miR-21水平與ICU膿毒癥患者T淋巴細胞亞群指標的關系及在多重耐藥菌感染防治中的價值*

劉 斌,鄭 軍,西任古麗·孜能

新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科,新疆烏魯木齊 830000

膿毒癥是一種嚴重感染性疾病,可引發(fā)多器官功能障礙,是導致重癥監(jiān)護病房(ICU)患者病死的首要因素之一[1]。ICU膿毒癥患者因多臟器功能損害、免疫抑制,接受侵襲性操作,成為多重耐藥菌(MDRO)感染的高發(fā)人群[2]。而MDRO感染不僅會增加抗感染治療難度,加重患者經(jīng)濟負擔,同時會增加死亡風險,嚴重影響患者預后。微小RNA(miRNA)-21(miR-21)是miRNAs的重要亞型之一,在激活機體炎癥反應、調節(jié)免疫系統(tǒng)方面具有重要作用[3]。一項關于肺炎支原體肺炎患兒的研究顯示,血清miR-21水平升高與患兒T淋巴細胞亞群百分比降低、炎癥因子水平升高有一定關系,通過監(jiān)測其水平變化有助于評估患兒免疫狀態(tài)和炎癥反應情況[4]。周巧等[5]研究發(fā)現(xiàn),血清miR-21水平在膿毒癥患者中明顯升高,其在膿毒癥病程中的動態(tài)變化可能與機體炎癥反應密切相關,可作為反映膿毒癥嚴重程度及預后評估的重要指標。但在ICU膿毒癥患者中,miR-21水平與T淋巴細胞亞群百分比及MDRO感染風險間的具體關系如何尚缺乏循證依據(jù)。基于此,本研究以ICU膿毒癥患者為研究對象,檢測其血清miR-21水平及T淋巴細胞亞群指標,旨在為患者MDRO感染防控提供參考,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年1月至2022年5月本院重癥監(jiān)護病房(ICU)收治的膿毒癥患者125例納入研究。納入標準:(1)符合膿毒癥診斷標準[6],體溫<36 ℃或>38 ℃,心率>90次/分鐘,呼吸>20次/分鐘,白細胞計數(shù)<4×109/L或>12×109/L,二氧化碳分壓<32 mmHg,滿足以上任意兩條為一般膿毒癥,經(jīng)充分液體復蘇后低血壓、低組織灌注情況仍未糾正為膿毒癥休克;(2)年齡>18歲;(3)住院時間≥5 d,入住ICU≥48 h。排除標準:(1)有嚴重肝腎功能障礙;(2)急性缺血性腦卒中;(3)急性冠脈綜合征;(4)有惡性腫瘤;(5)有免疫系統(tǒng)疾病;(6)入組前1個月內使用過免疫抑制劑;(7)入住ICU時已有MDRO感染;(8)入住ICU 48 h內病死;(9)自愿出院。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審批通過(批號:KY201912-35)?；颊呋蛑毕涤H屬對本研究知情同意,并自愿簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1miR-21檢測 入住ICU當天采集外周靜脈血3 mL,離心10 min,離心半徑為8 cm,轉速設置為3 000 r/min,取上清液,存儲于-80 ℃冰箱中待檢。參照上?？撇┤鹕锟萍加邢薰咎峁┑膍iR-21試劑盒說明書提取總RNA,稀釋后進行逆轉錄反應,逆轉錄后獲取cDNA進行稀釋,采用實時熒光定量PCR(qPCR)[購自儀樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司,型號:Lepgen-96]檢測miR-21水平。miR-21上游引物序列為5′-CGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′;下游引物序列為5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′。以U6為內參,上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系:cDNA 1 μL,DEPC水3 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,SYBR染料5 μL。PCR擴增條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán),以2-ΔΔCt法計算miR-21相對表達水平。

1.2.2T淋巴細胞亞群指標的檢測 入住ICU當天采集外周靜脈血3 mL,采用賽默飛世爾公司Attune NxT型流式細胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比,計算CD4+/CD8+比值。CD3、CD4、CD8抗體均由上?；钌锟萍加邢薰咎峁?/p>

1.2.3MDRO檢測 對臨床使用的3類及以上抗菌藥物同時耐藥的細菌,包括耐碳青霉烯類抗菌藥物鮑曼不動桿菌、耐碳青霉烯類抗菌藥物腸桿菌、產(chǎn)超廣譜-β內酰胺酶細菌、耐萬古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重耐藥/泛耐藥銅綠假單胞菌等進行檢測[7]。MDRO的檢測試劑由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3觀察指標 (1)比較一般膿毒癥、膿毒癥休克患者血清miR-21水平及T淋巴細胞亞群指標(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比和CD4+/CD8+比值)。(2)分析ICU膿毒癥患者血清miR-21水平與T淋巴細胞亞群指標的相關性。(3)分析MDRO感染的影響因素。(4)構建風險模型。

2 結 果

2.1一般膿毒癥、膿毒癥休克患者血清miR-21水平及T淋巴細胞亞群指標比較 125例患者miR-21水平及CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值分別為(1.81±0.39)mg/L、(49.90±5.48)%、(36.58±4.42)%、(38.77±4.16)%、0.96±0.30。膿毒癥休克患者miR-21水平、CD8+T淋巴細胞百分比高于一般膿毒癥患者,CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值低于一般膿毒癥患者(P<0.05)。見表1。

表1 一般膿毒癥、膿毒癥休克患者miR-21水平及T淋巴細胞亞群指標比較

2.2膿毒癥患者miR-21水平與T淋巴細胞亞群治療的相關性 ICU膿毒癥患者miR-21水平與CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值均呈負相關(r=-0.842、-0.788、-0.825,P<0.001),與CD8+T淋巴細胞百分比呈正相關(r=0.818,P<0.001)。見圖1～4。

2.3MDRO感染單因素分析 125例ICU膿毒癥患者出現(xiàn)MDRO感染37例,發(fā)生率為29.60%(37/125)。性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、手術、連續(xù)性腎臟替代治療、降鈣素原、使用抗菌藥物種類與MDRO感染無關(P>0.05)。合并慢性阻塞性肺疾病、機械通氣、急性生理學與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分、住ICU時間、使用糖皮質激素、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時間、miR-21水平、CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值與MDRO感染有關(P<0.05)。見表2。

圖2 miR-21水平與CD4+T淋巴細胞百分比的相關性

圖3 miR-21水平與CD8+T淋巴細胞百分比的相關性

圖4 miR-21水平與CD4+/CD8+比值的相關性

2.4MDRO感染的多因素Logistic回歸分析 將合并慢性阻塞性肺疾病、機械通氣、APACHEⅡ評分、住ICU時間、使用糖皮質激素、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時間、miR-21水平、CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值進行多重共線性檢驗,發(fā)現(xiàn)miR-21與CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值存在多重共線性,手動移除CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD8+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值。以是否發(fā)生MDRO感染作為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),以合并慢性阻塞性肺疾病、機械通氣、APACHEⅡ評分、住ICU時間、使用糖皮質激素、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時間、miR-21作為自變量,納入二分類Logistic回歸模型,采用向前LR法篩選變量,結果顯示,校正機械通氣、住ICU時間、使用糖皮質激素后,合并慢性阻塞性肺疾病、APACHEⅡ評分、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時間、miR-21仍為ICU膿毒癥患者發(fā)生MDRO感染的獨立影響因素(P<0.05)。建立Logistic回歸模型:Logit(P)=-8.672+0.810×合并慢性阻塞性肺疾病+0.964×APACHEⅡ評分+0.829×抗菌藥物使用頻率+0.885×抗菌藥物持續(xù)使用時間+1.195×miR-21。模型符合程度采用Hosmer-Lemeshow檢驗,P=0.401,擬合度較好。見表3。

表3 MDRO感染的多因素Logistic回歸分析

2.5風險模型構建 根據(jù)Logistic回歸模型中相關系數(shù)β確定各獨立危險因素對應分值,依據(jù)β×2(四舍五入)賦分值,構建ICU膿毒癥患者MDRO感染的風險模型,見表4。根據(jù)風險模型賦分情況計算患者MDRO感染風險得分,計算各分值對應感染率,其中>8分為高風險,4～8分為中風險,<4分為低風險,分值越高,感染率越高(P<0.05),見表5。

表5 ICU膿毒癥患者MDRO感染風險分層

3 討 論

近年來隨著抗菌藥物的廣泛使用,細菌耐藥問題逐漸凸顯。目前關于ICU患者MDRO感染風險已逐漸得到重視,已有多項關于ICU患者MDRO感染危險因素的報道[8-10],但針對ICU膿毒癥患者MDRO感染防治的報道較少。本研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),125例ICU膿毒癥患者MDRO感染發(fā)生率為29.60%,略低于陳利紅等[11]報道的32.9%,但仍處于較高水平。如何從生理、病理機制方面控制MDRO感染風險已成為臨床研究的重要方向之一。

膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展并不依賴于機體細菌和毒素的持續(xù)存在,而與機體過度炎癥反應、免疫紊亂等有關。隨著膿毒癥病情進展,機體特征性補體系統(tǒng)激活,先天性免疫系統(tǒng)過度活化,炎性介質過度釋放,刺激機體釋放氧自由基,致使機體調控機制失調,炎癥反應進一步加劇,造成器官功能損害,誘發(fā)膿毒癥休克,甚至導致患者死亡[12-13]。miR-21主要位于17q 23.2染色體FRA17脆性區(qū)域上,擁有自己的啟動子區(qū)域,可在血清中穩(wěn)定存在,不僅具有調控炎癥因子表達的作用,還可作用于炎癥信號傳導通絡的其他關鍵分子[14]。楊霞虹等[15]指出,miR-21的表達與嗜酸性粒細胞性食管炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、炎癥性腸病等多種炎性疾病的發(fā)生、進展有關,有望作為炎性疾病治療的新靶點。T淋巴細胞是機體細胞免疫的效應細胞,正常情況下其數(shù)量保持動態(tài)平衡,但隨著病原菌的侵襲,會出現(xiàn)異常表達。本研究中膿毒癥休克患者miR-21水平、CD8+T淋巴細胞百分比高于一般膿毒癥患者,CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值低于一般膿毒癥患者,與關炳星等[16]、李偉超等[17]研究結果相符,表明ICU膿毒癥患者同時存在機體炎癥及細胞免疫功能紊亂,且可能參與病情進展。進一步進行相關性分析發(fā)現(xiàn)ICU膿毒癥患者miR-21水平與CD3+T淋巴細胞百分比、CD4+T淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值呈負相關,與CD8+T淋巴細胞百分比呈正相關。miR-21高表達導致機體全身性炎癥反應爆發(fā),刺激單核細胞、巨噬細胞等炎癥細胞釋放過量的腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-8、白細胞介素-6等,誘發(fā)機體防御性炎癥反應過度,加劇病情進展,同時可通過影響MAPK、MyD88通路致使機體免疫功能紊亂,T淋巴細胞亞群失衡[18-19]。

安陽等[20]在一項老年肺炎患者中的研究發(fā)現(xiàn),MDRO感染患者細胞免疫受到明顯抑制,干擾素-γ分泌受限,無法正常吞噬、殺傷病原體,致使炎癥反應加重,出現(xiàn)組織損害。本研究結果顯示,miR-21高表達會增加ICU膿毒癥患者MDRO感染風險,可能是因為miR-21表達上調不僅會加劇機體炎癥反應,還會導致細胞免疫功能降低,致使機體對病原菌的免疫力大幅度下降,從而導致MDRO感染率升高。進一步建立Logistic回歸模型:Logit(P)=-8.672+0.810×合并慢性阻塞性肺疾病+0.964×APACHEⅡ評分+0.829×抗菌藥物使用頻率+0.885×抗菌藥物持續(xù)使用時間+1.195×miR-21,經(jīng)Hosmer-Lemeshow檢驗擬合度較好,而且風險分層分析顯示分值越高,感染率越高。因此,臨床在評估患者病情狀況、合理應用抗菌藥物的基礎上應加強對miR-21的監(jiān)測,以降低MDRO感染風險。

綜上所述,ICU膿毒癥患者miR-21表達不僅與病情進展有關,還與T淋巴細胞亞群百分比密切相關;miR-21高表達會導致MDRO感染風險增加,檢測miR-21表達有利于指導臨床制訂MDRO感染防治策略。但本研究的局限性在于,未進一步明確不同miR-21水平患者MDRO感染防治效果,這可以作為下一步研究的方向。