酢漿草屬植物組織培養(yǎng)技術研究進展

江杰，李娜，王建強，張思思，章曉琴

（武漢市園林科學研究院，武漢 430081）

0 引言

酢漿草是酢漿草科酢漿草屬的多年生草本植物[1]。酢漿草屬植物主要分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，國內各地均廣泛分布[2]，目前有800余種，主要有酢漿草(Oxalis corniculata)、三角紫葉酢漿草(O.triangliaris)、紅花酢漿草(O. corymbosa)、黃花酢漿草(O.pes-caprae)、鈍葉酢漿草(O.obtusa)、大花酢漿草(O.bowiei)、山酢漿草(O.acetosella)等[3]。作為優(yōu)良的地被植物，適宜粗放管理，耐病蟲害[4]，在園林景觀中得以廣泛應用，同時可以盆栽在家庭園藝中觀賞[5]。酢漿草含有黃酮類、酚類、苯丙素類、萜類以及單糖類化合物[6]，其體外抑菌作用及抗炎功效證明全草均可入藥[7]?，F代醫(yī)藥研究表明，酢漿草具有保肝、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化等功效[8]，在醫(yī)藥上具有較高的潛在開發(fā)和應用價值[9]。

酢漿草多采用鱗莖或球莖繁殖，受繁殖季節(jié)和自然環(huán)境影響較大，且存在著繁殖速度慢、效率低等情況[10]。此外病毒易在鱗莖或球莖中逐年積累導致開花減少、花瓣變小[11]。酢漿草的果實為蒴果，自然結實率較低，利用種子繁殖周期長，難以滿足市場化需求[12]。

組織培養(yǎng)技術因可人工控制生長條件，不受地區(qū)、季節(jié)和氣候環(huán)境的限制，具有繁殖速度快、可連續(xù)生產等優(yōu)點。筆者對酢漿草屬植物組織培養(yǎng)技術研究進展進行總結，以期為酢漿草屬植物的進一步研究提供參考。

1 外植體

1.1 再生體系的選擇

酢漿草屬植物再生體系的建立有器官發(fā)生途徑和體細胞胚再生途徑。體細胞胚再生途徑是指體細胞胚經歷與合子胚相似的階段，形成兩極性的體細胞胚，然后形成完整的植株。由于體細胞胚誘導對材料培養(yǎng)環(huán)境要求較高，誘導畸形胚發(fā)生率高[13]，該途徑在酢漿草組培中使用較少，李耀亭等[14]曾對三角紫葉酢漿草誘導愈傷組織和體細胞胚分化獲得再生苗。

目前，通過器官發(fā)生途徑獲得組培苗是常用的組培方法，在酢漿草中即為由離體器官產生不定芽和根，從而生長為完整植株。器官發(fā)生途徑又可分為直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑，區(qū)別在于，前者無需形成愈傷組織，由外植體直接產生不定芽和根，如鱗莖、莖段等；后者發(fā)生需由外植體如葉片、葉柄等脫分化形成愈傷組織，再分化出芽和根，最終形成完整植株。

1.2 外植體的選擇

選擇適合的外植體是建立組織培養(yǎng)體系的第一步。對近20年來的研究結果總結發(fā)現，酢漿草屬植物組培較多選擇葉片、葉柄、鱗莖、莖段等作為外植體。酢漿草的葉片、葉柄是較為常用的外植體材料[15]。耿開友等[16]以葉柄為外植體出芽率達75%。李霖等[17]以葉柄成功地培養(yǎng)出小苗，出芽率均達到了90%。胡國富等[18]對比發(fā)現葉片為最佳外植體，誘導率為93.3%。宋滿坡等[19]使用葉片和葉柄為外植體，誘導率最高為86.3%。張興桃等[20]使用葉片作為外植體時，出芽率最高達95%。蔡麗瓊等[21]的研究表明，紫葉酢漿草的葉片比葉柄更容易分化出不定芽，是最適宜的外植體。高貴珍等[22]研究發(fā)現，與葉柄相比，三角紫葉酢漿草葉片作為外植體，愈傷組織形成和芽的分化較早、誘導率更高、形成的芽更多。王金剛等[23]以大花酢漿草鱗莖作為外植體材料進行組織培養(yǎng)，誘導率達到了80%。鄧小梅等[24]以三角紫葉酢漿草地下鱗莖為外植體材料，但認為污垢相對比較多、無菌材料較難獲得。

1.3 外植體處理和滅菌

外植體滅菌是組培成功的關鍵，針對不同外植體及其幼嫩程度需要選擇不同的滅菌方式。通常情況下，清水洗凈后先用75%酒精，再用0.1%HgCl2或3%NaClO分2步進行滅菌[25]。由于各種消毒劑對外植體都有著不同程度的傷害，必須對滅菌時間嚴格把控，酒精處理在1 min以內，NaClO、0.1%HgCl2等消毒劑的處理時間控制在3～8 min 最佳，具體處理時間根據外植體選材而定，處理完畢接種前需用無菌水沖洗干凈[26]。具有代表性的滅菌方式匯總情況見表1。

表1 酢漿草屬植物不同外植體常用消毒方法

2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

2.1 基本培養(yǎng)基

組培實驗中常用的培養(yǎng)基類型有MS、1/2MS、White、B5、N6培養(yǎng)基等。其中，B5培養(yǎng)基銨含量較低，適合部分植物愈傷組織和細胞懸浮物的培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基無機鹽含量較低，適合禾本科植物的花藥和花粉培養(yǎng)；MS 培養(yǎng)基無機鹽濃度相對較高，鉀、銨和硝酸鹽的含量高，目前使用最為廣泛。

杜金龍等[27]誘導三角紫葉酢漿草愈傷組織時，對比了不同基本培養(yǎng)基的生長效果，結果表明MS 培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導率、時間和生長速度最高，White次之，B5和N6較差。質地疏松的愈傷組織有利于不定芽的分化，MS培養(yǎng)基上質地較為疏松，White次之，B5和N6上質地都較致密。各項指標綜合比較顯示，MS培養(yǎng)基較有利于三角紫葉酢漿草愈傷組織的誘導。

目前，酢漿草屬植物組培普遍使用的基本培養(yǎng)基是MS 和1/2MS，MS 培養(yǎng)基多用于愈傷組織、叢生芽誘導和增殖培養(yǎng)，1/2MS則主要用于生根培養(yǎng)。

2.2 碳源和支撐物

碳源的種類與濃度對于體細胞的誘導有重要的作用[28]。劉建等[29]研究了不同碳源（蔗糖、果糖、可溶性淀粉）對三角紫葉酢漿草組培苗的分化發(fā)現，MS培養(yǎng)基中添加3%蔗糖效果最好，芽和根的分化率分別為94.44%和96.30%。培養(yǎng)基中的糖源不僅為外植體提供碳素，而且能夠調節(jié)滲透勢從而影響外植體的分化和發(fā)育。常規(guī)培養(yǎng)一般以MS、1/2MS 培養(yǎng)基添加3%蔗糖為主，并添加0.7%～1%瓊脂作為支撐物。

2.3 植物生長調節(jié)劑

植物生長調節(jié)劑的組合及其配比是酢漿草屬組培研究的核心。植物激素主要有5類，即生長素類、細胞分裂素類、赤霉素類、乙烯和脫落酸。組培實驗中常使用的植物激素主要為6-BA、KT、ZT 等細胞分裂素和IAA、NAA、IBA、2,4-D等生長素。合適的生長素和細胞分裂素配比對再生體系建立過程中愈傷組織誘導與分化、叢生芽的增殖以及生根等具有積極的作用。酢漿草屬不同品種、不同外植體材料誘導愈傷組織、叢生芽和生根的培養(yǎng)基成分之間存在差異，歸納匯總見表2。誘導階段6-BA、NAA 是常用激素，使用范圍分別是0.5～2.0、0.2～0.5 mg/L，其他輔用激素的使用頻率由高至低依次為KT、2,4-D、IBA。增殖階段6-BA、NAA仍為常用激素，使用范圍分別是0.5～3.0、0.1～0.5 mg/L。生根階段常見NAA單獨使用，使用范圍是0.05～2.5 mg/L。

表2 部分酢漿草屬不同外植體組織培養(yǎng)培養(yǎng)基成分mg/L

2.4 培養(yǎng)條件

綜合近年來酢漿草屬植物組培研究，通常情況下培養(yǎng)溫度設置為(25±1)℃；每天連續(xù)光照12 h，最長不超過16 h；光照強度1500～2000 lx，不超過3000 lx。

3 酢漿草屬植物組培體系

3.1 叢生芽的誘導與增殖

利用器官直接發(fā)生途徑誘導叢生芽發(fā)生與增殖是一種快速獲得組培苗的方式。較低濃度的生長素有利于叢生芽的誘導與增殖，生長素NAA 0.2 mg/L時酢漿草‘熔巖’莖段叢生芽增殖系數最高，NAA濃度升高會導致基部愈傷增多、叢生芽增殖系數降低，6-BA 高于1.0 mg/L 時叢生芽生長細弱，最適宜叢生芽誘導與增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L[31]。王金剛等對大花酢漿草鱗莖組培研究表明，6-BA 對叢生芽誘導具有重要的作用，6-BA 1.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L時誘導率達到82%，增殖階段NAA 0.25 mg/L增殖系數可達28.5[21]。余朝秀等[32]離體培養(yǎng)三角紫葉酢漿草鱗莖，誘導和增殖階段NAA添加濃度均為0.5 mg/L，誘導階段以6-BA 2.0 mg/L 最佳，增殖階段以6-BA 3.0 mg/L 最佳，此時增殖率達到29.3。宋詩迎等[33]對山酢漿草根頸進行培養(yǎng)，以1/2MS+0.4 mg/L ZT 為基本培養(yǎng)基，比較了不同濃度2,4-D、NAA、IBA、IAA 對根莖生長的影響，從試管苗、根莖的生長率和長勢等指標對比顯示，添加0.4 mg/L IAA時效果最好，使用該培養(yǎng)基進行繼代繁殖，平均50 d 一個培養(yǎng)周期，繁殖系數為4.2。倪蘇等[34]研究了生長遲緩劑B9對三角紫葉酢漿草試管苗增殖的作用，結果表明增殖培養(yǎng)時添加20 mg/L B9試管苗粗壯，增殖倍數達17.12。吳杰等[35]在誘導黃花酢漿草叢生芽時在MS+ 6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L 培養(yǎng)基中添加了10 mg/L 秋水仙素，出芽率達100%，且出現莖膨大、矮化等現象。Swetha等[36]研究細胞分裂素6-BA、KT 及生長素NAA、IBA、IAA 對酢漿草具芽外植體誘導產生再生苗的影響，結果表明培養(yǎng)基添加6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)時增殖效率最大為96%，培養(yǎng)基添加KT 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)時苗長最大，說明KT 可以促進莖的生長，而6-BA作用于莖的增殖。

生長素和細胞分裂素的配比決定了叢生芽增殖的數量和長勢，以6-BA與低濃度的NAA配合使用效果最好，NAA一般為0.2～0.5 mg/L，過高時愈傷過多、增殖系數降低；6-BA的濃度根據外植體材料不同而定，鱗莖作為外植體時濃度在1.5～3.0 mg/L為優(yōu)，使用莖段、葉柄等濃度一般低于1.0 mg/L。此外，附加一定濃度的生長遲緩劑或秋水仙素等處理能夠促進試管苗矮壯。

3.2 愈傷組織的誘導和分化

器官間接發(fā)生途徑是通過外植體誘導出愈傷組織，再分化出不定芽。該過程因酢漿草品種、外植體材料存在差異，愈傷組織的誘導率、誘導數量以及質量也明顯不同。誘導愈傷組織的激素有6-BA、NAA、2,4-D、KT等。

細胞分裂素是誘導愈傷組織的重要條件，在誘導愈傷組織與分化時培養(yǎng)基中一般6-BA與NAA組合使用，6-BA 與NAA 濃度比在5:1～2:1 之間，6-BA 的使用濃度一般不超過1.5 mg/L，過高時會產生玻璃化現象。胡國富等[18]在誘導培養(yǎng)三角紫葉酢漿草的葉片時，研究了6-BA、NAA 不同激素水平對三角紫葉酢漿草組培的影響，以葉片作為外植體，6-BA 或者NAA 單獨存在時對葉片誘導形成不定芽效果不佳，6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L 配合使用時，出芽率最高達93.3%。張興桃等[20]培養(yǎng)三角紫葉酢漿草葉片時，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L 出芽率為95%。采用6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L對鈍葉酢漿草啟動培養(yǎng)，愈傷組織和莖尖生長最好，繼代培養(yǎng)(NAA 0.1 mg/L)時隨著6-BA 濃度升高，鈍葉酢漿草芽的生長速度加快、分枝增加，6-BA 2.0 mg/L芽生長速度最快、高度適中、分枝較多、莖直立健壯[37]。

同類型的植物激素一般可以相互替換。誘導紅葉酢漿草（實為三角紫葉酢漿草）外植體產生愈傷組織時，細胞分裂素是主要影響因子，MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L 誘導效果最佳，繼代增殖時MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L 效果較好[38]。王鈺等[39]離體培養(yǎng)三角紫葉酢漿草葉片、葉柄時，在MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L 中分化最優(yōu)，出芽率為40%。任杰等[40]以三角紫葉酢漿草葉片為材料，采用固定配比的6-BA(0.5 mg/L)和NAA(0.5 mg/L)研究“一步法”誘導再生體系，結果發(fā)現0.1 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L KT配合前述配比的6-BA、NAA使用最有利于愈傷組織、根和不定芽的形成，也有效地減少了工作量。

3.3 生根

生長素在組培苗生根階段具有重要的作用。王金剛等[23]將繼代苗直接在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根效果最好，生根率達90%以上。培養(yǎng)7 d后幼苗基部愈傷組織膨大形成塊莖，有細小的呈淡灰色的根長出；培養(yǎng)20 d幼苗高達3～4 cm，根數均達到10條。1/2MS培養(yǎng)基較多使用在生根培養(yǎng)中，高貴珍等[22]以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，設置0、0.1、0.2、0.3 mg/L 4 個NAA 濃度梯度，發(fā)現不添加任何激素的基本培養(yǎng)基上就可生根，但是根數量相對較少且生長較弱，添加0.2 mg/L NAA時根的數量多、根粗壯、生長較強。有研究比較了相同濃度的NAA 與IBA 誘導三角紫葉酢漿草生根的效果，NAA 效果更好，使用1/2MS+0.2 mg/L NAA 時生根最早、根系粗壯，生根率達93.8%[18]。張興桃等[20]在1/2MS 中添加0.2 mg/L NAA 時，不僅生根早且根壯，苗基部出現組織塊并發(fā)育成塊莖。邱凱男等[37]以1/2MS 為基本培養(yǎng)基，發(fā)現不添加6-BA時，隨著NAA濃度升高，根的生長速度加快，NAA 0.1 mg/L時根密而粗壯，葉綠色，植株健壯，長勢最好；添加0.5 mg/L 6-BA時，NAA 濃度升高會抑制根的生長，最適宜生根的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L，出根率達59.2%。陳芬等[31]研究表明，1/2MS 中添加0.05～1.0 mg/L 的NAA酢漿草‘熔巖’的生根率均能達到100%，其中使用0.05 mg/L NAA時生根最早、根生長最好，NAA濃度增加根生長量下降。Swetha等[36]對酢漿草組培生根研究表明，MS 培養(yǎng)基添加IBA 或者NAA 均能促進生根，MS附加2.0 mg/L NAA時生根率達到了98%。

由于酢漿草在不定芽的分化和增殖過程中已經有少量不定根的形成，一般認為試管苗的生根較容易，在附加較低濃度的生長素如NAA、2,4-D 等的1/2MS 培養(yǎng)基上，試管苗生長茁壯，生根較早、快，生根率高。此外酢漿草屬球根植物，在生根過程中肉質鱗莖狀或塊莖狀地下根莖的形成尤為重要，具有這些結構的植株移栽方便、后期存活率高。

3.4 煉苗移栽

酢漿草組培苗在移栽前選用健壯、根系發(fā)達的植株進行煉苗，使其充分適應外界環(huán)境。通常煉苗時僅松開封口皮筋、培養(yǎng)瓶蓋或打開一半封口膜，再逐步去掉封口膜，煉苗2～3 d。取出組培苗后用清水洗凈基部培養(yǎng)基。陳芬等[31]在移栽組培苗時基質選用草炭、珍珠巖按7:3混合，控制好溫濕度，每3 d澆水1次。李霖等[17]僅使用營養(yǎng)土作為移栽基質，成活率100%。胡國富等[18]使用營養(yǎng)土并混合粗砂，成活率達98%以上。王金剛等[23]使用經滅菌的基質（園土:珍珠巖:木屑=2:1:1）進行移栽，并用無菌水一次澆透，在溫度24℃、濕度90%的人工氣候箱中煉苗，存活率在85%以上。余朝秀等[32]采用腐葉土、田園土、珍珠巖等作為混合基質，并對其蒸汽滅菌。移栽后保持空氣濕度80%左右，溫度20～30℃，成活率可達95%以上。酢漿草組培苗一般移栽在富含營養(yǎng)土的基質中，可混合一定比例砂、珍珠巖等，并保持合適溫濕度，移栽成活率極高。

4 問題與討論

污染、褐化、玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中的3個難題，是影響組培成功的關鍵性因素[41]。在酢漿草屬植物組培過程中，控制污染、降低褐化和玻璃化的發(fā)生，能夠提高組培苗的獲得率，有效降低繁殖成本。

4.1 污染問題

污染是影響植物組培的首要問題，通常情況下污染是由于工作臺環(huán)境、外植體材料、培養(yǎng)基和工具等消毒滅菌不規(guī)范、不徹底以及組培操作不當。酢漿草組培時由于外植體選取的差異，以及不同材料的滅菌方式，滅菌的效果具有顯著差異[42]。選擇酢漿草葉片作為外植體時因葉片表面著生柔毛，在消毒劑的水溶液中較容易產生氣泡，阻礙消毒劑表面的接觸，降低了消毒劑的滅菌效果。多項研究表明，在消毒劑中加入表面活性劑，如吐溫-20等，能減少葉片表面氣泡的產生，促進消毒劑發(fā)揮作用，顯著提升消毒效果，并在短時間內完成消毒過程，降低了幼嫩葉片被消毒劑殺死的概率，同時降低污染率。選擇鱗莖為外植體時需在消毒前洗凈，徹底除去表面雜質，消毒時間可以相應增加，有助于提高消毒滅菌效果。

4.2 褐化問題

褐化是植物組培中最常見的問題之一，對愈傷組織的分化、組培苗的生長等產生不利影響，普遍認為褐化是由酶促反應引起的[43]。外植體生理狀態(tài)直接影響褐化程度，老熟組織較為嚴重。添加0.1%～0.5%活性炭等吸附產生的褐色物質等，降低褐化的風險，也可提升芽的質量[26]。培養(yǎng)基中激素濃度過高，會導致一些生長較弱的叢生芽發(fā)生褐化而死亡[31]。根據褐化產生的機理，在酢漿草組培時，可以通過添加一定濃度抗氧化物質如維生素C等，避免培養(yǎng)溫度過高、光照過強等也可起到降低多酚氧化酶活性的作用，發(fā)生褐變的材料要及時轉移出去[42]。

4.3 玻璃化現象

玻璃化現象是植物組織培養(yǎng)中另一大難題，具體表現為植株生長異常，組織結構畸形，莖、葉片等呈現漬水狀態(tài)[42]。造成玻璃化現象的原因較多，例如培養(yǎng)基成分、植物激素濃度、培養(yǎng)溫度、光照強度等環(huán)境因素以及植物品種、外植體老幼程度等內在因素。有研究表明，適當降低培養(yǎng)基中的激素濃度可以有效抑制玻璃化現象的產生。李耀亭等[14]誘導體細胞胚時6-BA 的使用濃度高于1.0 mg/L 會產生玻璃化胚狀體現象，同時抑制體細胞胚的進一步發(fā)育，說明使用較高的激素濃度會引起玻璃化現象的發(fā)生。愈傷組織誘導階段應在黑暗條件或弱光條件下，而在不定芽分化階段一般需要較高強度的光照。培養(yǎng)基中糖的濃度可使培養(yǎng)基的滲透壓處于一定的范圍，通常糖濃度越高玻璃化程度越低[43]，避免培養(yǎng)過程溫度過高也會降低玻璃化發(fā)生的概率。

5 展望

目前酢漿草屬植物組培與再生體系建立的研究已有不少報道，國內外在酢漿草組培方面也取得了一定進展，主要是利用器官發(fā)生途徑的研究，體細胞胚再生途徑相關研究內容較少。酢漿草屬植物具有廣泛的花色、葉色變異范圍[44]。不同基因型酢漿草之間花色、葉色等差異主要是由花青素、黃酮、胡蘿卜素等色素沉著不同引起的，這些色素的合成機制也較為明晰[45]。基于再生體系建立研究的成果，對相關色素合成途徑中的通路基因和轉錄因子進行基因編輯，如苯丙氨酸解氨酶PAL、查耳酮合酶CHS 和轉錄因子MYB113 等，進而影響其合成與積累，定向培育色彩繽紛、觀賞價值較高的酢漿草新品種[46]，滿足市民對高品質園林綠化的需求。近年來，植物天然產物的合成生物學領域研究發(fā)展迅速。酢漿草中黃酮類、酚酸類和揮發(fā)油類等主要成分有著廣泛的藥理作用，生長迅速、管理較為簡單等優(yōu)勢使得酢漿草成為良好的植物天然產物提取原料[7]。基于其內源次生代謝通路的解析，對黃酮類、酚酸類等天然產物合成途徑中的功能基因或轉錄因子定向編輯，以酢漿草為底盤合成所需目的天然產物，進一步發(fā)揮酢漿草屬植物在臨床醫(yī)藥等研究方向上的應用前景[47]。