基因擴(kuò)增技術(shù)在食品檢測(cè)中的質(zhì)量控制要點(diǎn)

王 磊

（天津市食品安全檢測(cè)技術(shù)研究院，天津 300308）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)最主要的應(yīng)用方向，其原理為通過(guò)從樣本中提取核酸并進(jìn)行擴(kuò)增，分析目標(biāo)基因序列，最終獲得樣本的物種信息。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，該技術(shù)以普通PCR為基礎(chǔ)，已衍生出多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、數(shù)字PCR等多種應(yīng)用途徑，并以其省時(shí)高效的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品安全等檢測(cè)領(lǐng)域[1]。本文結(jié)合實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)PCR檢測(cè)技術(shù)的主要應(yīng)用范圍進(jìn)行論述，針對(duì)內(nèi)、外源影響因素，對(duì)檢測(cè)的質(zhì)量控制要點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)，以期為相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)提供參考依據(jù)。

1 基因擴(kuò)增技術(shù)在食品檢測(cè)中的主要應(yīng)用

1.1 致病性微生物檢測(cè)

食源性致病微生物檢測(cè)一般以致病菌為主，其常規(guī)檢測(cè)方法為培養(yǎng)法，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。PCR技術(shù)作為其輔助手段，既可以用于檢測(cè)末端對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，也可用于前端對(duì)增菌液進(jìn)行初篩，具備靈活準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但其囿于原理，無(wú)法考查微生物的生物活性。目前，PCR技術(shù)用于致瀉大腸埃希氏菌和諾如病毒的檢測(cè)方法已經(jīng)被食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用，用于沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)致病菌的鑒定方法及商品化試劑也已被相繼研發(fā)。

1.2 動(dòng)物源性成分檢測(cè)

動(dòng)物源性成分鑒定主要用于肉制品摻假的檢測(cè)[2]，目前豬、牛、羊、馬、驢、雞和鴨等常見(jiàn)畜禽肉類(lèi)的鑒定都已建立了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。其中，以實(shí)時(shí)熒光PCR的應(yīng)用較為突出，其優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)建立已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，比對(duì)計(jì)算出目標(biāo)拷貝數(shù)的初始含量，實(shí)現(xiàn)成分的相對(duì)定量分析。另外，可進(jìn)行多種成分同時(shí)測(cè)定的多重PCR技術(shù)也逐漸得到應(yīng)用。

1.3 過(guò)敏原成分檢測(cè)

食品過(guò)敏原包括甲殼類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蛋類(lèi)、牛奶、花生、堅(jiān)果、大豆、小麥以及芝麻等成分，現(xiàn)階段針對(duì)該類(lèi)成分的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要是用于出口食品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，方法上以熒光定量PCR法為主。與依賴(lài)于分析特定蛋白的方法相比，熒光定量PCR方法在檢測(cè)中顯示出較高的靈敏度和可靠性，更容易滿(mǎn)足該類(lèi)成分微量、痕量的檢出需求[3]。

1.4 轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因成分是最早應(yīng)用基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的食品類(lèi)別，普通PCR和熒光PCR技術(shù)在該領(lǐng)域中占主導(dǎo)地位。我國(guó)現(xiàn)已經(jīng)頒布了包括通用要求和具體種類(lèi)品系的一系列檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，形成了比較完備的體系。實(shí)際檢測(cè)中需要考慮到領(lǐng)域中內(nèi)源基因、外源基因、啟動(dòng)子、終止子等特定概念[4]，對(duì)引物設(shè)計(jì)、結(jié)果判定等步驟進(jìn)行系統(tǒng)性考量。

2 基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的質(zhì)量控制要點(diǎn)

2.1 人員的控制

實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)人員應(yīng)進(jìn)行定期培訓(xùn)，重點(diǎn)在于分子生物學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)、實(shí)驗(yàn)操作技能、規(guī)范化操作、污染預(yù)防處置辦法和生物安全等內(nèi)容。同時(shí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期組織或參加實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)試驗(yàn)，通過(guò)考核訓(xùn)練提升檢測(cè)人員的操作技能。

PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)具有精細(xì)微量的操作特點(diǎn)，檢測(cè)人員的業(yè)務(wù)熟練程度和責(zé)任心成為主導(dǎo)檢測(cè)結(jié)果有效性的決定性因素。因此，檢測(cè)人員必須嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量體系規(guī)定的檢測(cè)流程、檢測(cè)方法，杜絕因操作不細(xì)致導(dǎo)致的結(jié)果異常甚至交叉污染的發(fā)生，同時(shí)也要求實(shí)驗(yàn)室在質(zhì)量監(jiān)督活動(dòng)中對(duì)檢測(cè)人員的實(shí)驗(yàn)作風(fēng)和實(shí)驗(yàn)習(xí)慣加以重點(diǎn)考察。

2.2 儀器設(shè)備的控制

作為實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程的重要核心條件，PCR擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、生物安全柜、天平、低溫離心機(jī)、核酸濃度測(cè)定儀和移液器等儀器設(shè)備要按照規(guī)程要求定期進(jìn)行維護(hù)、期間核查、檢定校準(zhǔn)，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運(yùn)行。同時(shí)應(yīng)制定相應(yīng)的設(shè)備防護(hù)程序，避免操作中核酸或試劑泄露對(duì)設(shè)備造成不良影響。

2.3 樣本和試劑耗材的控制

2.3.1 樣本

樣本的處理應(yīng)按照方法和作業(yè)指導(dǎo)書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行，做好編號(hào)和相應(yīng)登記。檢測(cè)人員根據(jù)樣本類(lèi)型采取相適應(yīng)的方式進(jìn)行保存。制備樣本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行核酸提取，核酸若需暫時(shí)儲(chǔ)存，應(yīng)于-20 ℃以下保存，避免反復(fù)凍融；需要長(zhǎng)時(shí)間保存的應(yīng)儲(chǔ)存于-80 ℃條件下，保存期不宜超過(guò)6個(gè)月。

2.3.2 試劑和耗材

試劑質(zhì)量直接影響PCR反應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果，故不得使用偽劣或過(guò)期試劑。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)每批次購(gòu)進(jìn)的新試劑與保存的陰、陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行同條件驗(yàn)證試驗(yàn)，質(zhì)量驗(yàn)收合格后方可使用。試劑保存應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)放置在恒溫環(huán)境和專(zhuān)用冰箱中，未開(kāi)封試劑與已部分使用試劑分開(kāi)放置。需低溫保存又要經(jīng)常使用的試劑需分裝后貯存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融和打開(kāi)容器影響試劑質(zhì)量，同時(shí)減少實(shí)驗(yàn)室的偶然性污染機(jī)會(huì)。

實(shí)驗(yàn)室各功能區(qū)所用的手套、移液器吸頭、離心管、反應(yīng)管等物品均應(yīng)一次性使用；加樣環(huán)節(jié)選用帶濾芯移液器吸頭，以防操作過(guò)程中引入污染。

2.4 檢測(cè)方法的控制

基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)檢測(cè)方法制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，明確相關(guān)注意事項(xiàng)，規(guī)程應(yīng)涵蓋試劑準(zhǔn)備、測(cè)定方法和儀器操作等內(nèi)容。針對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)的特性，實(shí)驗(yàn)室還需制定相應(yīng)的試劑登記驗(yàn)收程序、清潔程序、污染控制及消除程序和過(guò)程控制程序以保證檢測(cè)結(jié)果的有效性。在明確區(qū)分檢測(cè)項(xiàng)目個(gè)體化差異的基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)具體情況對(duì)試驗(yàn)程序進(jìn)行規(guī)范完善，并定期對(duì)其進(jìn)行檢查核對(duì)，持續(xù)改進(jìn)，確保其時(shí)效性和適用性，做到檢測(cè)過(guò)程有章可循，檢測(cè)記錄有據(jù)可查。

2.5 檢測(cè)環(huán)境的控制

2.5.1 實(shí)驗(yàn)室功能區(qū)域的劃分

基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有充分、合理的空間，良好的照明和通風(fēng)設(shè)備，并遵照檢測(cè)工作流程，按單向流動(dòng)原則進(jìn)行規(guī)范化分區(qū)。一般按照GB/T 27403——2008、GB/T 19495.2——2004將實(shí)驗(yàn)室分隔為試劑配制和貯存區(qū)、樣品制備區(qū)、PCR反應(yīng)配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)5個(gè)工作區(qū)；也可按照GB/T 32146.3——2015分隔為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)4個(gè)工作區(qū)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身硬件條件和檢測(cè)方向需求，合理布局規(guī)劃[5]。

要求各功能區(qū)必須互相獨(dú)立，采取空間隔離并明確標(biāo)識(shí)，應(yīng)各自設(shè)有緩沖間，供更換工作服用；檢測(cè)空間應(yīng)相對(duì)封閉，避免頻繁的空氣對(duì)流產(chǎn)生；各區(qū)的儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)用品和清潔工具必須專(zhuān)用，不得混用；各區(qū)應(yīng)具備通風(fēng)裝置，以便及時(shí)排除空氣中的核酸氣溶膠。最終實(shí)現(xiàn)檢測(cè)過(guò)程單向的操作流、人流、物流以及氣流，盡可能預(yù)防核酸污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部環(huán)境的控制

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部環(huán)境應(yīng)始終圍繞預(yù)防和避免核酸污染這一原則進(jìn)行控制。每次實(shí)驗(yàn)操作前后應(yīng)用紫外線(xiàn)照射整個(gè)試驗(yàn)區(qū)域（≥30 min）；定期采用10%次氯酸鈉或1%過(guò)氧乙酸擦拭地面及工作臺(tái)以破壞殘留的核酸，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行換氣和消毒，預(yù)防空氣中氣溶膠污染源。

各區(qū)試驗(yàn)結(jié)束后廢棄的樣本、反應(yīng)管、移液器吸頭等物品應(yīng)就地及時(shí)置于盛有10%次氯酸鈉的容器中浸泡（≥6 h），同時(shí)涉及微生物操作的所有廢棄物必須經(jīng)過(guò)高壓滅菌并按醫(yī)療垃圾物處理，從而在實(shí)驗(yàn)用品、設(shè)施和空氣環(huán)境中徹底控制污染源。

2.6 檢測(cè)過(guò)程的控制

2.6.1 核酸提取

核酸的提取是關(guān)系檢測(cè)結(jié)果是否成立的關(guān)鍵步驟，因此操作過(guò)程必須注意避免標(biāo)本間的交叉污染及核酸模板的降解、丟失。提取所采用的吸頭、離心管的品質(zhì)，開(kāi)蓋、吸棄上清液等操作是否正確均會(huì)對(duì)檢測(cè)質(zhì)量造成影響，檢驗(yàn)人員必須時(shí)刻注意。

對(duì)于DNA的提取，建議采用操作相對(duì)簡(jiǎn)便、人為影響因素較少的柱膜法或磁珠法，以取代傳統(tǒng)的CTAB抽提法；某些病毒檢測(cè)中則需制備RNA擴(kuò)增樣本，在提取完成后應(yīng)立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，合成較為穩(wěn)定的cDNA，以便于保存。

2.6.2 反應(yīng)液的配制

反應(yīng)體系的配制是PCR檢測(cè)準(zhǔn)確率的保障，應(yīng)按試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制反應(yīng)液。開(kāi)關(guān)微量離心管時(shí)須雙手操作，手部應(yīng)以最小面積接觸管上方，不得觸及管蓋內(nèi)面；Taq酶、引物等試劑在開(kāi)蓋前應(yīng)低速瞬時(shí)離心，使附在管壁和管蓋的液體沉于管底，保證試劑濃度一致；應(yīng)盡量減少試劑的開(kāi)蓋次數(shù)和時(shí)間，防止空氣、吸頭、濺沫等污染試劑，同時(shí)為確保實(shí)驗(yàn)體系的均一性，應(yīng)對(duì)最終反應(yīng)液反復(fù)抽吸混勻；考慮到吸取、分裝試劑時(shí)的誤差，所配制的反應(yīng)液應(yīng)比理論用量多出1～2孔的余量，以免實(shí)際用量不足。

空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照是反應(yīng)過(guò)程中最重要的主動(dòng)質(zhì)控方式，每次檢測(cè)實(shí)驗(yàn)必須同時(shí)伴隨進(jìn)行。加樣順序遵從核酸濃度由低到高的順序：①空白對(duì)照；②陰性對(duì)照；③樣品；④由低到高濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品（定量實(shí)驗(yàn)）；⑤陽(yáng)性對(duì)照。

2.6.3 擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

PCR反應(yīng)上機(jī)操作中，檢測(cè)人員應(yīng)確保8聯(lián)排管或96孔板平衡放置；反應(yīng)管加蓋或膜時(shí)，不得用記號(hào)筆標(biāo)記，也不可觸摸管蓋或膜的下表面。

擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳操作上樣時(shí)應(yīng)避免加樣液的溢出和點(diǎn)樣孔內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，避免PCR產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)立即對(duì)廢棄物進(jìn)行無(wú)害化處理，嚴(yán)防產(chǎn)物核酸進(jìn)入空氣，形成污染源。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上，隨著我國(guó)食品安全保障水平的不斷提升，PCR技術(shù)在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)得到推廣，現(xiàn)已經(jīng)逐漸向普及化和常規(guī)化方向發(fā)展。由于該技術(shù)的高敏感特性，某些細(xì)微不確定因素即可導(dǎo)致假性（陰、陽(yáng)）結(jié)果產(chǎn)生。為應(yīng)對(duì)此情況，實(shí)驗(yàn)室必須制定全方位的質(zhì)量控制措施，提升人員檢測(cè)能力，優(yōu)化試劑、設(shè)備、樣本、環(huán)境的管理，加強(qiáng)對(duì)檢測(cè)方法執(zhí)行的過(guò)程控制，從而充分保證所出具檢測(cè)結(jié)果的有效性和可信度，使這種新興的檢測(cè)手段得到更有效、更長(zhǎng)足的發(fā)展利用。