除草劑對花生生理特性的影響

蔣春艷，洪鵬翔，張雙照，李春維，周美玲，李建彬，江巍

（1龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建龍巖 364000；2福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院，福州 350002）

0 引言

除草劑是所有農(nóng)藥中的一個重要的組成成分，施用除草劑可使糧食增產(chǎn)10%以上，國際上常將除草劑在農(nóng)藥中所占的比例作為衡量國家農(nóng)藥市場的一個重要標(biāo)準(zhǔn)[1]。除了防控雜草的危害，除草劑在一定程度上也會影響農(nóng)作物的生長，往往會出現(xiàn)農(nóng)作物生理及生長不正常的現(xiàn)象，如葉片褪綠、植株矮化等，這也是廣泛意義上的除草劑藥害[2]。在花生生產(chǎn)中，農(nóng)民缺乏除草劑使用知識和經(jīng)驗，為了盡早看到藥效，經(jīng)常用藥過量，從而更容易導(dǎo)致除草劑藥害的發(fā)生[3]，一般情況下對花生的產(chǎn)量和品質(zhì)影響不大；但藥害嚴(yán)重且不可恢復(fù)時對花生產(chǎn)量影響較大，甚至?xí)斐山^產(chǎn)[4]。

作物出現(xiàn)除草劑藥害后，往往會影響某些生理指標(biāo)發(fā)生一系列變化，如酶活性和丙二醛含量等?；酋ｋ孱?、咪唑啉酮類、三唑嘧啶磺酰胺、嘧啶醚類等除草劑作用靶標(biāo)為乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)，在植物體內(nèi)主要催化亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸生物合成的第一階段[5]，ALS活性受抑制后，植物體內(nèi)支鏈氨基酸合成受阻，進而影響蛋白質(zhì)合成，造成植物細(xì)胞分裂與生長停滯[6]。過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)是生物體內(nèi)重要的保護酶，POD 存在于動植物體的細(xì)胞中，是一類以電子受體為過氧化氫的氧化還原酶，可以通過消除毒性物質(zhì)和過氧化氫對細(xì)胞起到保護的作用[7]。CAT 是一種重要的機體保護酶，在生物演化的過程中可通過催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解而防止其過氧化，從而起到防御作用[7]。MDA是膜脂過氧化過程中的分解產(chǎn)物，表示膜脂過氧化程度和對逆境的反應(yīng)，MDA含量越高損傷越大[8]。范志金等[9]研究了單嘧磺隆對玉米ALS 酶活性的影響，表明低濃度的單嘧磺隆對ALS酶無抑制作用，高濃度則具有抑制作用；楊濤等[10]研究了樂果脅迫對菠菜葉片中CAT、POD 活性影響，結(jié)果顯示噴施樂果能夠增加菠菜葉片中CAT、POD活性；張清智等[8]研究了氰戊菊酯脅迫對小白菜抗氧化酶活性的影響，結(jié)果顯示施用不同濃度氰戊菊酯時小白菜體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性明顯受到抑制，MDA含量顯著增加，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；侯文煥等[11]研究了除草劑殘留對菜用黃麻幼苗生理特性的影響，表明噴施不同濃度除草劑后，2 個菜用黃麻品種幼苗葉片的MDA含量、POD和CAT活性均高于對照；王雅情等[12]研究了除草劑使它隆不同兌水量對谷子生理生化指標(biāo)的影響，使它隆處理初期谷子葉片的POD和CAT活性呈先升高后降低趨勢，且均高于對照；王玉琴等[13]研究了“清橐1 號”復(fù)配除草劑防除黃帚橐吾生理特性，結(jié)果顯示隨著施藥時間的推移，MDA 含量顯著增加，抗氧化酶活性均呈先升高后降低趨勢。錢蘭娟等[14]研究表明，炔草酯可提高小麥幼苗期葉片的MDA 含量及POD 活性；丁超等[15]研究表明3 種除草劑均可使高粱的POD活性以及MDA含量升高；王正貴等[16]研究了5種常用除草劑對小麥生理生化特性的影響，結(jié)果表明POD和CAT活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢；葉亞新等[17]研究了除草劑對蘿卜幼苗逆境生理指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示隨著除草劑濃度升高和脅迫時間的延長，蘿卜幼苗MDA含量和POD活性都先上升后下降。

為了解施用除草劑出現(xiàn)藥害癥狀后是否會對花生植株生理特性產(chǎn)生影響，本研究測定了施用丁草胺和草甘膦異丙胺鹽后花生體內(nèi)ALS、CAT和POD的活性和MDA的含量，對其變化情況進行了研究，并探討除草劑與花生之間相互作用機理，旨在為尋找此類除草劑藥害修復(fù)方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料所選花生品種為‘龍花172’（龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育），試驗于龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保室大棚內(nèi)進行，播種前土壤未噴施任何藥劑，棚內(nèi)溫度白天(28±2)℃、夜間(22±2)℃，相對濕度75%±5%，在花生3片復(fù)葉時進行除草劑噴霧處理。

1.1.2 供試藥劑及試劑50%丁草胺乳油（杭州穎泰生物科技有限公司），41%草甘膦異丙胺鹽（江蘇好收成韋恩農(nóng)化股份有限公司），ALS、CAT、POD試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司）和MDA試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），均采購于正規(guī)銷售代理公司。

1.1.3 試驗儀器EPOCH2 型酶標(biāo)定量測定儀（美國伯騰儀器有限公司），F(xiàn)570型超低溫冰箱（德國艾本德有限公司），scientz-IID 型超聲波細(xì)胞破碎器（新芝公司），AF103AS型制冰機（斯科茨曼制冰系統(tǒng)（上海）有限公司），TGL-16gR 型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），UPT-II-20T 型超純水系統(tǒng)（上海優(yōu)普公司），UV-5200 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

2 種除草劑均設(shè)置5 個濃度（編號為濃度1～濃度5），丁草胺乳油分別為2.55、5.10、10.20、20.40、40.80 L/hm2，草甘膦異丙胺鹽水劑分別為3.00、6.00、12.00、24.00、48.00 mL/hm2，兌水至750 L/hm2，于花生3 片復(fù)葉時莖葉噴霧，以清水噴霧的植株作為對照。藥后5、10、15、20 d分別拔出植株進行酶（ALS、CAT和POD）活性和MDA含量測定，測定方法步驟按照試劑盒使用說明進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；使用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析和Tukey 法多重比較進行差異顯著性分析，利用Excel 2007和WPS做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種除草劑對花生ALS活性影響

由圖1 可得出，2 種除草劑各濃度處理花生植株后，20 d 內(nèi)ALS 活性出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，同一濃度在不同時間測得的ALS活性差異顯著，20 d時活性達最低值，與對照一致。從圖1A中可見，使用丁草胺各濃度處理后，濃度4 和濃度5 處理后5 d ALS 活性(395.87、399.10 U/L)和10 d ALS 活性(474.52、480.19 U/L)都顯著高于對照，濃度5 處理活性高于濃度4 處理，15 d 時ALS 活性下降，分別為444.52、440.48 U/L，濃度5 處理活性低于濃度4 處理，顯著低于對照(534.73 U/L)，到處理20 d時還是顯著低于對照(P＜0.05)；其余各濃度處理對花生ALS 活性基本沒有影響，與對照差異不顯著或略低于對照。

圖1 除草劑處理后花生植株ALS活性變化

使用草甘膦異丙胺鹽各濃度處理后10 d 內(nèi)，濃度3、濃度4和濃度5的ALS活性顯著高于對照，與對照相比15 d時出現(xiàn)下降趨勢且顯著低于對照(534.73 U/L)，分別為494.76、449.38、459.92 U/L，20 d時ALS活性出現(xiàn)上升接近對照(237.35 U/L)，分別為230.13、222.90、213.29 U/L；20 d 內(nèi)濃度1 處理與對照始終保持一致，差異不顯著，濃度2 出現(xiàn)小幅波動，先升高再降低，到15和20 d時與對照無顯著差異（圖1B）。

2.2 2種除草劑對花生CAT活性影響

如圖2 所示，20 d 內(nèi)CAT 活性總的變化規(guī)律為先升高后降低，同一濃度在不同時間測得的CAT活性與對照變化規(guī)律一致，5 d 為CAT 活性最低值，15 d 活性達最高值。從圖2A可得出，丁草胺對花生植株的CAT活性影響不大，各濃度處理后10 d內(nèi)與對照保持一致，差異不顯著；所有濃度處理15 d后CAT活性值與對照相比都出現(xiàn)下降，除濃度5處理顯著低于對照外，其余處理與對照差異不顯著；20 d時所有濃度處理CAT活性值接近對照，濃度5 處理(41.86 U/L)顯著高于對照(36.97 U/L)，其余處理與對照保持一致。

圖2 除草劑處理后花生植株CAT活性變化

草甘膦異丙胺鹽對花生植株的CAT 活性影響見圖2B，濃度5在20 d內(nèi)CAT活性（分別為29.83、41.29、54.17、43.68 U/L）始終高于對照（分別為27.75、37.44、51.24、36.97 U/L）；濃度4 在處理5 d 后與對照差異不顯著，10 d后出現(xiàn)上升，一直持續(xù)到20 d都顯著高于對照；濃度1、濃度2和濃度3在處理后5 d與對照持平或低于對照，10 d 開始與對照相比處于下降直到20 d 才恢復(fù)至對照，與對照無顯著差異或高于對照。

2.3 2種除草劑對花生POD活性影響

2 種除草劑處理花生植株后20 d 內(nèi)，POD 活性總體變化規(guī)律為先升高再降低，15 d達最高（圖3），與對照變化趨勢保持一致。從圖3A可得出，除草劑丁草胺處理花生植株后，濃度4和濃度5在處理5 d時POD活性顯著低于對照，10 d 時與對照一致，15～20 d 時與對照相比顯著升高；其余濃度處理15 d 后與對照持平，20 d 時相比對照POD 活性出現(xiàn)上升，顯著高于對照(P＜0.05)。

圖3 除草劑處理后花生植株P(guān)OD活性變化

草甘膦異丙胺鹽處理花生后POD 活性變化如圖3B。處理10 d后，除濃度1處理與對照一致外，其余濃度處理POD 活性值都低于對照；處理15 d 后，所有濃度處理POD 活性都升高達到20 d 內(nèi)最大值，分別為255.57、253.81、245.02、269.63、265.76 U/L，且顯著高于對照的237.77 U/L；處理20 d后，各處理POD活性值下降，濃度1和濃度2處理POD活性(218.32、224.63 U/L)顯著高于對照(210.92 U/L)，濃度3、濃度4 和濃度5 處理低于對照，但差異不顯著。

2.4 2種除草劑對花生MDA含量影響

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量可作為植物受到脅迫時的標(biāo)記物。由圖4A可知，使用丁草胺可引起花生植株MDA含量增加，各濃度在處理20 d后均高于對照，不同濃度處理在相同天數(shù)時隨著濃度的增加MDA 含量升高。藥后5 d，除濃度1 處理和濃度2處理MDA含量與對照差異不顯著外，其余濃度處理顯著高于對照(P＜0.05)，其中濃度5 處理MDA 含量為對照組的1.42 倍；各濃度處理20 d 后MDA 含量有所下降，仍顯著高于對照（除濃度1處理外）。

圖4 除草劑處理后花生植株MDA含量變化

如圖4B 所示，草甘膦異丙胺鹽處理花生后MDA含量呈波動性變化，所有濃度處理10 d 內(nèi)MDA 含量都高于對照，在10 d時上升到最大值，濃度4、5處理分別為393.28、397.58 nmol(g·FW)，顯著高于對照(P＜0.05)，隨后下降，藥后15 d 時濃度4、5 降至對照水平，其余處理顯著低于對照，藥后20 d 濃度4、5 繼續(xù)下降達最低值，其余濃度處理與對照保持一致。噴藥相同天數(shù)時，濃度1、2、3處理間差異不顯著，處理10 d內(nèi)與對照持平，濃度4、5 顯著高于對照。丁草胺和草甘膦異丙胺鹽處理濃度相同時，隨處理后天數(shù)增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，基本與對照一致。結(jié)果顯示，花生MDA含量的變化不僅受濃度的影響，除草劑種類也對其產(chǎn)生影響，同一種除草劑高濃度對花生MDA 含量影響較大。

3 結(jié)論

常用除草劑丁草胺和草甘膦異丙胺鹽對花生植株生長方面存在不同程度的影響。測定2種除草劑不同濃度處理后花生體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶(ALS)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)酶活性以及丙二醛(MDA)含量，結(jié)果表明處理濃度對花生植株影響呈正相關(guān)，高濃度處理對花生的生長脅迫作用最明顯。與對照處理相比，2種除草劑濃度4和5處理后ALS活性先升高后降低；丁草胺濃度5 處理15 d 時CAT 活性顯著低于對照，而后有所上升，甘膦異丙胺鹽濃度5在處理20 d 內(nèi)CAT 活性均顯著高于對照；丁草胺濃度4 和5處理花生植株后，POD活性先降低后升高，草甘膦異丙胺鹽各濃度處理后POD 活性先升高后降低，處理15 d時達最大值；丁草胺處理后MDA含量20 d內(nèi)均高于對照，草甘膦異丙胺鹽處理后MDA 含量先升高后降低。由此分析得出花生植株受到除草劑脅迫時做出了不同防御響應(yīng)，以維持植株正常生理功能。

4 討論

使用除草劑給作物帶來了不適宜的生長環(huán)境[18]。植物體內(nèi)靶標(biāo)酶、保護酶活性和丙二醛含量等在逆境脅迫下會發(fā)生相應(yīng)變化，目前已把這種變化量作為評價逆境傷害程度和植物適應(yīng)性的指標(biāo)而廣泛應(yīng)用。相關(guān)研究表明，在除草劑脅迫下植物體內(nèi)乙酰乳酸合成酶(ALS)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)酶活性以及丙二醛(MDA)含量等會發(fā)生相應(yīng)變化來應(yīng)對脅迫[19-20]。乙酰乳酸合成酶(ALS)的活性受到抑制時，干擾生理代謝，破壞蛋白質(zhì)合成，使植物細(xì)胞有絲分裂停止，造成生長停滯，最終導(dǎo)致植株死亡[21]。在逆境的脅迫下，一些植物能夠激活體內(nèi)的抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)，清除受到逆境脅迫而產(chǎn)生的自由基和過氧化物，防止膜脂過氧化，為了保護自身，植物在進化過程中形成了一系列清除自由基的酶，這些酶被統(tǒng)稱為抗氧化酶[4]，過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)屬于已知的抗氧化酶[22]。植物在遭受逆境脅迫時，首先是植物的細(xì)胞膜遭到破壞[13]，會產(chǎn)生丙二醛(MDA)與活性氧發(fā)生過氧化反應(yīng)來保護細(xì)胞膜[13]，MDA 含量越高，其產(chǎn)生的活性氧自由基越多，膜脂過氧化反應(yīng)越大，對細(xì)胞膜的傷害越大[23]。

高劑量的除草劑使用后會對當(dāng)茬及后茬作物造成明顯藥害，同時也會對其生理生化指標(biāo)產(chǎn)生明顯影響[24]。本試驗中，藥劑處理花生后，低濃度對花生植株ALS 活性基本沒有影響，處理后20 d 內(nèi)與對照持平，這可能是植株可以通過自身調(diào)控使其達到平衡；高濃度處理（濃度4和濃度5）對花生植株的影響較大，處理后10 d內(nèi)都處在ALS活性大幅升高的狀態(tài)，這可能是植株受到高濃度除草劑的侵入使機體生理代謝平衡遭破壞，蛋白質(zhì)不能正常合成，從而激發(fā)體內(nèi)ALS合成，ALS活性迅速增加，來平衡生理代謝以減輕藥物的侵害，到15 d時，由于植株吸收到大量除草劑生理代謝減弱，ALS 合成受阻導(dǎo)致活性下降，20 d 時ALS 活性上升，與對照差距縮小。使用丁草胺各濃度處理后，只對最高濃度5 處理的CAT 活性影響較大，能使其活性增加，這可能是除草劑濃度太高使其機體抵抗激烈，導(dǎo)致CAT活性始終處于一種高水平，以減輕藥劑對它的傷害，其余處理濃度對植株還不足以達到促使此類酶活性發(fā)生較大變化，機體能正常運轉(zhuǎn)；使用草甘膦異丙胺鹽各濃度處理后，對花生都能產(chǎn)生一定的影響，植株受到低濃度草甘膦異丙胺鹽侵入后，CAT活性受到抑制先出現(xiàn)下降，后能恢復(fù)正常生長使其活性能恢復(fù)至對照水平；高濃度5 處理使花生植株CAT 活性始終處于較高水平，說明植株啟動免疫系統(tǒng)抵抗除草劑入侵導(dǎo)致正常生長的恢復(fù)能力弱。除草劑丁草胺處理花生植株后，濃度4 和濃度5 在處理5 d 時POD 活性降低，可能是受到大劑量藥劑侵入后，機體還不能立刻產(chǎn)生有力的抵抗，使保護酶POD合成受阻，隨著時間的增加，機體增強POD合成來抵抗除草劑的入侵，所以10 d時POD活性增強至對照水平，高濃度處理植株恢復(fù)能力較弱，使其20 d 時POD 活性還處于較高值；草甘膦異丙胺鹽處理花生植株后，各濃度5 d時由于剛受到藥劑入侵，POD 合成受阻低于對照，10 d 時高劑量處理仍然處于降低狀態(tài)，處理15 d后開始恢復(fù)正常生長。噴施2種除草劑后，增加了花生植株體內(nèi)的活性氧，導(dǎo)致MDA含量增加，促進了花生葉片膜脂過氧化作用。丁草胺各濃度處理MDA含量在20 d內(nèi)始終維持在高于對照狀態(tài)，說植株一直受到藥劑的傷害，促使葉片MDA含量增加以保護花生植株不受丁草胺侵害[11]；草甘膦異丙胺鹽濃度1、2、3 處理后對MDA 含量影響不是特別明顯，濃度4、濃度5在處理后10 d內(nèi)MDA含量一直處于高位，以保護植株不受除草劑傷害，處理15 d后出現(xiàn)下降，說明除草劑脅迫促進了細(xì)胞的膜脂過氧化作用，植株受到更進一步的傷害，MDA 含量無法增加，呈下降趨勢。

噴施不同濃度丁草胺和草甘膦異丙胺鹽對花生的ALS、CAT、POD 活性和MDA 含量都造成了不同程度的影響，高濃度處理短時間內(nèi)很難恢復(fù)至對照水平。因此，合理使用除草劑對花生的安全生產(chǎn)至關(guān)重要，本研究對農(nóng)作物安全生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義，至于除草劑對其產(chǎn)量方面的影響還有待進一步研究。