miR-155、PDCD4、GSN在高血壓性腦出血中的表達(dá)及預(yù)后價值研究*

裴獻(xiàn)光,魏海亮,高 芳,許亞寧,王志強(qiáng)

邯鄲市第一醫(yī)院:1.神外一科;2.外三科,河北邯鄲 056002

腦出血是由顱內(nèi)微小動脈瘤破裂引起的出血,占所有腦卒中的20%左右,與高血壓關(guān)系密切,腦出血患者中有95%伴高血壓[1-2]。高血壓性腦出血(HICH)是長期高血壓導(dǎo)致顱腦內(nèi)小動脈管壁破裂發(fā)生變性、缺血、壞死等病理改變而造成血管破裂出血的疾病,多見于中老年[3]。我國HICH發(fā)病率逐年增加,發(fā)病兇險,患者常表現(xiàn)為意識障礙、肢體乏力,嚴(yán)重者可出現(xiàn)大小便失禁、抽搐、昏迷癥狀,其病死率和病殘率均較高,部分HICH患者治療后仍存在神經(jīng)功能障礙,3個月內(nèi)病死率最高可達(dá)18.4%[4-5]。因此,尋找特異性指標(biāo)對評估HICH的嚴(yán)重程度和預(yù)后尤為重要。微小核糖核酸(miRNA)-155(miR-155)與腫瘤、免疫、造血、炎癥有關(guān),在腦組織缺血缺氧過程中可加重組織損傷[6]。程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)屬細(xì)胞死亡因子,參與細(xì)胞增殖、凋亡過程,PDCD4與腦出血有關(guān)[7]。凝溶膠蛋白(GSN)屬肌動蛋白結(jié)合蛋白,具有清除肌動蛋白、減輕機(jī)體損傷的作用[8]。miR-155、PDCD4、GSN均在HICH疾病中發(fā)揮重要作用,但作為臨床檢測指標(biāo),三者同時在HICH患者中進(jìn)行檢測的報道較少,因此,本研究旨在探討miR-155、PDCD4、GSN在HICH中的表達(dá)情況及用于預(yù)測HICH患者預(yù)后的價值,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2021年1月至2022年1月本院收治的150例HICH患者納入研究作為研究組,男86例,女64例;年齡45～70歲,平均(53.68±6.75)歲;體重指數(shù)21～25 kg/m2,平均(23.65±1.31)kg/m2;高血壓病程2～8年,(平均3.68±0.54)年;84例有吸煙史,73例有飲酒史,75例合并糖尿病,67例合并冠心病。另外,選取同期于本院治療的150例無腦出血的高血壓患者作為對照組,男80例,女70例;年齡45～68歲,平均(52.87±6.71)歲;體重指數(shù)21～25,平均(23.73±1.20)kg/m2;高血壓病程2～7年,平均(3.61±0.52)年;76例有吸煙史,61例有飲酒史,65例合并糖尿病,60例合并冠心病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。納入研究者或其直系親屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)研究組患者符合《高血壓性腦出血》[9]中HICH的診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)影像學(xué)頭顱CT檢查顯示高密度影像,既往有高血壓史,首次發(fā)病,發(fā)病6 h內(nèi)入院,有HICH所致神經(jīng)功能缺損癥狀,確診為HICH;(2)對照組患者在未使用高血壓藥物情況下,收縮壓≥140 mmHg或(和)舒張壓≥90 mmHg,確診為高血壓,經(jīng)頭顱CT檢查未發(fā)現(xiàn)高密度影像。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴凝血功能異常、腦疝、血管病變、嚴(yán)重精神疾病者;(2)外傷所致腦出血,伴有傳染性、免疫性疾病、嚴(yán)重感染者;(3)存在腦部及其他惡性腫瘤者。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 取患者空腹靜脈血5 mL,以3 500 r/min離心10 min待測。

1.3.2miR-155檢測 使用聯(lián)邁生物Trizol試劑盒分離得到細(xì)胞RNA,使用凈信實(shí)業(yè)公司的核酸定量檢測儀檢測其濃度、純度,以總RNA為模板,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,然后進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。miR-155引物序列為F:5′-CTCGTGGTAATGCTAATTGTGA-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6為內(nèi)參,U6引物序列為F:5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′,R:5′-GTGCAGG GTCCGAGGT-3′。以U6作為內(nèi)參基因,最后用2-ΔΔCt法計算miR-155相對表達(dá)水平。

1.3.3PDCD4檢測 采用莼試生物公司的人PDCD4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進(jìn)行檢測,分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,標(biāo)準(zhǔn)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL,再加待測樣品10 μL,混勻后置37 ℃下溫育30 min,甩去孔內(nèi)溶液,拍干,加滿洗滌液靜置30 s后甩去孔內(nèi)溶液,拍干,反復(fù)5次,除空白孔外每孔加酶標(biāo)試劑50 μL,再次溫育洗滌,加入顯色劑A、B各50 μL,37 ℃避光顯示15 min,每孔加50 μL終止液,在450 nm波長處測吸光度值。

1.3.4GSN檢測 采用侖昌碩生物公司的GSN ELISA試劑盒檢測,設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔并加入200 μL標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品,空白孔不加,混勻后置于37 ℃ 60 min,甩去孔內(nèi)溶液,拍干,用洗滌液洗板3次,每孔加入200 μL封閉液,置于37 ℃ 60 min,用洗滌液洗板3次,甩干,加入200 μL稀釋液,37 ℃放置120 min,洗滌3次,甩干,加入200 μL辣根過氧化物酶羊抗兔抗體,37 ℃放置60 min,再次洗滌3次,甩干,加入底物200 mL于暗處反應(yīng)15 min,每孔加入50 μL終止液混勻,在450 nm處測吸光度值。

1.4觀察指標(biāo) (1)比較研究組、對照組患者miR-155、PDCD4、GSN水平。(2)比較HICH不同嚴(yán)重程度患者miR-155、PDCD4、GSN水平,嚴(yán)重程度以美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分[10]進(jìn)行評估,共有11個項目,總分為42分,輕度0～7分、中度>7～15分、重度>15～42分,分?jǐn)?shù)越高,神經(jīng)受損程度越嚴(yán)重。(3)比較HICH不同預(yù)后患者miR-155、PDCD4、GSN水平,預(yù)后情況采用格拉斯哥(GOS)[11]評分評估,總分?jǐn)?shù)為1～5分,1分為死亡,5分為痊愈,分值越高,表明預(yù)后越好,將1～3分記為預(yù)后不良組,4～5分記為預(yù)后良好組。(4)分析miR-155、PDCD4、GSN與HICH嚴(yán)重程度、HICH預(yù)后的相關(guān)性。(5)比較HICH不同預(yù)后患者一般資料,包括性別、男性、體重指數(shù)、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、冠心病史,出血量、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C);采用邁瑞全自動生化分析儀BS-280檢測患者甘油三酯、總膽固醇、LDL-C、HDL-C。(6)采用Logistic回歸分析HICH患者預(yù)后不良的危險因素。(7)分析miR-155、PDCD4、GSN單獨(dú)及聯(lián)合檢測對HICH患者預(yù)后不良的預(yù)測價值,并繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1miR-155、PDCD4、GSN水平比較 研究組miR-155和PDCD4水平高于對照組(P<0.05),GSN水平低于對照組(P<0.05),見表1。

表1 研究組和對照組患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較

2.2不同嚴(yán)重程度HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較 經(jīng)NIHSS評分評估,150例HICH患者中,輕度53例,中度64例,重度33例;隨HICH嚴(yán)重程度加重,miR-155、PDCD4水平增高,GSN水平降低(P<0.05),見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較

2.3不同預(yù)后HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比較 經(jīng)GOS評分評估,150例HICH患者中,預(yù)后良好109例,預(yù)后不良41例;預(yù)后不良組miR-155和PDCD4水平高于預(yù)后良好組(P<0.05),GSN水平低于預(yù)后良好組(P<0.05),見表3。

表3 不同預(yù)后HICH組miR-155、PDCD4、GSN水平比較

2.4miR-155、PDCD4、GSN與HICH嚴(yán)重程度、HICH預(yù)后的相關(guān)性分析 miR-155、PDCD4與HICH嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r=0.653、0.642,P<0.05),與HICH預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(r=-0.625、-0.575,P<0.05);GSN與HICH嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(-0.591,P<0.05),與HICH預(yù)后呈正相關(guān)(r=0.583,P<0.05),見表4。

表4 miR-155、PDCD4、GSN與HICH嚴(yán)重程度、HICH預(yù)后的相關(guān)性分析

2.5HICH不同預(yù)后患者一般資料比較 預(yù)后不良組出血量≥60 mL占比高于預(yù)后良好組(P<0.05),見表5。

表5 HICH不同預(yù)后患者一般資料比較或n(%)]

2.6HICH患者預(yù)后不良危險因素的Logstic回歸分析 miR-155、PDCD4水平升高,GSN水平降低是HICH患者預(yù)后不良的危險因素(P<0.05),見表6。

表6 HICH患者預(yù)后不良的Logstic回歸分析

2.7miR-155、PDCD4、GSN單獨(dú)及聯(lián)合檢測對HICH患者預(yù)后不良的預(yù)測價值分析 miR-155、PDCD4、GSN聯(lián)合檢測對HICH患者預(yù)后不良進(jìn)行預(yù)測的曲線下面積(AUC)為0.954,高于miR-155、PDCD4、GSN單獨(dú)檢測的0.877、0.763、0.801(P<0.05),見表7、圖1。

圖1 miR-155、PDCD4、GSN單獨(dú)及聯(lián)合檢測用于預(yù)測HICH患者預(yù)后不良的ROC曲線

表7 miR-155、PDCD4、GSN及聯(lián)合對HICH患者預(yù)后不良的預(yù)測價值分析

3 討 論

HICH是中老年常見疾病之一,患者起病較急,表現(xiàn)為突然頭部劇痛,頻繁嘔吐,收縮壓高達(dá)180 mmHg以上。80%的HICH發(fā)生在幕上,由于長期高血壓影響,患者血管承受的沖擊較大,導(dǎo)致腦動脈內(nèi)膜細(xì)胞受損,使內(nèi)膜出現(xiàn)粥樣硬化,形成細(xì)小動脈瘤,當(dāng)患者血壓突然升高時,動脈瘤破裂則出現(xiàn)腦出血[12]。臨床治療中,一般根據(jù)腦出血患者自身情況、腦出血的部位以及出血量選擇保守治療、開顱手術(shù)或者微創(chuàng)手術(shù),但患者病死率仍居高不下,部分患者經(jīng)治療后仍會有殘疾[13]。因此,尋找能有效反映HICH患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)至關(guān)重要。

miRNA在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,miR-155具有多種功能基因,由可活化的B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫、炎癥細(xì)胞產(chǎn)生,與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),miR-155可作為促炎癥分子加劇炎癥過程,而炎癥反應(yīng)是腦出血繼發(fā)性損傷的主要機(jī)制[14]。有研究顯示,高血壓患者中,miR-155可通過調(diào)節(jié)血管中血管緊張素Ⅱ-1型受體的表達(dá),進(jìn)而參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展[15]。本研究中HICH患者miR-155水平高于無腦出血的高血壓患者,主要是HICH患者發(fā)生腦出血后腦組織中存在炎癥反應(yīng),外周循環(huán)系統(tǒng)中miRNA表達(dá)可出現(xiàn)動態(tài)變化,miR-155在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定性較高,當(dāng)腦組織出現(xiàn)缺血缺氧后,其水平可快速上升。劉亞菲等[16]的研究表明,miR-155在HICH患者中的水平明顯升高,與血腫體積呈正相關(guān),可作為判斷HICH患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究中,根據(jù)NIHSS評分將HICH患者病情分為輕度、中度、重度,結(jié)果顯示,隨著患者病情嚴(yán)重度增加,miR-155水平不斷升高。預(yù)后不良患者miR-155水平明顯高于預(yù)后良好患者。miR-155水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。miR-155水平升高是HICH患者預(yù)后不良的危險因素,提示miR-155可作為預(yù)測HICH患者預(yù)后的指標(biāo)。買買江·阿不力孜[17]報道,腦出血患者miR-155水平較高,腦出血死亡患者血標(biāo)本中miR-155水平顯著高于存活者,同時miR-155水平可用于預(yù)測患者6個月內(nèi)的生存預(yù)后,并與NIHSS評分呈正相關(guān)。此外,王帆等[18]的研究表明,miR-155水平隨NIHSS評分升高而逐漸增高,在預(yù)后不良患者中顯著上升,可用于評估患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

PDCD4是凋亡過程中上調(diào)的基因,分布在各類組織器官中,在肝癌、肺癌、腦腫瘤中研究較多,且其為低表達(dá),可促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、擴(kuò)散,又被稱為抑癌基因[19-20]。PDCD4是細(xì)胞凋亡過程中發(fā)現(xiàn)的特定調(diào)節(jié)基因,其水平在細(xì)胞凋亡中升高,如在小鼠腦出血的研究中,PDCD4水平較高,由于腦出血后神經(jīng)元凋亡或死亡是最嚴(yán)重后果,因此認(rèn)為PDCD4表達(dá)上調(diào)可能與促神經(jīng)元凋亡有關(guān)[21]。梁麗英等[22]的研究表明,miR-21能夠通過靶向調(diào)控PDCD4,進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究中,研究組PDCD4水平高于對照組,并隨著患者病情增加而上升,在預(yù)后不良患者中PDCD4水平明顯高于預(yù)后良好患者,與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),與預(yù)后呈負(fù)相關(guān),是HICH患者預(yù)后不良的危險因素,提示PDCD4可作為預(yù)測NICH患者預(yù)后的指標(biāo)。高倩等[23]研究表明,PDCD4在腦梗死患者中水平較高,并隨損傷程度增加而增加,PDCD4有助于早期診斷腦梗死。董雨等[24]研究認(rèn)為,PDCD4水平對HICH預(yù)后評估具有一定價值,在HICH患者中水平顯著升高,是HICH預(yù)后不良的危險因素。

GSN是一種中等大小的蛋白質(zhì),由375個氨基酸殘基組成,其編碼基因的長度約為70 kb,能調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合解聚,同時在細(xì)胞運(yùn)動、控制細(xì)胞程序性死亡等細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用。張宛越等[25]的研究表明,GSN在急性腦出血患者中水平較低,并與病情嚴(yán)重程度、預(yù)后有關(guān),可作為預(yù)后判斷指標(biāo)。本研究中,研究組GSN水平低于對照組,并隨著患者病情加重而降低,在預(yù)后不良患者中GSN水平明顯低于預(yù)后良好患者,是HICH患者預(yù)后不良的保護(hù)因素,提示GSN可作為預(yù)測HICH患者預(yù)后指標(biāo)。原因為HICH可導(dǎo)致組織損傷,細(xì)胞間隙會釋放激動蛋白,使機(jī)體微循環(huán)受阻,引起微血栓形成和內(nèi)細(xì)胞損傷,造成多器官損傷,而GSN可快速與肌動蛋白結(jié)合,降低毒性,保護(hù)機(jī)體。楊學(xué)麗等[26]研究表明,GSN在急性腦出血預(yù)后不良患者中水平較低,與其他指標(biāo)結(jié)合可有效評估患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)測預(yù)后。李愛華等[27]的研究表明,GSN水平隨患者神經(jīng)缺損程度加重而增高,在預(yù)后不良的患者中降低,與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),對腦出血患者預(yù)后的預(yù)測價值較高,監(jiān)測該指標(biāo)有助于更好地采取干預(yù)措施。以上研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果還顯示,預(yù)后不良患者出血量≥60 mL占比較高,預(yù)后不良患者出血量較多,出血量較多對腦組織損傷較大,患者容易合并腦疝,遺留后遺癥,本研究發(fā)現(xiàn),PDCD4預(yù)測HICH患者預(yù)后不良的AUC為0.763,靈敏度、特異度分別為70.7%、81.7%,而董雨等[24]研究顯示,PDCD4預(yù)測HICH患者預(yù)后不良的AUC為0.834,靈敏度、特異度分別為71.08%、68.35%,可能是因為本研究樣本量較小而導(dǎo)致結(jié)果不一致。本研究結(jié)果中,GSN預(yù)測HICH患者預(yù)后不良的AUC為0.801,張宛越等[25]的研究顯示,GSN預(yù)測患者預(yù)后不良的AUC為0.748,與本研究相比較低,可能與樣本量有關(guān),而李愛華等[27]研究顯示GSN預(yù)測患者預(yù)后不良的AUC為0.877,相比本研究的0.801較高,導(dǎo)致其結(jié)果的原因可能是由于本研究選取患者為HICH患者,而李愛華等[27]研究選取對象為急性腦出血患者,研究對象可能存在差異而導(dǎo)致結(jié)果不一致。miR-155、PDCD4、GSN聯(lián)合檢測對HICH患者預(yù)后不良的預(yù)測價值優(yōu)于單項指標(biāo)預(yù)測。由于本研究樣本量較小,對miR-155、PDCD4、GSN在HICH預(yù)后不良發(fā)生機(jī)制中的作用未進(jìn)行詳細(xì)分析,結(jié)論難免存在偏倚。

綜上所述,miR-155、PDCD4在HICH患者中呈高表達(dá),GSN呈低表達(dá)。miR-155、PDCD4水平升高,GSN水平降低是HICH患者預(yù)后不良的危險因素,聯(lián)合檢測這3項指標(biāo)對HICH患者預(yù)后有一定的預(yù)測價值。