圖2。

圖2 Log-rank檢驗分析NETO2表達對肺腺癌患者預后的影響

2.4NETO2 siRNA對肺腺癌細胞中NETO2表達的影響 NETO2 siRNA轉染肺腺癌細胞系A549,Western blot檢測結果顯示NETO2在si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞中的表達分別為1.02±0.06和0.14±0.02、0.17±0.03。與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞中NETO2蛋白的表達顯著降低(F=449.30,P<0.001),見圖3。

注:*P<0.05。

2.5NETO2 siRNA對肺腺癌細胞增殖活性的影響 MTS實驗檢測結果顯示與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞增殖活性顯著降低(P<0.05),見圖4、表2。

表2 si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組肺腺癌細胞A490值

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.6NETO2 siRNA對肺腺癌細胞克隆形成能力的影響 平板克隆形成實驗檢測結果顯示si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞的克隆形成數(shù)目分別為(125.33±9.54)個和(56.33±3.61)個、(69.67±3.51)個。與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞克隆形成能力顯著降低(F=103.30,P<0.001),見圖5。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.7NETO2 siRNA對肺腺癌細胞轉移能力的影響 Transwell實驗檢測結果顯示si-NC組和si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞穿膜數(shù)目分別為(76.33±3.61)個和(26.33±2.07)個、(27.67±3.79)個。與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞轉移能力顯著降低(F=231.60,P<0.001),見圖6。

注:與si-NC組比較,*P<0.05。

2.8NETO2對肺腺癌細胞中JAK2/STAT3信號通路的影響 Western blot檢測結果顯示與si-NC組相比,si-NETO2-1、si-NETO2-2組細胞JAK2/STAT3信號通路關鍵蛋白pJAK2和pSTAT3表達降低(P<0.05),JAK2和STAT3蛋白表達無明顯變化(P>0.05),見圖7。

注:*P<0.05。

3 討 論

2020年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明肺癌是全球癌癥相關死亡的最常見原因,嚴重威脅患者生命健康[1]。目前肺腺癌的治療包括手術、放療、化療和分子靶向治療,隨著醫(yī)療技術的發(fā)展,尤其是分子靶向藥物的應用,肺腺癌患者的預后有所改善,但是患者生存率仍然不理想[2]。因此,需要發(fā)現(xiàn)并探索肺腺癌發(fā)生發(fā)展的特定分子機制,以發(fā)現(xiàn)新型的生物標志物,并可用于干預、預防和治療至關重要的新分子靶標。NETO2是幼體結構域和含LDLA蛋白的亞家族的成員,被鑒定為神經元海藻受體(KARS)的輔助蛋白,并在調節(jié)KARS功能中發(fā)揮關鍵作用,及NETO2與K+-Cl-共轉運蛋白(KCC2)以低聚形式結合,以增強其在海馬神經元中的回收利用[10]。近年來研究顯示NETO2不僅在神經系統(tǒng)中發(fā)揮功能,其在多種腫瘤組織中表達異常,并參與腫瘤的惡性進展,可作為抗腫瘤活性的藥物分子靶點[5-9]。

NETO2在食管癌、胰腺癌和腎透明細胞癌等腫瘤中報道為促癌基因,促進腫瘤的惡性進展[5-6,11],但是FEDOROVA等[12]報道NETO2在乳腺癌和前列腺癌中表達下降,并下調Wnt、TGF-β、JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT等一些細胞信號途徑。提示NETO2具有促癌和抑癌雙重作用,在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。在肺腺癌中NETO2作為miR-193a-5p的靶基因,參與SNHG17促進肺腺癌細胞增殖、侵襲、轉移和EMT過程[9]。那么NETO2在肺腺癌中是否具有重要的生物功能,并發(fā)揮關鍵作用。在本研究首先采用免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比,肺腺癌組織中NETO2的蛋白表達水平上調,并且統(tǒng)計分析顯示NETO2與肺腺癌患者T分期、淋巴結轉移和TNM分期均相關。且高表達NETO2的肺腺癌患者預后較差,表明 NETO2促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展,是肺腺癌患者預后不良的分子標志物。與NETO2在食管癌[5]中表達升高,并與患者臨床病理分期、淋巴結轉移相關及在胰腺癌[6]中NETO2表達增加,并與患者腫瘤分期、預后較差的臨床意義一致。惡性增殖和轉移是腫瘤進展的重要表型,且在ZHANG等[9]的研究中提示NETO2 與肺腺癌的增殖和轉移相關,本研究干擾NETO2的表達后功能實驗顯示肺腺癌細胞的增殖和轉移能力降低。表明NETO2在肺腺癌中高表達,并促進腫瘤細胞的增殖和轉移惡性生物學行為。

NETO2促進肺腺癌惡性進展的作用機制仍需進一步探討。研究顯示NETO2通過調控腫瘤相關信號途徑在各個腫瘤中發(fā)揮作用,在食管癌中NETO2通過上調PI3K/AKT和 ERK信號通路促進腫瘤細胞增殖和轉移能力[5]。NETO2通過調控PI3K/AKT/NF-κB/Snail信號通路促進胃癌侵襲和轉移能力[13]。但是研究報道NETO2在乳腺癌和前列腺癌中可以下調PI3K/ AKT信號通路,這表明在不同的腫瘤中NETO2發(fā)揮的作用機制可以完全相反[10]。JAK2/STAT3信號通路是調控腫瘤惡性生物學行為的重要途徑之一,在肺腺癌中處于激活狀態(tài),促進肺腺癌的增殖和轉移能力,并抑制細胞凋亡,抑制其活性,可以抑制腫瘤的惡性進展[14]。JAK2/STAT3信號通路激活的關鍵是JAK2及STAT3蛋白的磷酸化水平增加,并促進下游靶蛋白的激活,發(fā)揮相應的生物學功能[15]。本文發(fā)現(xiàn)干擾NETO2的表達后,肺腺癌細胞中pJAK2和pSTAT3蛋白的表達降低,表明NETO2通過上調JAK2/STAT3信號通路促進肺腺癌增殖和轉移能力。與NETO2在胰腺癌中增加pSTAT3蛋白的表達促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移能力的研究具有一致性。但是本文的局限在于未對NETO2直接作用的分子機制進行深入研究,在后續(xù)的研究中后續(xù)仍需進一步探索。

綜上所述,NETO2在肺腺癌組織中高表達,與肺腺癌患者不良病理參數(shù)和預后相關。并且NETO2 促進肺腺癌細胞增殖和轉移能力,其作用機制可能是通過激活JAK2/STAT3信號通路。NETO2是抗肺腺癌治療的潛在分子靶點。