腸易激綜合征患者腸道菌群改變及其與糞便鈣衛(wèi)蛋白的關(guān)系*

經(jīng)先振,王 露,閆倩楠

徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇徐州221000

腸易激綜合征(IBS)主要是由于機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)以及心理因素等導(dǎo)致的腸道功能紊亂性疾病,以腹痛、腹脹、排便習(xí)慣或大便性狀改變等為主要臨床表現(xiàn),多發(fā)生于中老年人群。近年來隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展、生活壓力的增加與人們飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整等,其發(fā)病率不斷增高[1]。根據(jù)糞便性狀與排便特點(diǎn)的不同,IBS可分為腹瀉型、便秘型以及混合型等亞型,臨床上以腹瀉型較為多見。IBS患者臨床表現(xiàn)為非特異性癥狀,病情易復(fù)發(fā),病程較長(zhǎng),對(duì)患者的身體健康及生活質(zhì)量造成了不良影響[2]。腸道菌群是人體腸道中最復(fù)雜的微生物群落,其中的微生物數(shù)量巨大,參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能,與免疫、腸黏膜屏障、代謝等方面關(guān)系密切[3]。有研究表明,腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致免疫代謝異常,造成IBS、潰瘍性結(jié)腸炎等多種腸道疾病發(fā)生[4]。糞便鈣衛(wèi)蛋白(FC)是一種中性粒細(xì)胞的鈣結(jié)合蛋白,在糞便中穩(wěn)定存在,具有抗微生物、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)功能,有研究指出其與非感染性IBS相關(guān),可作為評(píng)估非感染性IBS臨床治療效果的一個(gè)生物指標(biāo)[5]。雖然既往已有關(guān)于IBS患者腸道菌群和FC水平變化的相關(guān)研究報(bào)道[4-5],但對(duì)于IBS患者腸道菌群與FC關(guān)系的相關(guān)研究較少。鑒于此,本課題組分析IBS患者腸道菌群改變及其與FC的關(guān)系,以期為臨床治療IBS提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年10月至2022年1月本院收治的101例IBS患者納入研究,其中腹瀉型50例(腹瀉組),便秘型28例(便秘組),混合型23例(混合組)。腹瀉組中,男27例,女23例;年齡30～72歲,平均(47.15±6.24)歲;病程0.8～6.5年,平均(2.84±0.63)年。便秘組中,男15例,女13例;年齡28～75歲,平均(47.67±6.52)歲;病程1.0～6.3年,平均(2.71±0.59)年?；旌辖M中,男13例,女10例;年齡32～71歲,平均(47.85±5.97)歲;病程0.7～6.8年,平均(2.89±0.65)年。腹瀉組、便秘組、混合組患者年齡、性別、病程比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外,選取同期在本院體檢的60例健康者作為對(duì)照組。對(duì)照組中,男32例,女28例;年齡26～76歲,平均(48.02±6.85)歲。4組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入研究的患者均符合《2020年中國(guó)腸易激綜合征專家共識(shí)意見》中IBS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];排除標(biāo)準(zhǔn):既往有胃腸手術(shù)史;有腸道器質(zhì)性疾病;有結(jié)腸腫瘤、炎癥反應(yīng)性腸病家族史;1個(gè)月內(nèi)服用過抗菌藥物;合并心、肝、腎及肺功能缺損;妊娠期及哺乳期女性;合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病或精神疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過(批號(hào):202008-001)。納入研究者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 受試者于檢查當(dāng)日留取新鮮糞便標(biāo)本10～20 g,放置于密閉無菌便盒中,常溫保存并于30 min內(nèi)送檢。

1.2.2腸道菌群及多樣性檢測(cè) 采用需氧菌培養(yǎng)基以及厭氧菌培養(yǎng)基對(duì)標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),厭氧菌培養(yǎng)基放置在有厭氧產(chǎn)氣袋的封閉厭氧罐中,需氧菌和厭氧菌平板倒置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,分別培養(yǎng)24、72 h后觀察結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)腸道菌群16S rDNA V3區(qū)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司CFX96型qPCR儀]。采用20 μL反應(yīng)體系:2×Taq Plus PCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL;反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。上游引物(上海生工生物公司合成):5′-GAA ATC CGA CAG CTT AAG GAG GTT TGA-3′,下游引物:5′-CAT TGC ACA GAT AGG ATT TGA TTT ACT3′。采用Mothur軟件計(jì)算不同隨機(jī)抽樣條件下的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)來反映腸道菌群多樣性。

1.2.3FC水平檢測(cè) 取受試者新鮮糞便標(biāo)本5～10 g,1∶1加入提取緩沖液,使用3 000 r/min離心5 min,取離心后的上清液分裝在EP管內(nèi),做好標(biāo)記保存在-20 ℃?zhèn)溆?采用免疫熒光層析法檢測(cè)FC水平,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,干式熒光免疫層析分析儀(型號(hào):FR-101)及相應(yīng)FC檢測(cè)試劑盒均由廣州灃潤(rùn)生物科技有限公司提供。

1.3觀察指標(biāo) 比較4組腸道菌群數(shù)量、定植抗力(B/E值)、菌群多樣性以及FC水平。其中,腸道菌群數(shù)量以每克糞便菌落形成單位(CFU)數(shù)的對(duì)數(shù)(lgCFU/g)表示;B/E值為雙歧桿菌數(shù)量/腸桿菌數(shù)量比值;Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小表示菌群多樣性越高;分析各分型IBS患者腸道菌群數(shù)量、B/E值、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)與FC水平的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.14組腸道菌群數(shù)量以及B/E值的比較 腹瀉組、便秘組及混合組雙歧桿菌數(shù)量、B/E值均低于對(duì)照組(P<0.05),腸桿菌數(shù)量均高于對(duì)照組(P<0.05);腹瀉組與混合組乳桿菌數(shù)量均低于對(duì)照組(P<0.05),擬桿菌數(shù)量均高于對(duì)照組(P<0.05);便秘組擬桿菌、乳桿菌數(shù)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腹瀉組、便秘組以及混合組腸球菌、葡萄球菌數(shù)量與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腹瀉組雙歧桿菌、腸桿菌、擬桿菌、乳桿菌、腸球菌、葡萄球菌數(shù)量以及B/E值與便秘組、混合組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),便秘組上述各菌數(shù)量及B/E值與混合組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組菌群數(shù)量及B/E值比較

2.24組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)比較 腹瀉組、便秘組以及混合組Shannon指數(shù)均低于對(duì)照組(P<0.05),Simpson指數(shù)均高于對(duì)照組(P<0.05);腹瀉組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與便秘組、混合組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);便秘組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與混合組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)比較

2.34組FC水平的比較 腹瀉組與混合組FC水平均高于對(duì)照組(P<0.05),但便秘組與對(duì)照組FC水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腹瀉組FC水平與便秘組、混合組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);便秘組FC水平與混合組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 4組FC水平比較

2.4分析不同分型IBS患者腸道菌群數(shù)量、菌群多樣性、B/E值與FC水平的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)分析,腹瀉組及混合組IBS患者雙歧桿菌數(shù)量、乳桿菌數(shù)量、B/E值、Shannon指數(shù)與FC水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),腸桿菌數(shù)量、擬桿菌數(shù)量、Simpson指數(shù)與FC水平呈正相關(guān)(P<0.05),腸球菌、葡萄球菌與FC水平無相關(guān)性(P>0.05)。便秘組以上各指標(biāo)與FC水平均無相關(guān)性(P>0.05)。見表4、5。

表4 IBS患者腸道菌群數(shù)量、多樣性以及B/E值與FC水平的相關(guān)性

表5 IBS患者腸道菌群多樣性以及B/E值與FC水平的相關(guān)性

3 討 論

IBS是一種常見的功能性腸道疾病,發(fā)病機(jī)制尚不明確,但應(yīng)激反應(yīng)及精神因素可誘發(fā)臨床癥狀或使其加重,病理生理學(xué)多認(rèn)為IBS與腸道菌群失調(diào)、胃腸動(dòng)力異常、胃腸激素及精神心理、遺傳等因素密切相關(guān),與腸道感染炎癥亦存在一定的關(guān)系[7]。有研究報(bào)道,IBS患者腸道菌群存在失調(diào)的現(xiàn)象,腸道微生態(tài)平衡被打破,從而導(dǎo)致機(jī)體腸道功能紊亂,引發(fā)此病[8]。邢晨等[9]報(bào)道,IBS患者FC水平與其患病、腹痛時(shí)間以及解稀水便等癥狀關(guān)系密切。本研究旨在探討IBS患者腸道菌群改變與FC水平的關(guān)系,以期臨床診治提供參考。

本研究結(jié)果顯示,腹瀉組、便秘組、混合組3組間的雙歧桿菌、腸桿菌、擬桿菌、乳桿菌、腸球菌、葡萄球菌數(shù)量以及B/E值無明顯差異,但腹瀉組、便秘組及混合組雙歧桿菌數(shù)量、B/E值均較對(duì)照組低,腸桿菌數(shù)量均高于對(duì)照組,而且腹瀉組與混合組乳桿菌數(shù)量均低于對(duì)照組,腹瀉組與混合組擬桿菌數(shù)量均高于對(duì)照組,說明IBS各亞型患者存在腸道菌群分布異常及腸道定植抗力下降。腸桿菌、擬桿菌是條件致病菌,能夠控制機(jī)體的新陳代謝以及調(diào)節(jié)維生素水平[10]。雙歧桿菌、乳桿菌是益生菌,均具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及增加腸黏膜屏障的作用[11]。致病菌的增加以及益生菌的減少破壞了腸道微生態(tài)的平衡,造成拮抗病原微生物定植抗力減弱,腸黏膜屏障收到損傷,腸道通透性增加,從而引發(fā)腸道慢性炎癥性疾病[12]。相關(guān)調(diào)查結(jié)果顯示,IBS患者與健康個(gè)體相比,其糞便雙歧桿菌、乳桿菌以及大腸桿菌數(shù)量較低,而腸桿菌數(shù)量較高[13],本研究部分結(jié)果與該報(bào)道一致。有研究發(fā)現(xiàn),IBS患者存在腸道菌群失調(diào)以及定植抗力受損,具體表現(xiàn)在腸道潛在致病菌增加以及有益菌減少[14]。另有研究指出,便秘型IBS及腹瀉型IBS患者的雙歧桿菌數(shù)量均低于健康志愿者,腸桿菌數(shù)量均高于健康志愿者[15],本研究結(jié)果與此一致,但該研究同時(shí)指出腹瀉型IBS患者乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量均較便秘型IBS患者低,而腸桿菌、腸球菌數(shù)量均較便秘型IBS患者高,本研究結(jié)果與此不一致,可能與所選樣本量的大小、患者個(gè)體間的差異(飲食習(xí)慣、生活環(huán)境)等有關(guān),后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討。此外,有研究報(bào)道,不同亞型的IBS患者B/E值均下降,但腹瀉組B/E值低于便秘組[16],本研究結(jié)果部分與此一致,部分不一致,可能所選樣本差異有關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),腹瀉組、便秘組以及混合組Simpson指數(shù)均高于對(duì)照組,Shannon指數(shù)均低于對(duì)照組,說明IBS患者腸道菌群的多樣性降低,與陳璐等[17]的研究結(jié)果一致?？律傩鄣萚12]研究亦指出,腸道菌群Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)在腹瀉型IBS、便秘型IBS患者間無差異,本研究結(jié)果與此相符合。IBS患者腸道菌群的定植抗力下降,腸道有益菌減少,潛在致病菌增加,破壞腸道黏膜屏障,腸黏膜受損又可增加致病菌對(duì)黏膜的定植力,減弱有益菌的定植力,形成惡性循環(huán),另腸道運(yùn)動(dòng)異常也可減弱益生菌的定植力,從而導(dǎo)致IBS患者腸道菌群的多樣性發(fā)生改變。因此,IBS患者定植抗力下降,腸道菌群異常,多樣性降低。

FC是糞便炎癥標(biāo)志物之一,主要來源于腸道黏膜組織中性粒細(xì)胞的脫落,可反映腸道局部的炎癥程度[18]。動(dòng)物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),IBS大鼠存在促炎與抗炎因子的失衡,抗炎因子白細(xì)胞介素-10表達(dá)降低,IBS大鼠常年存在持續(xù)低度的炎癥狀態(tài)[19]。本研究發(fā)現(xiàn),腹瀉組與混合組FC水平高于對(duì)照組,說明腹瀉型與混合型IBS患者FC水平異常升高,可能存在一定的腸道炎癥狀態(tài)。張憲波等[20]研究顯示,IBS患者FC水平為(49.2±19.8)μg/g,較健康人群(33.8±13.4)μg/g升高,本研究結(jié)果與此一致。牛麗娜[21]研究報(bào)道,腹瀉型IBS患者與健康人群的FC中位數(shù)分別為108.637、102.191 μg/g,二者無明顯差異,與本研究結(jié)果不一致,可能與研究樣本量較少、患者個(gè)體間的差異(病情、病程等)等有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),腹瀉型及混合型IBS患者雙歧桿菌數(shù)量、乳桿菌數(shù)量、B/E值、Shannon指數(shù)均與FC水平呈負(fù)相關(guān),腸桿菌數(shù)量、擬桿菌數(shù)量、Simpson指數(shù)均與FC水平呈正相關(guān),說明腹瀉型及混合型IBS患者的FC水平與腸道菌群密切相關(guān),FC水平可能受腸道菌群的調(diào)控。IBS患者致病病菌的增加及益生菌的減少可加重腸道黏膜病變,腸黏膜屏障受損,黏膜內(nèi)的中性粒細(xì)胞脫落并分泌大量的鈣衛(wèi)蛋白,導(dǎo)致FC水平升高。炎性反應(yīng)可促進(jìn)免疫活化,進(jìn)而引起腸道菌群失調(diào),菌群紊亂可進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng),形成惡性循環(huán)。有研究表明,FC與腸道菌群有關(guān),雙歧三聯(lián)活菌制劑可提高潰瘍性結(jié)腸炎的療效,改善腸道菌群組成,降低FC水平,減弱免疫反應(yīng)[22]。結(jié)合本研究結(jié)果,腹瀉型及混合型IBS患者FC水平異常,可能是腸道菌群紊亂的影響。

綜上所述,IBS各亞型患者腸道菌群定植抗力下降,均存在腸道菌群失調(diào)及多樣性下降的情況,尤以腹瀉型與混合型為甚。另外,腹瀉型及混合型IBS患者FC水平也異常升高,而且腹瀉型及混合型IBS患者腸道菌群改變與FC水平變化具有一定的相關(guān)性。