化學(xué)發(fā)光免疫分析法與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)外周血γ-干擾素診斷結(jié)核分枝桿菌感染的結(jié)果分析*

吳重陽,王遠(yuǎn)芳,王中浩,李冬冬

四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的一種慢性感染性疾病。MTB感染人體后有10%的感染者成為活動(dòng)性結(jié)核患者,而大部分感染者為MTB潛伏性感染,并可能發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核[1]。為及時(shí)發(fā)現(xiàn)感染者并提供預(yù)防性用藥,需要提升對(duì)MTB的檢測(cè)能力。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)主要包括抗酸染色、MTB培養(yǎng)和MTB核酸檢測(cè)等。結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為檢出病原體,但往往存在鏡檢陽性率低以及培養(yǎng)耗時(shí)等缺點(diǎn)[2]。近年來,γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)(IGRA)作為一種MTB感染輔助性診斷試驗(yàn),具有不受卡介苗和非MTB病原體影響的優(yōu)點(diǎn),在臨床應(yīng)用越來越廣泛,我國已將IGRA作為肺結(jié)核的輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[3]。目前,QuantiFERON-TB Gold Plus(QFT-Plus)檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于體外結(jié)核病和潛伏性MTB感染的診斷[4],世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的最新版MTB感染診斷檢測(cè)操作手冊(cè)指出萬泰生物公司提供的MTB-IGRA檢測(cè)性能可與QFT-Gold Plus及結(jié)核T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T-SPOT.TB)相當(dāng),推薦用于MTB感染的檢測(cè),是唯一被推薦的國產(chǎn)IGRA診斷產(chǎn)品[5]。本實(shí)驗(yàn)室在引進(jìn)萬泰全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)Wan200+后,分析了2022年6-7月基于化學(xué)發(fā)光免疫分析法 (CLIA)檢測(cè)的結(jié)果,陽性率為41.02%,與2021年同期基于萬泰生物酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)的結(jié)果相比增加10.45%,同時(shí)發(fā)現(xiàn)CLIA的T-N值在14～50 pg/mL這一范圍內(nèi)的標(biāo)本數(shù)量明顯增加(T為測(cè)試培養(yǎng)管,N為本底對(duì)照培養(yǎng)管)。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道,在進(jìn)行IGRA時(shí),CLIA能檢測(cè)到比ELISA更高的定量值,若要將ELISA檢測(cè)結(jié)果為臨界值陰性的樣品判定為陽性,需要根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)定義CLIA 的臨界值[6]。本研究對(duì)兩種方法的差異性結(jié)果進(jìn)行了綜合分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)結(jié)果,將經(jīng)CLIA檢測(cè)的IGRA為以下結(jié)果的標(biāo)本納入研究。(1)T-N>14 pg/mL;(2)N>50 pg/mL;(3)不確定結(jié)果的標(biāo)本。根據(jù)CLIA檢測(cè)結(jié)果將標(biāo)本分為3組,A組(T-N<14 pg/mL)118例,B組(T-N:14～50 pg/mL)138例,C組(T-N>50 pg/mL)43例。標(biāo)本來源的患者男性148例,女性151例,年齡11～90歲,平均年齡為47.7歲。結(jié)合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[3],通過綜合分析患者的臨床癥狀及體征、影像學(xué)、病理學(xué)檢查結(jié)果、抗結(jié)核治療及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)等最終將患者分為3組。潛伏性MTB感染組(73例):具有MTB感染的病原學(xué)診斷依據(jù);確診結(jié)核組(29例):具有結(jié)核病臨床表現(xiàn)并且有影像學(xué)表現(xiàn);易與結(jié)核混淆的非結(jié)核組(197例):主要為已診斷為非結(jié)核病、肺癌、各類肺炎等疾病并排除MTB感染。本研究中采用的標(biāo)本均為臨床檢驗(yàn)測(cè)試后的剩余標(biāo)本,本研究經(jīng)過四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)2022年審(482)號(hào)]。

1.2儀器與試劑 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀(愛康,URANUS AE85型)、萬泰全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(Wan200+型)、恒溫孵育箱、北京萬泰生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核桿菌相關(guān)IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒和結(jié)核相關(guān)IFN-γ磁微粒CLIA檢測(cè)試劑盒。

1.3方法 首先將采集的新鮮全血4 mL置入肝素管保存,在2 h內(nèi)將全血標(biāo)本輕柔顛倒混勻3～5次后按N、T、陽性對(duì)照培養(yǎng)管(P)的順序分別加入到結(jié)核相關(guān)IFN-γ磁微粒CLIA檢測(cè)試劑盒的培養(yǎng)管中,N含有陰性對(duì)照培養(yǎng)液,T含有測(cè)試培養(yǎng)液,P含有陽性對(duì)照培養(yǎng)液,1 mL/孔,置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)20～24 h,孵育結(jié)束后以5 000 r/min離心10 min收集上清液,采用CLIA定量檢測(cè)上清液中IFN-γ的水平。因ELISA和CLIA兩種試劑盒N、T、P可以互相通用,將經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑盒內(nèi)結(jié)核特異性抗原刺激后的血漿立即在-20 ℃下冷凍,以確保IFN-γ穩(wěn)定性,將符合篩選標(biāo)本的標(biāo)本采用ELISA進(jìn)行復(fù)測(cè)。在進(jìn)行ELISA檢測(cè)之前將標(biāo)本以5 000 r/min離心10 min,以去除標(biāo)本儲(chǔ)存期間形成的纖維蛋白凝塊。兩種檢測(cè)方法的操作步驟及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照說明書進(jìn)行。根據(jù)說明書,兩種檢測(cè)方法中的不確定結(jié)果定義為(1)P-N<20 pg/mL,T-N<14 pg/mL;(2)P-N<20 pg/mL,T-N≥14 pg/mL但檢測(cè)上限(CLIA檢測(cè)上限為5 000 pg/mL,ELISA檢測(cè)上限為400 pg/mL)。不確定結(jié)果表示IGRA不能確定是否感染MTB。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件,兩種檢測(cè)方法的試驗(yàn)結(jié)果的差異比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)結(jié)果的一致性分析采用Kappa檢驗(yàn),當(dāng)Kappa值≥0.75時(shí)代表兩者一致性較好,Kappa值為0.40～<0.75時(shí)兩者一致性一般,Kappa值<0.40時(shí)一致性較差。繪制受試者工作特征(ROC)曲線,計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)。

2 結(jié) 果

2.1CLIA與ELISA進(jìn)行IGRA結(jié)果分析 共納入了299例經(jīng)CLIA分析的標(biāo)本,陽性169例(56.52%),陰性129例(43.14%),不確定1例(0.34%);相同的標(biāo)本經(jīng)由ELISA檢測(cè)結(jié)果如下:陽性69例(23.08%),陰性228例(76.25%),不確定2例(0.67%);由表1可知,對(duì)于A組和C組標(biāo)本,兩種檢測(cè)方法的陰性和陽性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果一致性較高,兩組標(biāo)本CLIA和ELISA檢測(cè)結(jié)果符合率分別為96.61%和93.02%。主要差異在于B組標(biāo)本,CLIA檢測(cè)結(jié)果為126例陽性,12例陰性,而ELISA檢測(cè)結(jié)果為27例陽性,111陰性;兩種檢測(cè)方法測(cè)得的B組標(biāo)本IGRA陽性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=142.04,P<0.001)。

表1 3組標(biāo)本經(jīng)CLIA與ELISA進(jìn)行IGRA結(jié)果分析(n)

2.2兩種方法不一致結(jié)果分析 從表1和圖1可以看到CLIA與ELISA檢測(cè)結(jié)果不一致的結(jié)果主要是CLIA判定為陽性的標(biāo)本而ELISA檢測(cè)結(jié)果為陰性及不確定。對(duì)107例CLIA檢測(cè)結(jié)果為陽性的患者進(jìn)行臨床資料回顧分析,發(fā)現(xiàn)有69例臨床排除MTB感染,有38例CLIA檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷一致,包括8例確診結(jié)核和30例潛伏性MTB感染;對(duì)這69例的CLIA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IFN-γ水平集中分布于12～24 pg/mL這一范圍內(nèi)。進(jìn)一步分析經(jīng)臨床確診為MTB感染患者的3例標(biāo)本,分析發(fā)現(xiàn)CLIA的N檢測(cè)值均大于100 pg/mL,盡管T-N均大于14 pg/mL,但T-N均小于N/4值,根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)將3例標(biāo)本判定為陰性結(jié)果,導(dǎo)致結(jié)果不相符。

圖1 兩種檢測(cè)方法的T-N不同區(qū)間的頻數(shù)分布

2.3頻數(shù)分布比較 頻數(shù)分布圖顯示兩種檢測(cè)方法的IFN-γ水平(T-N)存在差異,CLIA檢測(cè)得到的IFN-γ水平(T-N)較ELISA顯著升高(P<0.05)。CLIA檢測(cè)結(jié)果分布主要集中在兩個(gè)范圍,主要是0～2 pg/mL和12～40 pg/mL的范圍內(nèi),分別為63例和161例;而ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示主要集中在0～16范圍內(nèi),為240例。對(duì)T-N<14 pg/mL的標(biāo)本結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)CLIA為118例,ELISA為224例;對(duì)T-N:>14～40 pg/mL的標(biāo)本結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)CLIA為138例,ELISA為43例。見圖1。

2.4兩種檢測(cè)方法在不同分組中的陽性率比較 對(duì)CLIA-IGRA檢測(cè)為臨界值及不確定結(jié)果的標(biāo)本進(jìn)行分析,ELISA檢測(cè)確診結(jié)核組、潛伏性MTB感染組、非結(jié)核組的陽性率分別為44.83%、32.88%、14.21%。與ELISA相比,CLIA檢測(cè)確診結(jié)核組、潛伏性MTB感染組、非結(jié)核組的陽性率分別為68.97%、72.60%、49.23%。在確診結(jié)核組中,兩種檢測(cè)方法的陽性率分別為68.9%和44.83%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)。在潛伏性MTB感染組中,兩種檢測(cè)方法的陽性率分別為72.60%和32.88%;在非結(jié)核組中,兩種檢測(cè)方法的陽性率分別為49.23%和14.21%;與ELISA相比,CLIA檢測(cè)結(jié)果顯示兩組標(biāo)本的陽性率明顯增加,兩種方法檢測(cè)潛伏性MTB感染組及非結(jié)核組的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同組別的檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.5兩種檢測(cè)方法的方法學(xué)比較 在不同的臨界值條件下,本研究分析了兩種檢測(cè)方法的靈敏度和特異度,見表3。當(dāng)以14 pg/mL為臨界值時(shí),CLIA檢測(cè)的靈敏度最高,為71.57%,而ELISA檢測(cè)靈敏度僅為37.25%。當(dāng)臨界值為30 pg/mL和40 pg/mL時(shí),兩種檢測(cè)方法的靈敏度均低于30%。當(dāng)以14 pg/mL為臨界值時(shí),CLIA檢測(cè)非結(jié)核患者標(biāo)本的特異度為51.27%,ELISA檢測(cè)特異度為78.68%;當(dāng)以40 pg/mL為臨界值時(shí),兩種檢測(cè)方法的特異度均較高,分別為88.80%和91.37%。

表3 兩種方法檢測(cè)299例標(biāo)本在不同臨界值下判定結(jié)果的靈敏度和特異度

2.6兩種檢測(cè)方法在采用不同臨界值時(shí)的結(jié)果符合性 本研究299例標(biāo)本,以14 pg/mL為臨界值,CLIA進(jìn)行IGRA檢測(cè)結(jié)果陽性為181例,陰性為118例;ELISA進(jìn)行IGRA檢測(cè)結(jié)果陽性為74例,陰性為225例?？偡下蕿?0.80%。當(dāng)臨界值為20、30、40 pg/mL時(shí),兩種檢測(cè)方法的總符合率分別為73.90%、90.60%、94.60%。對(duì)這兩種結(jié)核診斷試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)劣進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)Kappa值隨著臨界值的增加而增加,當(dāng)以40 pg/mL為臨界值時(shí),Kappa值為0.779。

3 討 論

IGRA 作為世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的用于診斷MTB 感染的體外免疫學(xué)方法[5],2022年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)針對(duì)IGRA檢測(cè)及臨床應(yīng)用進(jìn)行闡述并提出專家意見[7],本研究基于IGRA檢測(cè)及臨床應(yīng)用專家意見及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行討論分析。

實(shí)驗(yàn)室結(jié)果表明,CLIA-IGRA檢測(cè)結(jié)果具有較寬的線性范圍(1～5 000 pg/ mL),同時(shí)CLIA檢測(cè)結(jié)果顯示IFN-γ(T-N)平均值顯著高于ELISA,這與BISOGNIN等[8]報(bào)道Liaison XL 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀上獲得的IGRA檢測(cè)結(jié)果一致。在線性范圍內(nèi)CLIA檢測(cè)到比ELISA更高的IFN-γ值。對(duì)于灰區(qū)和臨界值結(jié)果的標(biāo)本而言,CLIA診斷MTB感染的靈敏度可達(dá)到68%以上,而根據(jù)ROC曲線分析,可將臨界值設(shè)定為30 pg/mL甚至是40 pg/mL,將非MTB感染人群盡可能排除[8]。因此在易與MTB感染混淆的人群中IGRA檢測(cè)結(jié)果陰性的排除診斷價(jià)值明顯超過檢測(cè)結(jié)果為陽性的診斷價(jià)值,但同時(shí)需要根據(jù)患者的影像學(xué)、病理學(xué)以及臨床癥狀等進(jìn)行綜合判斷分析。本研究結(jié)果顯示,有69例標(biāo)本因CLIA檢測(cè)IFN-γ水平主要集中在12～24 pg/mL 判定為陽性,而ELISA和臨床診斷顯示為陰性,CLIA可檢測(cè)到具有非常低水平的IFN-γ的標(biāo)本,但同時(shí)也會(huì)增加假陽性結(jié)果標(biāo)本例數(shù)[9]。正如張倩云等[10]報(bào)道基于磁性微粒的CLIA與傳統(tǒng)方法相比,CLIA具有更低的檢測(cè)限。對(duì)于不確定結(jié)果的標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)仍有9%的標(biāo)本再次出現(xiàn)不確定結(jié)果,可能會(huì)影響患者接受潛伏性MTB感染治療[9,11]。

同時(shí)本研究評(píng)估了T-N的IFN-γ水平分布差異,頻數(shù)分布圖顯示兩種檢測(cè)方法的IFN-γ水平分布存在顯著差異,這也是造成經(jīng)CLIA檢測(cè)的IGRA陽性率增加的重要原因。利用ROC曲線分析兩種方法檢測(cè)IFN-γ對(duì)MTB感染診斷性能,盡管兩者AUC可達(dá)到0.650以上,但約登指數(shù)較低,該分析結(jié)果與國內(nèi)外研究有較大差異[6,12],推測(cè)與標(biāo)本篩選入組的方式有密切關(guān)系。有30例患者診斷為亞臨床結(jié)核病,他們的IGRA經(jīng)CLIA檢測(cè)為陽性,但沒有臨床癥狀,培養(yǎng)陽性但細(xì)菌涂片通常為陰性,影像學(xué)檢查提示出現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)陰影[13],這一結(jié)果可能表明對(duì)于某些亞臨床結(jié)核病患者,CLIA在檢測(cè)IFN-γ和識(shí)別MTB感染方面具有更高的靈敏度。因此,僅通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不能認(rèn)定CLIA-IGRA 陽性結(jié)果不正確,需要綜合考慮患者的其他實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)特征[6,14]。

將CLIA-IGRA 的分析性能與廣泛使用的ELISA-IGRA的分析性能進(jìn)行了比較,CLIA檢測(cè)儀器是全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀,顯著減少了實(shí)驗(yàn)室工作量。此外,由于分析儀基于連續(xù)負(fù)載系統(tǒng)可不分批檢測(cè)標(biāo)本,因此可以有效地在日常工作中實(shí)施,而無需考慮臨床實(shí)驗(yàn)室ELISA分析中微孔板條的數(shù)量限制。此外,CLIA檢測(cè)時(shí)間為30 min,與基于ELISA的操作流程相比,這款CLIA分析儀可快速地提供檢測(cè)結(jié)果,這對(duì)于結(jié)核病患者的臨床管理至關(guān)重要[14]。另一方面,基于磁微粒的CLIA檢測(cè)方法還有一些需要改進(jìn)之處,有報(bào)道發(fā)現(xiàn)N檢測(cè)出現(xiàn)高水平IFN-γ時(shí)可導(dǎo)致IGRA結(jié)果出現(xiàn)不確定,可能存在一些非特異性的分析前干擾,包括循環(huán)IFN-γ水平過高以及存在嗜異性抗體,需要進(jìn)一步評(píng)估N為高水平IFN-γ的患者的免疫功能狀態(tài)、實(shí)驗(yàn)室其他檢測(cè)指標(biāo)水平等[15]。

最后,本研究有一定局限性,血液標(biāo)本的納入量較少,而且研究的主要目的是分析CLIA陽性率增加的原因,因此主要收集了CLIA檢測(cè)結(jié)果為>0～50 pg/mL的標(biāo)本,可能存在一定的偏倚。為了評(píng)估CLIA-IGRA在結(jié)核診斷中的價(jià)值,還需要增加樣本量,并在更廣泛的人群中進(jìn)行研究。