銀杏葉提取物EGb761對急性抑郁樣小鼠行為學(xué)及海馬炎性細(xì)胞因子的影響

周家建,王學(xué)永,柴洪燕,劉 璇,馬新越,趙約翰

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊 261042;2. 濰坊市濰城區(qū)人民醫(yī)院,山東 濰坊 261000;3. 濰坊市人民醫(yī)院,山東 濰坊 261041)

抑郁癥是一種嚴(yán)重的精神疾病,近年來其發(fā)病率顯著升高,大約影響全球20%的人口［1］。世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì),2030年抑郁癥將會成為人類喪失工作能力和死亡的最主要原因［2-3］。抑郁癥的病因尚不完全清楚,既往研究認(rèn)為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等均與之有關(guān),近年來對抑郁癥的研究提出“細(xì)胞因子假說”,認(rèn)為炎癥過程和腦-免疫相互作用與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)［4-6］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種對軸突的生長、神經(jīng)元的存活和突觸的可塑性具有至關(guān)重要作用的神經(jīng)營養(yǎng)肽,參與抑郁癥的發(fā)?。?］。有證據(jù)表明,炎癥因子能降低機(jī)體BDNF水平,炎癥因子和BDNF在抑郁癥中起重要作用［8-9］。銀杏葉提取物EGb761具有抗炎、抗氧化、抗動脈硬化和神經(jīng)保護(hù)作用,可預(yù)防記憶減退和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生,改善情緒和認(rèn)知功能［10-11］,但其是否具有抗抑郁作用及是否對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的抑郁模型具有抗抑郁樣作用還未可知。本研究通過單次腹腔注射LPS制備急性抑郁樣小鼠模型,觀察EGb761預(yù)處理對小鼠行為學(xué)和海馬組織中炎性細(xì)胞因子、BDNF表達(dá)的影響,旨在探討EGb761抗抑郁作用及其機(jī)制,為銀杏葉提取物用于抑郁癥的治療提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性C57BL/6J小鼠40只,8周齡,體重20～25 g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司,許可證號:SCXK(滬)2012-0002。實(shí)驗(yàn)開始前7 d適應(yīng)新的實(shí)驗(yàn)環(huán)境,小鼠自由飲食攝水,實(shí)驗(yàn)遵循國家《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》的動物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)要求。

1.2主要試劑 EGb761(金納多片,德國威瑪舒培博士藥廠,規(guī)格:20 mg/片);LPS(美國Sigma公司);小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);BDNF ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3主要儀器 ZH-ZFT型聯(lián)合曠場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、ZH-QPT型強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、ZH-XWT型懸尾實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);iMark酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將40只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、EGb761低劑量組、EGb761中劑量組和EGb761高劑量組,每組8只。EGb761低、中、高劑量組小鼠分別給予EGb761(生理鹽水溶解)50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)灌胃12 d,于第10天腹腔注射LPS 0.83 mg/kg(該劑量可引起疾病的急性反應(yīng)和隨后的抑郁樣行為);模型組小鼠給予EGb761等量的生理鹽水灌胃12 d,于第10天腹腔注射LPS 0.83 mg/kg;對照組小鼠給予EGb761等量的生理鹽水灌胃12 d,于第10天腹腔注射等量的生理鹽水。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1曠場實(shí)驗(yàn) 腹腔注射LPS 24 h后,選用長100 cm、寬100 cm、高50 cm,周壁為黑色,地面為白色的敞箱進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn),評估小鼠的自發(fā)活動。敞箱地面用黑線劃分為面積相等的25塊,敞箱中央上方懸掛一只100 W的燈泡,在黑暗、安靜的房間中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),將小鼠置于清潔敞箱中央,錄制實(shí)驗(yàn)小鼠的活動,使用ZH-ZFT型聯(lián)合曠場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)分析并記錄小鼠的水平運(yùn)動得分(穿過地面的方塊數(shù))和垂直得分(站立次數(shù)),每只小鼠觀察時(shí)間為5 min。為避免前一只小鼠的殘留信息影響其他小鼠的測試結(jié)果,在新的實(shí)驗(yàn)開始前用75%的酒精清洗敞箱周璧及地面。

1.5.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 腹腔注射LPS 24 h后,選用直徑12 cm、高40 cm的透明圓桶于夜間進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。桶內(nèi)水深10 cm,水溫保持(24±1)℃。實(shí)驗(yàn)第1天小鼠強(qiáng)迫游泳15 min,取出后于25 ℃溫室烘干歸籠;第2天,小鼠強(qiáng)迫游泳6 min,第2分鐘開始使用ZH-QPT型強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄分析后續(xù)4 min內(nèi)小鼠的不動時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將小鼠迅速取出,于25 ℃溫室烘干歸籠。為避免前一只小鼠的殘留信息影響其他小鼠的測試結(jié)果,在新的實(shí)驗(yàn)開始前更換實(shí)驗(yàn)桶中的水。

1.5.3懸尾實(shí)驗(yàn) 腹腔注射LPS 24 h后,使用夾子夾住小鼠尾部距末端約3 cm處并倒吊于距地面30 cm左右的橫桿上,實(shí)驗(yàn)總時(shí)長為6 min,第2分鐘開始使用ZH-XWT型懸尾實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄并分析后續(xù) 5 min內(nèi)小鼠的不動時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,輕取小鼠并歸籠。為避免前一只小鼠的殘留信息影響其他小鼠的測試結(jié)果,在新的實(shí)驗(yàn)開始前對試驗(yàn)場所進(jìn)行通風(fēng)消毒。

1.5.4蔗糖水實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)兩部分,實(shí)驗(yàn)在隔噪音、安靜的房間中進(jìn)行。正式實(shí)驗(yàn)開始前48 h對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行蔗糖水飲用訓(xùn)練,每籠放置2個(gè)水瓶,第一個(gè)24 h,兩瓶均為1%的蔗糖水100 mL;第二個(gè)24 h,1瓶為1%蔗糖水100 mL,1瓶為純凈水100 mL。腹腔注射LPS 24 h并禁水(24 h)后,開始進(jìn)行糖水及純水消耗實(shí)驗(yàn),每籠放置2個(gè)水瓶(1%蔗糖水和純凈水各100 mL)。4 h后,測定小鼠的蔗糖水和純水消耗量,計(jì)算蔗糖水偏愛率。蔗糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.5.5海馬組織中炎性因子和BDNF含量檢測 小鼠腹腔注射LPS 48 h后,斷頭取腦組織,置于冰上剝離海馬并稱重,充分漂洗海馬組織后加入定量的PBS制備海馬組織勻漿,于-20 ℃條件下進(jìn)行凍融循環(huán)破壞細(xì)胞膜,取勻漿液,4 ℃下5 000× g離心15 min,取上清液分裝并保存在-20 ℃。按照ELISA試劑盒內(nèi)的說明書測定海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10和BDNF含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,各組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠自發(fā)活動得分比較 模型組和EGb761各組小鼠的垂直得分、水平得分均明顯低于對照組(P均<0.05),模型組和EGb761各組間垂直得分、水平得分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 對照組和急性抑郁樣各組小鼠自發(fā)活動垂直得分和水平得分

2.2各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間比較 模型組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間均明顯長于對照組(P均<0.05),EGb761中、高劑量組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間均明顯短于模型組(P均<0.05),且隨EGb761劑量增加而逐漸縮短。見圖2。

圖2 對照組和急性抑郁樣各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間

2.3各組小鼠蔗糖水偏愛率比較 模型組小鼠的蔗糖水偏愛率明顯低于對照組(P<0.05);EGb761中、高劑量組小鼠的蔗糖水偏愛率均明顯高于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組明顯高于EGb761低劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖3 對照組和急性抑郁樣各組小鼠蔗糖水偏愛率

2.4各組小鼠海馬組織中炎癥細(xì)胞因子含量比較模型組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量均明顯高于對照組(P均<0.05),IL-10 含量均明顯低于對照組(P<0.05)。EGb761中、高劑量組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組各指標(biāo)含量均明顯低于EGb761低、中劑量組(P均<0.05);EGb761中、高劑量組小鼠海馬組織中IL-10 含量均明顯高于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組均明顯高于EGb761低、中劑量組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 對照組和急性抑郁樣各組小鼠海馬組織中炎性細(xì)胞因子含量

2.5各組小鼠海馬組織中BDNF含量比較 模型組小鼠海馬組織中BDNF含量明顯低于對照組(P<0.05);EGb761中、高劑量組小鼠海馬組織中BDNF含量均明顯高于模型組(P均<0.05),且EGb761高劑量組均明顯高于EGb761低、中劑量組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 對照組和急性抑郁樣各組小鼠海馬組織中BDNF含量

3 討 論

LPS誘導(dǎo)模型是公認(rèn)的炎癥相關(guān)的抑郁癥動物模型［12］。本實(shí)驗(yàn)采用該方法構(gòu)建抑郁模型,結(jié)果顯示模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間顯著延長,對蔗糖水偏愛率降低,證實(shí)LPS腹腔注射誘導(dǎo)小鼠的急性抑郁樣行為模型成功;EGb761各劑量組與模型組相比,小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間隨EGb761暴露劑量增加而縮短,蔗糖水偏愛率升高,表明EGb761能改善LPS誘導(dǎo)的小鼠快感缺乏。Rojas等［13］研究表明,EGb761能夠縮短BALB/c小鼠強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間,本研究結(jié)果與之具有一致性。另外人們普遍認(rèn)為自發(fā)活動的改善可以縮短強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間,但本研究曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組和EGb761各組間小鼠的垂直得分和水平得分比較均無明顯差異,因此推斷強(qiáng)迫游泳不動時(shí)間和懸尾不動時(shí)間的縮短不是由自發(fā)活動改善所致,而是由EGb761抗抑郁作用所介導(dǎo)。

抑郁癥可激活免疫系統(tǒng),促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌,而細(xì)胞因子也能夠改變個(gè)體的情緒和行為。抑郁癥促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的激活是共同發(fā)生的,促炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6 、TNF-α等參與免疫激活和炎癥的發(fā)生［14］,而抗炎性細(xì)胞因子如IL-10等通過平衡促炎細(xì)胞因子的表達(dá)來影響抑郁行為［15］。Wu等［16］研究報(bào)道,抑郁癥患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高。Ogodek［17］研究表明,抑郁癥患者的血清IL-1β、IL-4、IL-8水平隨著抑郁癥的加重而增高,而血清IL-10水平明顯降低。Pan等［18］認(rèn)為IL-10可以逆轉(zhuǎn)強(qiáng)迫游泳應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為。Kim等［19］研究報(bào)道,IL-17在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色,累積的輕度應(yīng)激可通過上調(diào)IL-17導(dǎo)致抑郁癥狀的持續(xù)存在。本研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射LPS可誘導(dǎo)小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量升高和IL-10含量降低,與文獻(xiàn)［13］報(bào)道相一致;預(yù)先給予中劑量和高劑量EGb761均可顯著抑制小鼠海馬組織中IL-10含量的降低以及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量的升高。表明EGb761預(yù)處理可抑制炎癥并激活抗炎反應(yīng),促使機(jī)體免疫系統(tǒng)恢復(fù)平衡。

抑郁癥患者血清BDNF水平較正常人群顯著下降［20］,而外周血與中樞系統(tǒng)中的BDNF 表達(dá)水平密切相關(guān),提示抑郁樣行為在本質(zhì)上與大腦 BDNF表達(dá)有關(guān)［21］。中樞給予BDNF可在小鼠抑郁模型中產(chǎn)生抗抑郁樣活性,說明BDNF對抑郁癥具有保護(hù)作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射LPS可誘導(dǎo)小鼠海馬組織中BDNF含量降低,而中劑量和高劑量EGb761預(yù)處理可顯著抑制海馬組織中BDNF的降低。因此認(rèn)為上調(diào)小鼠海馬組織中BDNF含量可能會改善LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為。

綜上所述,EGb761能明顯改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性抑郁樣行為,其可能是通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A產(chǎn)生,上調(diào)海馬組織中BDNF及IL-10含量實(shí)現(xiàn)的。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。