參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的離子通道研究進(jìn)展

何琪富,高 峰,吳盛輝,張 涌*,權(quán)富生*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,楊凌 712100;2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楊凌 712100;3.陜西省動(dòng)物胚胎工程技術(shù)研究中心,楊凌 712100)

哺乳動(dòng)物精子通過復(fù)雜的精子發(fā)生過程,在附睪管運(yùn)行過程中成熟,期間受到多種基因和激素調(diào)控,精子表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)數(shù)量和種類、生理及代謝狀態(tài)發(fā)生變化[1-2]。精子運(yùn)動(dòng)能力受多種翻譯后修飾、特定信號(hào)通路的激活或失活以及鞭毛擺動(dòng)等調(diào)節(jié)[3-4]。動(dòng)物本交或人工授精時(shí),精子進(jìn)入雌性生殖道,其功能受到離子通道和激素(如雌激素、孕激素)調(diào)節(jié),但是影響哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)的確切機(jī)制尚不清楚[5]。膜片鉗、電生理學(xué)、藥理學(xué)和分子技術(shù)等應(yīng)用于該領(lǐng)域研究后發(fā)現(xiàn),離子通道不僅參與調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)、獲能和頂體反應(yīng)[6-9],還參與調(diào)節(jié)精子對(duì)孕酮的趨化性[8]、精子膜極化和能量穩(wěn)態(tài)、在輸卵管移動(dòng)和卵母細(xì)胞結(jié)合過程[10-12]。其中,離子通道的功能在調(diào)節(jié)精子活力方面尤為重要,在精子發(fā)生的不同階段將各種離子通道和細(xì)胞分布與其功能狀態(tài)合并研究,有助于理解其參與精子分化和生理功能的分子機(jī)制[13-14]。因此總結(jié)這些離子通道在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)和受精能力中的機(jī)制,對(duì)于認(rèn)識(shí)精子運(yùn)動(dòng)功能調(diào)控和改善精子運(yùn)動(dòng)研究具有重要意義。

1 精子運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)因素

精子獲得運(yùn)動(dòng)能力是從附睪開始,在雄性和雌性生殖道的不同部位表現(xiàn)出不同類型的運(yùn)動(dòng)[1,15]。在附睪中,鞭毛蛋白磷酸化導(dǎo)致低振幅的對(duì)稱運(yùn)動(dòng),精子進(jìn)行基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng),漸進(jìn)性向前游動(dòng)[16]。隨后精子獲能,進(jìn)行超激活運(yùn)動(dòng)[17-18],頭部側(cè)向彎曲,鞭毛擺動(dòng)增加,使得精子能夠穿透黏稠的宮頸黏液,到達(dá)卵母細(xì)胞所處位置[19]。在精子運(yùn)動(dòng)的過程中要受到眾多因素的影響,諸如:精子運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),能量代謝水平,所處環(huán)境中Ca2+、K+、Na+、Cl-和 HCO3-濃度,ATP含量,pH和溫度等[16]。

1.1 結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

成熟精子包括頭部和尾部,其中尾部為精子運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力,尾部鞭毛的正常擺動(dòng)決定精子能夠順利到達(dá)受精部位完成受精。尾部中段主要結(jié)構(gòu)是軸絲和外圍的線粒體鞘,軸絲是精子的運(yùn)動(dòng)器官,由遠(yuǎn)端中心粒形成,一直伸向精子的末段。精子軸絲的結(jié)構(gòu)基本組成上都是9+2型,即位于中央的兩條是單根的微管,四周是9條成雙的微管,軸絲雙微管彎曲產(chǎn)生的推進(jìn)力,推進(jìn)精子的前向運(yùn)動(dòng)對(duì)于精子運(yùn)動(dòng)性能而言極其重要[12]。

1.2 能量代謝

位于精子鞭毛中段的線粒體會(huì)通過氧化磷酸化和糖酵解產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP),在激活動(dòng)力蛋白鏈中的ATP酶將ATP化學(xué)能轉(zhuǎn)換為機(jī)械能,為精子鞭毛的擺動(dòng)提供能量[12,20]。但是線粒體產(chǎn)生的ATP不能運(yùn)輸至整個(gè)鞭毛纖維,研究發(fā)現(xiàn),缺失線粒體氧化磷酸化反應(yīng)的小鼠精子依然具有受精能力,證明糖酵解過程產(chǎn)生ATP也同樣用于精子運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)[21],其中己糖激酶、乳酸脫氫酶和3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPD)是調(diào)節(jié)精子糖酵解活性的主要蛋白酶[22],綜合來看,精子中ATP由線粒體氧化磷酸化和糖酵解過程共同產(chǎn)生。

1.3 精子運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)分子

精子運(yùn)動(dòng)通過兩條重要的代謝途徑進(jìn)行調(diào)節(jié):Ca2+途徑和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)或環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)依賴性蛋白激酶途徑,這兩種途徑都涉及Ca2+、HCO3-、腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)和通道蛋白磷酸化[16]。哺乳動(dòng)物AC可分為可溶性AC(sAC)和跨膜AC(tmAC),通過在焦磷酸鹽存在下催化ATP分子內(nèi)環(huán)化為cAMP來調(diào)節(jié)細(xì)胞cAMP濃度[23-24]。

哺乳動(dòng)物精子中最常見的AC是sAC,它參與以cAMP為基礎(chǔ)的信號(hào)傳遞和鞭毛搏動(dòng)頻率的調(diào)節(jié)[25],Ca2+濃度增加會(huì)激活sAC,導(dǎo)致ATP轉(zhuǎn)化為cAMP,從而使cAMP濃度增加[26]。sAC基因失活會(huì)造成精子缺乏向前性運(yùn)動(dòng)能力,最終導(dǎo)致雄性不育[25]。sAC活化的主要調(diào)節(jié)器是HCO3-和Ca2+離子,其中HCO3-直接調(diào)節(jié)sAC的功能,而不影響tmAC活性[23]。tmAC通過G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCR)激活,通過cAMP依賴性蛋白磷酸化參與精子基礎(chǔ)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié),而sAC導(dǎo)致精子生成高濃度的cAMP,調(diào)節(jié)超激活運(yùn)動(dòng)。sAC在細(xì)胞過程中充當(dāng)ATP、CO2、pH、Ca2+和HCO3-離子的傳感器,調(diào)節(jié)精子細(xì)胞內(nèi)與cAMP相關(guān)的大多數(shù)信號(hào)通路[25,27]。精子處于HCO3-環(huán)境會(huì)增加進(jìn)入精子內(nèi)部的Ca2+,從而使鞭毛搏動(dòng)頻率增加,導(dǎo)致PKA激活,引起蛋白質(zhì)絲氨酸、蘇氨酸殘基和酪氨酸磷酸化加強(qiáng)[28]。所以Ca2+、ATP、pH及HCO3-均被認(rèn)為是精子運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[16]。

2 參與精子運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的離子通道

2.1 調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的Ca2+通道

精子離子通道主要受胞外的生理環(huán)境或生理因子調(diào)控,Ca2+是常見的參與細(xì)胞信號(hào)通路的次級(jí)信使,在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)中的作用已被廣泛研究。精子中Ca2+來源有兩種主要途徑:1)分布在精子頭部和線粒體鈣庫中Ca2+的釋放;2)通過特定的Ca2+通道進(jìn)入精子的Ca2+[29]。引起精子內(nèi)外Ca2+濃度發(fā)生變化的因素如下:1)Ca2+通道(CatSper)第四跨膜區(qū)域所帶正電荷的氨基酸殘基可以感受電壓的變化,精子膜發(fā)生去極化時(shí)通道激活;2)精子胞內(nèi)堿化激活Ca2+通道;3)CatSper通道受到孕酮、前列腺素、血清白蛋白和環(huán)核苷酸等生理性物質(zhì)激活[30-31]。不同濃度Ca2+對(duì)精子影響不同,相對(duì)較低的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(10～40 nmol·L-1)誘導(dǎo)精子鞭毛的對(duì)稱和線性跳動(dòng),相對(duì)較高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(100～300 nmol·L-1)通過誘導(dǎo)蛋白酪氨酸磷酸化誘導(dǎo)精子運(yùn)動(dòng)過度激活[32],而當(dāng)Ca2+濃度過高(5～10 μmol·L-1)時(shí),通過減少蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化來抑制精子基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng),例如研究發(fā)現(xiàn),山羊附睪尾精子中Ca2+濃度為10 μmol·L-1時(shí)基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng),而濃度大于10 μmol·L-1則抑制了運(yùn)動(dòng)能力[33],人類精漿中Ca2+濃度達(dá)到11 mmol·L-1時(shí)精子運(yùn)動(dòng)被抑制[34]。

在精子中,鈣調(diào)節(jié)蛋白(calcium-modulated protein,CaM)作為鞭毛軸突中的主要鈣受體發(fā)揮作用,并調(diào)節(jié)鈣啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其與蛋白激酶、磷酸酶和sAC相互作用,調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)[10,35-36]。與Ca2+流入精子細(xì)胞有關(guān)的離子通道主要有兩種類型:精子的陽離子通道(CatSper)和儲(chǔ)存囊泡中的Ca2+通道(SOCC)[37]。Ca2+進(jìn)入精子內(nèi)也受質(zhì)膜Ca2+-ATP酶(PMCA)、Na+/Ca2+交換器和K+依賴性Na+/Ca2+交換器活性影響[38]。精子中與Ca2+相關(guān)的離子通道詳細(xì)描述見下文,功能和定位統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 與Ca2+相關(guān)的精子離子通道定位及功能Table 1 Localization and function of Ca2+-related sperm ion channels

2.1.1 CatSper通道 CatSper通道是與精子功能相關(guān)且研究的最廣泛的通道,是指Ca2+進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)Ca2+通過的特異性鈣離子通道,在精子趨熱性、趨化性、超激活和頂體反應(yīng)中具有重要功能[61]。CatSper是質(zhì)膜鈣離子通道,特異性表達(dá)于成熟精子,在人和小鼠中,主要定位于精子尾部主段[30]。CatSper在精子發(fā)生期間在睪丸中表達(dá),主要負(fù)責(zé)精子中的鈣信號(hào)傳遞[62]。研究表明,在人、小鼠、豬和馬等哺乳動(dòng)物精子中存在CatSper通道[51,63-66],有趣的是,在馬精子中,CatSper1亞單位富含組氨酸的pH傳感器區(qū)域的結(jié)構(gòu)存在物種差異性[66]。CatSper通道對(duì)pH[67]、Na+通道(EnaCs)[68]、Ca2+ATP酶、K+、電壓門控質(zhì)子通道(Hv1)[69]和HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體誘導(dǎo)的Ca2+變化敏感[70]。該通道介導(dǎo)Ca2+進(jìn)入精子受到多種生理因素的調(diào)節(jié),包括卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞分泌的孕酮、子宮內(nèi)膜分泌的前列腺素、環(huán)核苷酸,如cAMP和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、透明帶蛋白、輸卵管液中的牛血清白蛋白[71]。除Ca2+外,當(dāng)細(xì)胞外Ca2+濃度達(dá)到極限時(shí),CatSper通道還可促進(jìn)單價(jià)離子(如Na+和Cs+)和二價(jià)離子(如Ba2+)的通過[38,63]。CatSper通道激活導(dǎo)致細(xì)胞外液Ca2+進(jìn)入或內(nèi)部Ca2+庫釋放,精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加,精子鞭毛的形狀和搏動(dòng)方向發(fā)生變化,跳動(dòng)頻率增加導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)活性增加[72-73]。

CatSper通道復(fù)合體由4個(gè)α亞基(CatSper 1-4)和6個(gè)輔助亞基CatSperβ(beta)、CatSperγ(gamma)、CatSperδ(delta)、CatSperε(epsilon)、CatSperζ(zeta)以及EF手鈣結(jié)合域蛋白9(EF hand calcium-binding domain protein 9,EFCAB9)組成,其中α亞基包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1-TM6),形成兩個(gè)生理功能上不同的區(qū)域,即電壓傳感結(jié)構(gòu)域(VSD; TM1-4)和孔道形成結(jié)構(gòu)域(TM5-6), TM1-TM4通過短環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接,其中TM4即第4跨膜區(qū)段中含有帶正電荷的氨基酸殘基如賴氨酸/精氨酸作為電壓傳感器;TM5和TM6通過疏水的短環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接,該區(qū)域具有高度保守的同源序列([T]×[D]×[W]),能夠選擇性地允許Ca2+進(jìn)入。CatSper1的n端含有一個(gè)特定的富含組氨酸的區(qū)域,該區(qū)域參與pH對(duì)CatSper活性的調(diào)節(jié)(圖1a)[74]。研究發(fā)現(xiàn),與下層精子相比,向上游動(dòng)的精子中CatSper1的豐度更高[75];與野生型小鼠相比,CatSper1和CatSper2缺失小鼠的精子鞭毛彎曲幅度較小[76],證明CatSper1也參與精子游動(dòng)。靶向敲除小鼠精子CatSper3或CatSper4可阻止精子過度激活,但不影響其基本運(yùn)動(dòng),這表明CatSper在精子運(yùn)動(dòng)最后階段起作用[51]。

圖1 調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的Ca2+通道拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(基于文獻(xiàn)[74])Fig.1 Topology of Ca2+ channels regulating sperm motility (based on reference [74])

2.1.2 調(diào)控鈣庫的Ca2+通道(SOCC) SOCC是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)在拓?fù)浜臀锢斫Y(jié)構(gòu)上密切關(guān)聯(lián)的質(zhì)膜通道,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+耗盡時(shí),細(xì)胞外Ca2+通過該通道內(nèi)流[77]。SOCCs是由ORAI1-3基因編碼的蛋白質(zhì)構(gòu)成,每個(gè)ORAI蛋白有4個(gè)TMs,TM2和TM3形成一個(gè)孔環(huán)?；|(zhì)相互作用分子(STIM1)和ORAI相互作用激活該通道,并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+,Ca2+與其結(jié)合域(cell-binding domain,CBD)結(jié)合導(dǎo)致通道失活(圖1b)[74]。SOCCs參與調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng),信號(hào)級(jí)聯(lián)由5′AMP活化蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)磷酸化控制,抑制該通道會(huì)引起AMPK磷酸化減少,頂體反應(yīng)減弱,鞭毛不對(duì)稱搏動(dòng)減少,精子活力降低[78]。

2.1.3 電壓門控Ca2+通道(VGCC) VGCC是會(huì)因膜電位去極化而激活的膜離子通道[74],可以根據(jù)動(dòng)作電位去極化信號(hào)介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流。根據(jù)該通道的藥理和生理調(diào)節(jié)特性,VGCC可以分為4種,分別為L(zhǎng)型、T型、R型和P/Q型通道[79]。VGCC是由α1(由CACNA1基因編碼)、α2δ(CACNA2D)、β(CACNB)和γ(CACNG)亞單位組成的異多聚體。α1亞基的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域組成,每個(gè)結(jié)構(gòu)域由6個(gè)跨膜α螺旋(TM1-6)組成。TM4作為電壓傳感器,當(dāng)膜極性發(fā)生改變時(shí)引起構(gòu)象變化,打開孔環(huán)。TM5、TM6和P-loop形成一個(gè)孔環(huán),C端包含一個(gè)CBD,當(dāng)Ca2+與CBD結(jié)合或通過CaM時(shí)通道失活(圖1c)[74]。牛精子鞭毛中存在L型和T型VGCC,VGCC與孕酮誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性加強(qiáng)有關(guān),選擇性阻斷這些通道大大降低了精子的運(yùn)動(dòng)性,單獨(dú)或聯(lián)合阻斷兩個(gè)通道導(dǎo)致基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)減少[80]。重組ZP3蛋白通過L型和T型鈣通道在人類精子中誘導(dǎo)頂體反應(yīng)[52]。有趣的是,Garza-Lpez等[81]證明,L型VGCC孔隙區(qū)域中存在4種天冬氨酸,可確保人類精子細(xì)胞通道對(duì)Cd2+的敏感性和通透性。

2.1.4 瞬時(shí)受體電位通道(TRPV) 精子中的Ca2+流動(dòng)除了受CatSper通道活性調(diào)節(jié)外,也受TRPV通道影響。目前,已報(bào)道TRP基因型有30種,根據(jù)序列分為7組:香草素(TRPV)、褪黑素(TRPM)、經(jīng)典(TRPC)、錨蛋白(TRPA)、黏蛋白(TRPML)、多囊蛋白(TRPP)和TRP-無機(jī)械感受器電位C(TRPN)。TRPV是同源或異源四聚體,每個(gè)單體由6個(gè)跨膜α螺旋(transmembrane α helix,TM)組成,孔環(huán)由5～6個(gè)TM組成,孔環(huán)作用是選擇性通過陽離子和調(diào)節(jié)溫度激活通道。N端包含3～6個(gè)錨蛋白重復(fù)序列,這些通道可以與磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和CaM相互作用,從而調(diào)節(jié)通道活性。

TRPV通道對(duì)Ca2+濃度變化、溫度、化學(xué)物質(zhì)、pH、機(jī)械壓和滲透壓敏感,上述通道受體激活介導(dǎo)Ca2+流入細(xì)胞,增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量[82]。TRPV通道的信號(hào)級(jí)聯(lián)通過IP3途徑介導(dǎo),TRPVs有6種亞型:TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6。TRPV1～TRPV4蛋白對(duì)溫度敏感,對(duì)Ca2+幾乎沒有通透性,氨基酸序列同源性約40%～50%;TRPV5與TRPV6對(duì)溫度不敏感,具有很強(qiáng)的鈣通透性[83],氨基酸序列同源性為75%。TRPV通道活性隨pH降低而增加,并受細(xì)胞內(nèi)PIP2的調(diào)節(jié),雖然關(guān)于PIP2的作用存在許多爭(zhēng)議,但是其結(jié)合后確實(shí)增加了通道敏感性[84]。有研究報(bào)道公牛精子中存在TRPV1通道,阻斷或激活TRPV1可調(diào)節(jié)精子功能運(yùn)動(dòng)過度激活和頂體反應(yīng)[46]。Kumar等[85]證明,在TRPV4的藥理調(diào)節(jié)下,人類精子中存在從頭部到鞭毛的Ca2+波傳播。Hamano等[48]認(rèn)為,TRPV4熱敏特性在小鼠精子運(yùn)動(dòng)中有作用,TRPV4基因敲除小鼠的精子運(yùn)動(dòng)活性在高溫環(huán)境中低于對(duì)照組。

2.2 調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的pH通道

精子細(xì)胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)包括3個(gè)離子通道:HCO3-通道、Hv1通道和Na+/H+交換器(sodium/hydrogen exchanger,NHE)。HCO3-是pH調(diào)節(jié)系統(tǒng)的重要組成部分,是雌性生殖道(尤其在輸卵管)中的重要調(diào)節(jié)離子[86],當(dāng)HCO3-進(jìn)入精子細(xì)胞質(zhì)時(shí),伴隨著Cl-進(jìn)入,在獲能過程中起重要作用[87]。HCO3-的內(nèi)流刺激Ca2+流入精子,激活sAC和PKA和蛋白酪氨酸磷酸化,導(dǎo)致超激活運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)[88]。同時(shí),HCO3-的流入會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)堿化,導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生超極化反應(yīng)[89-90]。

HCO3-內(nèi)流主要通過Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體從精子中排出Na+來抵消,防止精子細(xì)胞內(nèi)堿化和超極化[91]。在獲能期間,HCO3-內(nèi)流同時(shí)受到碳酸酐酶和囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)體(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)離子通道的調(diào)節(jié)[89]。存在于精子鞭毛中的NHE是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH的另一種機(jī)制,缺乏NHE的小鼠不育,精子活力顯著減弱[91]。外界環(huán)境pH影響精子基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)和超激活運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié),在酸性pH條件下,由于Na+/K+-ATP酶活性降低,精子活力減弱;而堿性pH條件時(shí),Ca2+內(nèi)流增加,導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)活性增強(qiáng)[92]。

參與調(diào)節(jié)精子細(xì)胞內(nèi)pH的還有Hv1通道(VGHC)[69]。VGHC單體由4個(gè)TMs構(gòu)成,在經(jīng)典的電壓門控通道中包含VSD,VGHCs不存在形成孔環(huán)結(jié)構(gòu)的TM5-TM6。Boonamnaj和Sompornpisut[93]認(rèn)為,VGHC二聚體中C端尾部通過形成卷曲結(jié)構(gòu)相互作用,n端磷酸化位點(diǎn)可增強(qiáng)通道選擇性(圖2)。Hv1通道主要存在于精子鞭毛中,該通道誘導(dǎo)質(zhì)子(H+)快速、高效、單向地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外[94],導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)堿化[95]。分子和功能的研究表明,該通道位于哺乳動(dòng)物精子尾部主段,參與精子運(yùn)動(dòng)和超運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)[69]。由于該通道受到高濃度的鋅抑制,也可以通過去除鋅而激活,對(duì)精子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[96],如精子在附睪內(nèi)靜止就與高濃度的鋅有關(guān),前列腺液中鋅的濃度是附睪中鋅濃度的300倍,完全抑制了精子的運(yùn)動(dòng)[97]。射精后,雌性生殖道中的鋅被鋅結(jié)合蛋白和內(nèi)源性大麻素清除,導(dǎo)致Hv1通道激活,隨后精子運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)[98]。公牛精子鞭毛中有Hv1通道,特別是在主段部分,在公牛精子中,Hv1通道通過cAMP、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和CatSper通道之間的復(fù)雜相互作用來調(diào)節(jié)精子獲能、超激活運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)[58]。

圖2 精子電壓門控H+通道(VGHC)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(基于文獻(xiàn)[74])Fig.2 Topology of sperm voltage-gated H+ channel (VGHC) (based on reference [74])

Hv1通道定位于精子尾部主段,與雙側(cè)縱線內(nèi)的CatSper通道共同定位[99]。研究表明Hv1通道和CatSper之間存在功能上互作關(guān)系[100],Hv1通道沿精子鞭毛分布模式為CatSper選擇性激活和隨后的鞭毛旋轉(zhuǎn)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[101]。Hv1通道參與精子進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)、獲能和頂體反應(yīng)[102],Hv1通道阻斷導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的降低和孕酮誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)減弱[42]。此外,發(fā)現(xiàn)Hv1和CatSper通道參與NADPH氧化酶5(NADPH oxidase 5,Nox5)誘導(dǎo)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成[100]。Ca2+與NOX5的結(jié)合激活產(chǎn)生超氧離子(O2-),盡管高濃度的活性氧與精子活力呈負(fù)相關(guān),但一定水平的活性氧對(duì)于精子的正常功能是必要的[103-104]。

2.3 調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的電壓門控鈉通道(VGNCs,NaV)

電壓門控Na+通道(VGNCs)存在于精子膜中,在功能上與神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞中的通道相似,當(dāng)質(zhì)膜從超極化狀態(tài)轉(zhuǎn)為去極化時(shí),這些通道被激活(-70～-55 mV至0 mV),并向內(nèi)傳導(dǎo)Na+[105]。每個(gè)VGNC通道由1個(gè)α亞基構(gòu)成,α亞基包括4個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域(RD1-RD4),每個(gè)結(jié)構(gòu)域有6個(gè)TMs。TM1-TM4形成一個(gè)VSD,TM4充當(dāng)帶正電的傳感器。在去極化過程中,TM4向細(xì)胞外表面移動(dòng),構(gòu)象改變激活通道。Na+通過TM5和TM6之間形成的P-loop在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。RD3和RD4之間的細(xì)胞質(zhì)環(huán)包含1個(gè)基序(I×F×M序列),其代表疏水氨基酸三聯(lián)體,即異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。IFM基序作為由RD3和RD4之間的孔環(huán)形成的疏水鎖閂參與VGNC的失活(圖3)[74]。Pinto等[54]在2009年首次報(bào)道了人類精子中存在VGNCs通道,參與調(diào)節(jié)未獲能精子活動(dòng)以及精子獲能的初始階段,在初始階段之后,細(xì)胞膜超極化導(dǎo)致VGNCs通道失活,使用藜蘆堿激活VGNCs通道,從而導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)活性增加,而細(xì)胞內(nèi)Ca2+沒有增加。選擇性阻斷VGNCs通道導(dǎo)致精子數(shù)量減少,精子運(yùn)動(dòng)活性減弱[53]。VGNCs通道的激活通過酪氨酸蛋白的磷酸化誘導(dǎo)獲能[57],在獲能過程中,由于細(xì)胞內(nèi)K+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Na+的短暫減少,精子出現(xiàn)超極化[106]。

圖3 精子電壓門控Na+通道(VGNC)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(基于文獻(xiàn)[74])Fig.3 Topology of sperm voltage-gated Na+ channel (VGNC) (based on reference [74])

2.4 調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的鉀離子(K+)通道

精子開始獲能以膜超極化為特征,主要是由于K+通道激活引起[107]。在非獲能精子中,膜電位范圍為-35～-45 mV,在獲能期間,精子膜超極化,電位差為-80 mV。分子和功能研究表明,生精細(xì)胞和精子細(xì)胞含有電壓門控K+通道、Ca2+激活的K+通道和向內(nèi)運(yùn)輸K+通道[108]。獲能前,細(xì)胞內(nèi)pH呈酸性,K+通道不活躍,去極化狀態(tài)保持不變,獲能期間,HCO3-內(nèi)流和H+流出,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)堿化、pH增加和ATP依賴性K+通道激活,這些反應(yīng)導(dǎo)致K+離子外流,細(xì)胞膜超極化[30,109]。有趣的是,NaV通道和ENaC、Na+內(nèi)流有關(guān),導(dǎo)致非獲能精子膜去極化,當(dāng)這些通道在獲能過程中閉合時(shí),膜發(fā)生超極化。總之,K+通道和Na+通道都參與調(diào)節(jié)獲能期間發(fā)生的膜極化過程,非獲能時(shí),K+通道不活躍,Na+通道活躍,導(dǎo)致膜去極化,獲能期間通道活性相反。

公牛精子中存在K+通道,參與基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)和超激活運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。蛋白免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果證明,K+通道位于公牛精子的頭部、頸部和尾部主段[110]。K+通道的功能依賴于Hv1和CatSper通道的功能,選擇性阻斷這些通道時(shí)會(huì)影響K+通道活性[11,59]。SLO1和SLO3通道是Ca2+激活的K+通道,其作用是調(diào)節(jié)精子細(xì)胞內(nèi)的滲透壓和電壓(Vm)[111],它們被膜去極化、[Ca2+]i和[Mg2+]i[112]激活,兩個(gè)通道都是由4個(gè)成孔α亞基和輔助亞基形成。α亞基由7個(gè)單體組成,每個(gè)單體包括6個(gè)TMs,其中TM4是典型的VSD,TM5和TM6之間形成孔環(huán)。N端尾部處于細(xì)胞外,包含K+電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子1 (RCK1)和K+電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子2 (RKC2)。SLO1和SLO3的結(jié)構(gòu)差異在于SLO1的RKC結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在“Ca2+碗”結(jié)構(gòu),導(dǎo)致通道對(duì)[Ca2+]i更敏感(圖4a)[74]。SLO3是精子中主要K+通道蛋白,負(fù)責(zé)K+流出,從而啟動(dòng)細(xì)胞膜超極化。SLO3蛋白被細(xì)胞內(nèi)堿性pH激活較弱,與HCO3-的內(nèi)流相關(guān),并導(dǎo)致精子獲能前K+外排[112],被Ca2+激活更強(qiáng)烈,因此Vm受[Ca2+]i的調(diào)節(jié)比受pHi的調(diào)節(jié)更強(qiáng)烈。孕酮通過CatSper誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流受到SLO3調(diào)控的Ca2+超極化的限制,在人類精子所處環(huán)境存在孕酮時(shí),細(xì)胞外K+離子濃度的增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加[113]。值得注意的是,有研究表明小鼠SLO3通道對(duì)PIP2具有高親和力,PIP2與SLO3的結(jié)合上調(diào)了通道的活性,而電壓敏感磷酸酶(voltage-sensitive phosphatase,VSP)對(duì)PIP2的去磷酸化使SLO3活性降低[114]。由于缺乏膜超極化,SLO3通道缺陷的小鼠精子運(yùn)動(dòng)能力降低,導(dǎo)致這些精子在體外條件下無法受精[115]。

圖4 精子SOL1通道和CACC通道拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(基于文獻(xiàn)[74])Fig.4 Topological structure of sperm SOL1 channel and CACC channel (based on reference [74])

2.5 調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)的氯離子(Cl-)通道

Cl-通道通過膜超極化、細(xì)胞內(nèi)堿化和cAMP/PKA誘導(dǎo)的蛋白磷酸化信號(hào)機(jī)制參與調(diào)節(jié)精子獲能過程[116]。研究表明,存在CFTR離子通道、鈣激活氯通道(CACC)和CIC-3通道[76,117]。CFTR通道的功能涉及精子獲能和超激活過程中HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)依賴過程的調(diào)節(jié)[118]。選擇性阻斷CFTR通道可減少HCO3-內(nèi)流,從而抑制cAMP/PKA通路活性,減少精子運(yùn)動(dòng)活性,而在人類精子中,CFTR在獲能時(shí)可以從細(xì)胞中排出Cl-[119]。CACC由10個(gè)TMs和胞質(zhì)N端、C端組成,每個(gè)亞基中的3～7個(gè)TMs形成孔環(huán)結(jié)構(gòu),Vm和低濃度Ca2+(<600 nmol·L-1)通過TM2-TM3環(huán)中的EEEEEAVK激活通道(見圖4b)[74]。2012年,Orta等[17]使用膜片鉗技術(shù)證明人類精子頭部存在CACC,該離子通道開放受[Ca2+]i濃度增加的刺激,這取決于細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放或通過質(zhì)膜通道的內(nèi)流。ClC-3通道激活產(chǎn)生向外的Cl-電流,這些電流被PKC激活所抑制[120-121]。氯離子通道在調(diào)節(jié)精子體積和運(yùn)動(dòng)中起著重要作用,與正常精子相比,弱精子(精子運(yùn)動(dòng)能力低)動(dòng)物的精子顯示出較小的細(xì)胞體積調(diào)節(jié)能力和運(yùn)動(dòng)活性[122]。

3 總結(jié)與展望

在精子發(fā)生過程的不同階段,已經(jīng)研究證明離子通道發(fā)揮著重要的生理作用,如SLO3通道是精子特異性性KSper通道,能夠調(diào)控精子的膜電位,在精子超極化過程中起決定性作用。CatSper是哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞膜上實(shí)現(xiàn)精子超激活的最重要Ca2+通道,通過維持、調(diào)控Ca2+信號(hào)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)和受精功能起著關(guān)鍵作用,該通道對(duì)弱電壓依賴、Ca2+特異、pH敏感,會(huì)受到pH、膜電位、類固醇激素等多種生理刺激物的影響。除過上述具有重要功能的KSper和CatSper通道外,精子膜還存在 Na+、K+、H+和Cl-等離子通道,其活性均受到離子泵(如細(xì)胞質(zhì)膜Ca2+-ATPase、Na+/K+-ATPase等)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如Na+/Ca2+交換器、Na+/H+交換器和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的影響,進(jìn)一步調(diào)節(jié)精子成熟、獲能、頂體反應(yīng)等一系列生理過程。本文總結(jié)了目前報(bào)道的全部精子離子通道,其相互作用機(jī)制見圖5。

圖5 參與精子基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)、獲能和頂體反應(yīng)過程的離子通道[88]Fig.5 Ion channels involved in sperm basal motility, capacitation and acrosome reactions[88]

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等學(xué)科技術(shù)的發(fā)展,精子生理學(xué)研究也將會(huì)快速發(fā)展,精子運(yùn)動(dòng)離子通道的研究將會(huì)更加深入。哺乳動(dòng)物精子運(yùn)動(dòng)是一種自然現(xiàn)象,運(yùn)動(dòng)調(diào)控是復(fù)雜的,離子通道是精子膜發(fā)揮功能的直接調(diào)控基礎(chǔ),會(huì)隨精子內(nèi)代謝和運(yùn)動(dòng)快速做出反應(yīng)。相信隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展,尤其是交叉學(xué)科的融合發(fā)展,新技術(shù)和新方法不斷出現(xiàn),精子運(yùn)動(dòng)與離子通道調(diào)控機(jī)制的研究將愈來愈深入,不僅在科學(xué)問題研究方面,在生產(chǎn)應(yīng)用方面將會(huì)有更大的突破。未來精子運(yùn)動(dòng)和離子通道研究可以從以下幾方面著手:1)X精子與Y精子運(yùn)動(dòng)差異與離子通道關(guān)系研究,利用離子通道技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物性別控制技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用研究;2)不同物種動(dòng)物精子離子通道差異與調(diào)控研究;3)精子離子通道與精子獲能、精子激活與受精機(jī)制研究;4)精子離子通道活性物質(zhì)、干擾物的篩選和生產(chǎn)應(yīng)用研究;5)精子離子通道對(duì)精子糖酵解、能量代謝影響研究;6)雌性動(dòng)物生殖道環(huán)境離子種類和濃度的變化對(duì)精子運(yùn)動(dòng)影響及調(diào)節(jié)研究;7)不同動(dòng)物調(diào)節(jié)精子pHi的sNHE變體種類及調(diào)節(jié)機(jī)制研究;8)在體外和體內(nèi)環(huán)境條件下,精子運(yùn)動(dòng)和受精時(shí)參與的離子通道是否相同?如何調(diào)控?9)精子離子通道電化學(xué)調(diào)控與生物學(xué)意義研究;10)精子離子泵、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與膜蛋白離子通道互作調(diào)控研究;11)精子離子通道與參與信號(hào)通路的調(diào)控研究;12)精子離子通道的激素調(diào)控與互作研究等。更深層次研究離子通道在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)、獲能和頂體反應(yīng)中的作用,挖掘參與精子功能調(diào)節(jié)的離子通道并了解其作用機(jī)制,為后續(xù)研究精子膜結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)活性調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。