基于UPLC-MS/MS的林下三七不同部位生物堿類成分分析

張澳 嚴(yán)星茹 熊冰杰 黃佑國(guó) 何舒 周發(fā)金 王澍 施蕊

摘 要 為了挖掘林下三七地上部分的利用價(jià)值，給提高三七資源的綜合利用率提供新思路，采用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法分析了林下三七的果實(shí)、葉片、根三個(gè)部位的生物堿類成分。結(jié)果表明，林下三七果實(shí)、葉片和根共檢測(cè)到53個(gè)生物堿類化合物，但各部位總含量不相同，果實(shí)＞葉片＞根；多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)果實(shí)與根、葉片與根成分差異顯著，分別有26個(gè)和24個(gè)差異化合物，果實(shí)中3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺的含量較高，葉片中3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇的含量較高；篩選得到鑒別果實(shí)、葉片、根的生物堿類差異標(biāo)志物，分別是油酰單乙醇胺、3-羥基吡啶和乙酰色胺。

關(guān)鍵詞 林下三七；生物堿類成分；代謝組學(xué)；差異化合物；植株部位

中圖分類號(hào)：S567.23+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.09.004

五加科人參屬三七[Panax notoginseng （Burk） F. H. Chen]作為云藥的代表聞名杏林，《本草綱目》譽(yù)之“金不換”“補(bǔ)血第一”，即具備散瘀止血、消腫止痛的功效[1]。近年來(lái)云南三七產(chǎn)量全國(guó)占比高達(dá)98%以上，正逐漸形成種植加工銷售一體化的龐大產(chǎn)業(yè)體系[2]。國(guó)家中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略提出需要全面提升中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平即實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)[3]，而三七產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)過(guò)程發(fā)現(xiàn)了一個(gè)嚴(yán)重的門檻，三七產(chǎn)品開發(fā)深度和廣度不足導(dǎo)致三七產(chǎn)值低、產(chǎn)業(yè)鏈短[4-6]。因此，為增加三七產(chǎn)值和延長(zhǎng)三七產(chǎn)業(yè)鏈，提高三七資源的綜合利用率是十分必要的。

現(xiàn)階段，三七的研究領(lǐng)域主要集中于三七的傳統(tǒng)入藥部位根部及其皂苷類成分[7-8]，有關(guān)三七不同部位和非皂苷類成分的研究較少。三七的果實(shí)和葉片作為其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的伴生產(chǎn)物，常常順應(yīng)自然凋落腐爛，實(shí)際是一種資源浪費(fèi)。生物堿類成分是植物體內(nèi)的一類次生代謝產(chǎn)物，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為吡咯、吡啶、吲哚等十余種[9]，具備豐富的生物活性，王騰飛等研究發(fā)現(xiàn)其具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗菌等多種藥理作用，在植物的適應(yīng)性、抗逆性等方面也發(fā)揮著重要作用[10]。因此，為增加三七資源綜合利用的多樣性，可以從三七不同部位的生物堿類成分入手探尋新思路。

植物代謝組學(xué)，是一門采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用等多種手段全面、高通量對(duì)植物化合物進(jìn)行定量、定性分析的新興學(xué)科[11]。代謝組學(xué)方法正逐漸成為應(yīng)用在藥用植物的中藥基原鑒別[12]、野生與栽培品的鑒別[13]、藥用部位鑒別[14-15]、不同發(fā)育期的成分鑒定及不同產(chǎn)地藥材的品質(zhì)差異[16]等方面的有效手段。

本實(shí)驗(yàn)采用廣泛靶向代謝組學(xué)方法對(duì)三七的果實(shí)、葉片、根的生物堿類成分進(jìn)行分析，

通過(guò)主成分分析（PCA）結(jié)合正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）的方法，篩選三七不同部位的差異化合物，探尋鑒別三七部位的生物堿類標(biāo)志物，挖掘三七果實(shí)、葉片和根部的利用價(jià)值，以期為提高三七資源的綜合利用率提供新思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)樣品林下三七采集于瀾滄竹塘（N22.74°，E99.82°，H1 457.39 m），按不同部位分為果實(shí)、葉片、根，即三組樣品，每組3次生物學(xué)重復(fù)，樣品信息如表1所示。

儀器：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜儀（Tandem mass spectrometry，MS/MS）；凍干機(jī)（Scientz-100F）；研磨儀（MM 400， Retsch）；離心機(jī)；渦旋儀，精密天平。

試劑：甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）；標(biāo)準(zhǔn)品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）；純水。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?樣品制備和提取

將林下三七完整植株鮮品真空冷凍干燥成干品，然后分揀成果實(shí)、葉片、根三部分，分部位放置研磨儀中研磨成粉末（30 Hz，1.5 min），分裝編號(hào)成F（果實(shí)）、L（葉片）、R（根）備用。精密稱定100 mg粉末浸泡于1.2 mL的70%甲醇提取液中，使用借助渦旋儀每30 min渦旋1次，每次30 s，共渦旋6次，然后充分混勻后，放置于4 ℃冰箱冷凍過(guò)夜?；旌弦河秒x心機(jī)離心（12 000 r·min-1）10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過(guò)濾得到濾液，裝入進(jìn)樣瓶進(jìn)樣分析。

1.2.2 ?超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)

液相條件：采用Agilent SB-C18 1.8?m（2.1 mm×100 mm）的色譜柱進(jìn)行色譜分離；設(shè)置柱溫40 ℃，流速0.35 mL·min-1，進(jìn)樣量4 μL；流動(dòng)相A為加入0.1%甲酸的超純水，B相為加入0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

質(zhì)譜條件：采用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP）進(jìn)行質(zhì)譜分析，配備ESI Turbo離子噴霧接口；渦輪噴霧離子源操作參數(shù)設(shè)置源溫度550 °C，離子噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負(fù)離子模式），離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設(shè)置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)高。

1.2.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用UPLC-MS/MS方法獲得質(zhì)譜峰圖，利用Analyst 1.6.3軟件處理三七樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用MultiaQuant軟件對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行積分校正，完成定性定量處理。對(duì)通過(guò)混合樣本檢測(cè)得到的總離子流圖（TIC圖）進(jìn)行重疊展示分析，判斷數(shù)據(jù)的重復(fù)性、可靠性和儀器的穩(wěn)定性。處理后的數(shù)據(jù)歸一化后采用多元統(tǒng)計(jì)分析中的主成分分析方法，對(duì)龐大復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行“簡(jiǎn)化和降維”，建立PCA得分圖，根據(jù)各樣本組間、組內(nèi)的分離趨勢(shì)判斷其差異程度。采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）彌補(bǔ)PCA方法的不足，在原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后進(jìn)行中心化處理，利用R軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函數(shù)進(jìn)行分析，建立OPLS-DA正、負(fù)模型，得到OPLS-DA得分圖、OPLS-DA S-plo圖、VIP（投影中變量重要性）圖和聚類熱圖，使組間區(qū)分最大化，篩選出差異化合物。結(jié)合PCA分析和OPLS-DA分析，采用VIP值和FC值（差異倍數(shù)值）組合的方法判斷三七不同部位之間的差異情況，得到核心差異化合物和明確三七不同部位的開發(fā)利用價(jià)值[17]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?生物堿類化合物的定性定量分析

本實(shí)驗(yàn)采用三七的三個(gè)部位即果實(shí)、葉片、根，共選取9個(gè)樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

通過(guò)UPLC-MS/MS方法檢測(cè)所得MRM化合物檢測(cè)多峰圖（見(jiàn)圖1），峰積分校正處理后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照和數(shù)據(jù)庫(kù)自查，結(jié)果表明一共檢測(cè)到53個(gè)生物堿類化合物，經(jīng)含量對(duì)比發(fā)現(xiàn)果實(shí)、葉片和根的生物堿總含量具有差異性，果實(shí)＞葉片＞根。后續(xù)通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)53個(gè)生物堿類化合物進(jìn)行具體分析，找出果實(shí)、葉片和根的差異化合物。

2.2 ?主成分分析

對(duì)檢測(cè)所得的化合物進(jìn)行主成分分析，建立PCA得分圖，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品，同樣的圖形表示同一組樣品，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離遠(yuǎn)近表示分離效果，距離越遠(yuǎn)分離效果越好，表示樣品間差異性越大。

如圖2所示，第一主成分的解釋率為42.51%，第二主成分的解釋率為24.51%，表明兩個(gè)主成分能夠基本反映檢測(cè)樣的主要特征信息；mix樣本即質(zhì)控樣本，位于三個(gè)部位樣本的中間且組內(nèi)趨于同一點(diǎn)，說(shuō)明數(shù)據(jù)重復(fù)性良好、可靠；F位于PC1的負(fù)半軸和PC2的正半軸，L位于PC1的正半軸和PC2的負(fù)半軸，R位于PC1的正半軸和PC2的正半軸，F(xiàn)、L、R三者間明顯分離，說(shuō)明果實(shí)、葉片和根之間的生物堿類成分差異明顯。

2.3 ?OPLS-DA分析

正交偏最小二乘法判別分析方法可以與PCA方法互補(bǔ)，更全面地計(jì)算成分間的相關(guān)性，去除不相關(guān)的差異信息，使組間區(qū)分最大化篩選差異化合物。對(duì)三個(gè)部位作兩兩對(duì)比即FvsR（果實(shí)和根對(duì)比）、LvsR（葉片和根對(duì)比）、FvsL（果實(shí)和葉片對(duì)比），進(jìn)行OPLS-DA分析區(qū)分不同部位的組間差異，結(jié)果再一次論證果實(shí)、葉片和根之間的生物堿類成分差異明顯，與PCA分析所得結(jié)果一致。其中FvsL差異性比FvsR和LvsR較低，加之與傳統(tǒng)藥用部位根作對(duì)比更有意義，所以繼而將重點(diǎn)分析FvsR和LvsR的差異化合物。

以VIP ≥ 1，F(xiàn)C（差異倍數(shù)值） ≥2和FC ≤ 0.5作為篩選標(biāo)準(zhǔn)明確不同部位間差異顯著的化合物，F(xiàn)vsR篩選得到26個(gè)差異化合物，下調(diào)22個(gè)，上調(diào)4個(gè)；LvsR篩選得到24個(gè)差異化合物，下調(diào)15個(gè)，上調(diào)9個(gè)。如圖3所示，正值（或空心圓）代表上調(diào)差異表達(dá)化合物，負(fù)值（或?qū)嵭膱A）代表下調(diào)差異表達(dá)化合物，上調(diào)表示該化合物在根中的相對(duì)含量較高，下調(diào)表示該化合物在根中的相對(duì)含量較低。果實(shí)和根對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)最明顯的物質(zhì)是乙酰色胺（pmb0131），下調(diào)最明顯的物質(zhì)是油酰單乙醇胺（mws0983）；葉片和根對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)最明顯的物質(zhì)是乙酰色胺（pmb0131），下調(diào)最明顯的物質(zhì)是N-甲基煙酰胺（pma6298）。

2.4 ?差異化合物分析

多元統(tǒng)計(jì)分析篩選得到FvsR和LvsR組間差異明顯，F(xiàn)vsR的下調(diào)物占比為84.6%，LvsR的下調(diào)物占比為62.5%，表明果實(shí)、葉片的生物堿類成分比根中更多，同時(shí)可以作為鑒別部位的一類標(biāo)志物。下調(diào)表示該化合物在果實(shí)或葉片中的相對(duì)含量比根高，因此重點(diǎn)關(guān)注下調(diào)化合物，繼而可以發(fā)現(xiàn)不同部位開發(fā)利用價(jià)值的多樣性。

對(duì)比分析組間差異化合物中下調(diào)明顯的前三個(gè)物質(zhì)的相對(duì)含量，結(jié)果如表3和圖4所示，相對(duì)于根而言，3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺在果實(shí)中相對(duì)含量更高，油酰單乙醇胺下調(diào)最明顯，因?yàn)槠湓诟形礄z測(cè)出；3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇在葉片中相對(duì)含量更高，3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺在根中未檢測(cè)出；同時(shí)發(fā)現(xiàn)果實(shí)、葉片兩者和根相比，兩組的上調(diào)差異化合物中最明顯的都是乙酰色胺，因?yàn)槠渲辉诟袡z測(cè)出。

有關(guān)報(bào)道表明，三七果實(shí)和葉片中的3-吲哚丙酸、油酰單乙醇胺、3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺物質(zhì)具有進(jìn)一步研究的價(jià)值，可以應(yīng)用于保健品、藥品等產(chǎn)品開發(fā)。3-吲哚丙酸是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，對(duì)治療阿爾茨海默病有一定作用[18]，也是一種腸道微生物群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，是2型糖尿?。═2D）發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物，可通過(guò)保持β細(xì)胞功能來(lái)介導(dǎo)其保護(hù)作用[19]。油酰單乙醇胺可通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）介導(dǎo)的機(jī)制調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，可以在肥胖癥治療中發(fā)揮作用[20]。3-羥基吡啶的衍生物是維生素B6的結(jié)構(gòu)類似物，具有抗氧化作用等廣泛的藥理特性[21]。N-甲基煙酰胺是煙酰胺的化合物之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)ADMA-DDAH軸改善內(nèi)皮功能障礙并減輕動(dòng)脈粥樣硬化，也影響血管血栓形成[22]。而對(duì)甲氧基吲哚乙酸和5-羥基吲哚-3-乙醇有關(guān)藥理作用的研究甚少，有待發(fā)掘空間大。甲氧基吲哚乙酸可以根據(jù)其化學(xué)式C11H11NO3，參考其同分異構(gòu)體的化合物——5-甲氧基吲哚-3-乙酸，是一種褪黑素的代謝產(chǎn)物[23]。5-羥基吲哚-3-乙醇曾在哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，是5-羥色胺的化合物，可以作為一類急性酒精攝入的標(biāo)志，可以借為參考[24]。根的特有物質(zhì)乙酰色胺也具備利用價(jià)值，色胺是一種單胺生物堿，在大腦中的色胺作為神經(jīng)調(diào)節(jié)劑或神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，在植物中的色胺是影響植物生長(zhǎng)和微生物群落代謝途徑的原料，它曾被發(fā)現(xiàn)可能是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑吲哚-3-乙酸生物合成途徑中的一種中間產(chǎn)物[25]。

3 ?討論與結(jié)論

本研究在林下三七的果實(shí)、葉片和根中共檢測(cè)出53個(gè)生物堿類化合物，從生物堿總含量多少看，

果實(shí)＞葉片＞根；從成分差異性看，果實(shí)和根對(duì)比有26個(gè)差異化合物，果實(shí)中3-吲哚丙酸、甲氧基吲哚乙酸和油酰單乙醇胺的含量較高，葉片和根對(duì)比有24個(gè)差異化合物，葉片中3-羥基吡啶、N-甲基煙酰胺和5-羥基吲哚-3-乙醇的含量較高；篩選得到果實(shí)特有物油酰單乙醇胺，葉片特有物3-羥基吡啶，根特有物乙酰色胺，可以作為鑒別這三個(gè)部位的生物堿類差異標(biāo)志物。

與常用的高效液相色譜、超高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等成分分析方法相比，本研究采用的超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜法是一種更為快速、準(zhǔn)確、可靠、直觀的方法，為中藥材成分檢測(cè)、質(zhì)量評(píng)價(jià)、部位鑒別等提供新思路[26]。三七的傳統(tǒng)藥用部位主要是根，本研究發(fā)現(xiàn)三七果實(shí)和葉片的生物堿總量高于根，與崔秀明等分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)三七不同藥用部位的藥用成分含量具有差異性的結(jié)論一致[27]，這說(shuō)明三七不同部位的功效也可能不相同，揭示三七的果實(shí)和葉片這類地上部分也可能有利用價(jià)值。曲正義研究三七果實(shí)成分，發(fā)現(xiàn)三七果實(shí)成分含有抗腫瘤活性[28]，孫璠和黃積武等分析三七葉片成分，發(fā)現(xiàn)三七葉片成分含有抗炎活性[29]和抗氧化活性[30]，但發(fā)揮功效的具體物質(zhì)及其作用機(jī)理尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)中含量較高的3-吲哚丙酸和油酰單乙醇胺有抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用，葉片中含量較高的3-羥基吡啶和N-甲基煙酰胺也有抗氧化、保護(hù)心血管的作用，結(jié)合前人的研究成果說(shuō)明三七果實(shí)和葉片有巨大的開發(fā)利用潛力。

本研究從林下三七不同部位的生物堿類成分分析入手，旨在發(fā)現(xiàn)提高三七資源綜合利用率的更多可能性，結(jié)果為三七不同部位鑒別提供了新的差異標(biāo)志物，為三七果實(shí)和葉片的科學(xué)開發(fā)利用提供參考價(jià)值。針對(duì)性了解三七的生物堿類成分，能夠?yàn)殚_發(fā)創(chuàng)新產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)三七資源開發(fā)利用多樣性發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）