扶正生血膠囊含量測(cè)定及穩(wěn)定性研究

張 明 趙賢媚 易 榮 趙冰晶 張育勤 吳雪釵 劉林森 于波濤

中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，四川成都 610083

扶正生血膠囊為中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有滋陰培陽、益腎健脾、扶正固本、補(bǔ)血益氣的功效。主要用于腫瘤放化療后的支持治療、白細(xì)胞減少、血小板減少、再生障礙性貧血、失血性貧血及其他不明原因引起的全血細(xì)胞減少癥，療效確切[1]。虎杖苷、白藜蘆醇為本方的重要組分，在處方中發(fā)揮重要的藥理特性。本研究以虎杖苷、白藜蘆醇為制劑定量指標(biāo)，并對(duì)其性狀、含量、水分等穩(wěn)定性因素進(jìn)行探討，確保制劑工藝可靠、質(zhì)量穩(wěn)定、質(zhì)量檢測(cè)方法簡便可重復(fù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

安捷倫高效液相儀（1200 series，安捷倫科技中國有限公司）；METTLER 十萬分之一電子分析天平（AB135-S，METTLER TOLEDO）；智能雙功效超聲波提取器（廣東固特超聲股份有限公司，功率210 W，頻率60 KHz）；恒溫水浴鍋（HH-824S 型，上海君竺儀器制造公司）；熱風(fēng)干燥箱（201-2A 型，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）；紫外分析儀（ZF-20D 型，上海翼輝科學(xué)分析儀器有限公司）；崩解時(shí)限檢查儀（ZB-1D 型，天津天光光學(xué)儀器廠）。

1.2 藥物及試劑

扶正生血膠囊由中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑中心提供（批號(hào)：190729、190730、190731）；虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)：111575-201603，20 mg/支，含量以87.3%計(jì)）、白藜蘆醇對(duì)照品（批號(hào)：111535-201703，20 mg/支，含量以99.4%計(jì)）購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 虎杖苷及白藜蘆醇含量測(cè)定

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱定虎杖苷4.22 mg、白藜蘆醇1.13 mg，加50%稀乙醇超聲定容于25 ml 棕色容量瓶中，得濃度為168.81 μg/ml 虎杖苷、45.23 μg/ml 白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試樣品溶液的制備

取扶正生血膠囊內(nèi)容物約1.0 g，精密稱取，加50%稀乙醇25 ml 于具塞瓶中，精密稱重，于超聲儀超聲33 min，至冷卻稱量，加50%稀乙醇添補(bǔ)失重，搖晃均勻，用注射器吸取適量上清液，微孔濾膜濾后取濾液作供試樣品溶液。

2.3 陰性樣品溶液的制備

按該處方稱取除虎杖外的剩余藥材，經(jīng)水煮、濃縮、混合、烘干、整粒等標(biāo)準(zhǔn)工藝制備并用“2.2”項(xiàng)下方法制作不含虎杖的陰性樣品溶液。

2.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent YMC-Triart C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈∶水（25∶75）等度洗脫，洗脫時(shí)間為15 min；波長為312 nm，流速為1.1 ml/min，柱溫為27℃，進(jìn)樣量為10 μl。理論塔板≥3 500，分離度≥2.0。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密移取168.81、45.23 μg/ml 的虎杖苷、白藜蘆醇混合對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、10 ml 于10 ml 容量瓶中，加入流動(dòng)相定容，進(jìn)注高效液相儀分析，峰面積為Y 軸，進(jìn)樣量為X 軸，進(jìn)行回歸分析?；貧w方程為虎杖苷：Y=115.20X+101.91（r=0.999 9）；白藜蘆醇：Y=2.75X+28.59（r=0.999 9）。提示虎杖苷、白藜蘆醇分別在16.81～168.81 μg/ml、4.52～45.23 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取已知濃度虎杖苷、白藜蘆醇對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)注6 次，測(cè)得峰面積[2]，峰面積的RSD 值分別為0.37%、0.41%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下樣品溶液方法，平行制備6 份樣品（批號(hào)：190731）溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件檢測(cè)峰面積并計(jì)算虎杖苷與白藜蘆醇的含量[3]?；⒄溶?、白藜蘆醇的RSD值分別為1.73%、2.16%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下同一批次樣品（批號(hào)：190731）溶液8 ml，依次于0、2、4、8、12、24 h 取樣進(jìn)注色譜儀，記錄峰面積[4]，虎杖苷、白藜蘆醇的峰面積RSD 值分別為0.69%、1.24%。

2.9 加樣回收率

取已知含量樣品（含虎杖苷、白藜蘆醇分別為0.556、0.136 mg/ml，批號(hào)：190729）適量，各9 份，每份約1.0 g，分別加入一定量虎杖苷、白藜蘆醇對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件檢測(cè)峰面積并計(jì)算虎杖苷與白藜蘆醇的含量，通過測(cè)得量與已知樣品含量、加入量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算回收率[5]，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定

取3 批次供試品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 扶正生血膠囊中虎杖苷與白藜蘆醇的含量（n=3）

3 初步穩(wěn)定性考察

3.1 樣品的測(cè)試條件及封裝

取樣品（批號(hào)：190729）以上市標(biāo)準(zhǔn)鋁箔膜封裝，室溫保存并連續(xù)測(cè)試，測(cè)試時(shí)間24 個(gè)月。

3.2 方法

參照《中華人民共和國藥典》2020 版[6]膠囊劑穩(wěn)定性重點(diǎn)項(xiàng)目，重點(diǎn)考察其性狀、虎杖苷與白藜蘆醇含量、水分、崩解時(shí)限、裝量。

3.3 高溫、高濕、強(qiáng)光、加速、長期試驗(yàn)

3.3.1 高溫穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取樣品（批號(hào)：190729）約1.25 g，去包裝，放置容器中，溫度60℃，放置10 d，每間隔5 d，分取少許檢測(cè)，按“3.2”項(xiàng)下重點(diǎn)項(xiàng)目考察。結(jié)果見表3。

表3 高溫、高濕、光照穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.2 高濕穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取樣品（批號(hào)：190729）約1.25 g，置恒濕容器中，溫度25℃，相對(duì)濕度（90±5）%，存放10 d，每間隔5 d，分取少許檢測(cè)，按“3.2”項(xiàng)下重點(diǎn)項(xiàng)目考察。結(jié)果見表3。

3.3.3 強(qiáng)光照穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 稱取樣品（批號(hào)：190729）約1.25 g，開口曝光，設(shè)置光照度為（4500±500）lX，存放10 d，在第0、5、10 天時(shí)分別取少量檢測(cè)，按“3.2”項(xiàng)下重點(diǎn)項(xiàng)目檢測(cè)。結(jié)果見表3。

3.4 加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取樣品（批號(hào)：190729）約1.25 g，按成品封裝，溫度（40±2）℃、相對(duì)濕度（75±5）%，保存6 個(gè)月，第0、1、2、3、6 個(gè)月末取少許樣品測(cè)量，按“3.2”項(xiàng)下重點(diǎn)項(xiàng)目考察。結(jié)果見表4。

表4 扶正生血膠囊加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.5 長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取樣品（批號(hào)：190729）約1.25 g，按成品包裝，溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（60±5）%，保存24 個(gè)月，第0、3、6、9、12、18、24 個(gè)月末取少許樣品測(cè)量，按“3.2”項(xiàng)下重點(diǎn)項(xiàng)目考察。結(jié)果見表5。

表5 扶正生血膠囊長期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6 結(jié)果

扶正生血膠囊24 個(gè)月考察結(jié)果表明，該品種在2 年內(nèi)考察指標(biāo)穩(wěn)定，故其有效期暫定為2 年。

4 討論

扶正生血膠囊由補(bǔ)骨脂、陳皮、虎杖、甘草等中藥制成，在臨床應(yīng)用多年，療效確切，該制劑中虎杖苷具有止咳、平喘、抗休克及抑制血小板聚集等作用[7-18]。白藜蘆醇具有抗氧化、抗自由基及抗癌等作用[19-25]。本研究以虎杖苷、白藜蘆醇為定量考察指標(biāo)，并對(duì)藥品進(jìn)行為期2 年的穩(wěn)定性考察。結(jié)果表示，方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率均符合要求，可用于扶正生血膠囊的質(zhì)量控制。同一產(chǎn)區(qū)虎杖受氣候、土壤等外界環(huán)境因素的影響較小，而在不同地區(qū)因水土、溫度、濕度等環(huán)境因素差異，虎杖中各有效成分含量占比有較大不同，筆者單位位于西南地區(qū)，參照張明等[26]考察西南5 個(gè)產(chǎn)區(qū)虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇含量，選用四川樂山產(chǎn)虎杖作為原料藥，以乙腈∶水（25∶75）洗脫分析該制劑，結(jié)果表明該洗脫劑簡單、穩(wěn)定、可重復(fù)。

扶正生血膠囊含有多種藥材，在樣品定量提取中，分別考慮了微波提取法、加熱回流提取法及超聲提取法等，各方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取法簡單、有效、提取效率高，故本制劑含量測(cè)定采用超聲提取法。對(duì)等分別考察后，根據(jù)測(cè)定成分的峰面積確定了提取溶劑的種類、用量和提取時(shí)間最優(yōu)提取條件，即用50%乙醇25 ml，超聲提取33 min。含量測(cè)定考察過程中發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜圖中基線不平，懷疑色譜柱柱溫在30℃時(shí)有漂移不穩(wěn)定現(xiàn)象，逐步將柱溫降至27℃，基本消除基線漂移不穩(wěn)定等情況，故將柱溫設(shè)定為27℃。穩(wěn)定性考察過程中，由于考察項(xiàng)目多，用時(shí)長，故本研究從3 個(gè)批次中選擇了1 個(gè)批次進(jìn)行研究，但本研究存在項(xiàng)目不全，未全批次檢查的情況，后續(xù)研究中能夠更加全面、深入、細(xì)致地研究該膠囊穩(wěn)定性。