基于沉積物eDNA評(píng)估三疣梭子蟹資源量的方法初探

張凡瑤, 張?jiān)倜? 陳萌琦, 韋東升, 徐嚴(yán)歡, 姚 冰, 孫振寧, 李 慧, 楊艷艷, 周 興, 李 凡, 陳翠霞

基于沉積物eDNA評(píng)估三疣梭子蟹資源量的方法初探

張凡瑤1, 張?jiān)倜?, 陳萌琦1, 韋東升1, 徐嚴(yán)歡1, 姚 冰1, 孫振寧2, 李 慧1, 楊艷艷2, 周 興3, 李 凡2, 陳翠霞1

(1. 中國(guó)石油大學(xué)(華東)化學(xué)化工學(xué)院, 山東 青島 266580; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 煙臺(tái) 264006; 3. 山東省青島市黃島區(qū)海洋發(fā)展局, 山東 青島 266499)

本文旨在通過(guò)沉積物eDNA(environmental DNA)的分析, 建立一種快速評(píng)估三疣梭子蟹資源量的方法。采用柱狀采泥器對(duì)萊州灣同一地點(diǎn)(37°30″E、119°20″N)不同深度(0~24 cm, 7個(gè)深度)進(jìn)行樣品采集, 提取不同深度地層沉積物中的eDNA, 并以此為模板, 運(yùn)用三疣梭子蟹COI基因通用型引物和特異性引物分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative PCR, qPCR)擴(kuò)增, 評(píng)估萊州灣近年來(lái)三疣梭子蟹的資源量變化。結(jié)果顯示: 7個(gè)樣品的eDNA中均能擴(kuò)增出700 bp長(zhǎng)度的DNA產(chǎn)物, 表明在不同深度沉積物所代表的年份均有三疣梭子蟹的存在; 通過(guò)Clustal X與MEGA 7.0軟件比對(duì)各序列堿基之間的差異性, 發(fā)現(xiàn)不同柱深沉積物中的COI基因共出現(xiàn)11個(gè)變化位點(diǎn), 包括8個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、2個(gè)顛換位點(diǎn)和1個(gè)插入位點(diǎn); qPCR結(jié)果顯示, 8~9 cm處的三疣梭子蟹COI基因拷貝數(shù)要大于其他深度地層沉積物, 說(shuō)明此柱深代表的年份中三疣梭子蟹的資源量高于其他年份。利用沉積物eDNA評(píng)估萊州灣海域內(nèi)的三疣梭子蟹資源量的方法, 可以打破時(shí)間和空間的限制, 檢測(cè)不同年份三疣梭子蟹的資源量的變化。

eDNA; 三疣梭子蟹; COI基因; qPCR; 資源量

三疣梭子蟹()俗稱海蟹或大蟹, 屬于甲殼綱十足目梭子蟹科, 在我國(guó)大陸架海域廣為分布, 具有體型較大、肉質(zhì)肥美、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn), 是我國(guó)單物種產(chǎn)量最高的一種蟹類, 同時(shí)也是山東近海主要的增殖放流物種之一[1-2]。但是, 由于過(guò)度捕撈和環(huán)境變化的雙重影響, 其資源量不斷衰退[3]。因此, 自2007年起, 山東省開(kāi)始在萊州灣大規(guī)模放流三疣梭子蟹[4], 截至2020年, 已累計(jì)放流三疣梭子蟹稚蟹超過(guò)10億尾。為合理確定放流數(shù)量和地點(diǎn)、提高放流效率、科學(xué)評(píng)價(jià)放流效果, 急需一種科學(xué)、準(zhǔn)確、便捷的三疣梭子蟹資源量評(píng)估技術(shù)。

近年來(lái), 不少學(xué)者對(duì)三疣梭子蟹的資源量進(jìn)行研究, 楊剛等[5]、張明亮等[6]構(gòu)建ECOPATH模型, 將生態(tài)系統(tǒng)簡(jiǎn)化為不同功能組, 利用各功能組的能量輸入與輸出的關(guān)系, 估算三疣梭子蟹在萊州灣的生態(tài)容量為3 749 t。王彬等[7]、Sun等[8]、吳強(qiáng)等[9]利用掃海面積法, 即根據(jù)拖網(wǎng)單位時(shí)間的掃海面積和拖網(wǎng)漁獲量估算單位面積內(nèi)三疣梭子蟹的絕對(duì)數(shù)量。高麗等[10]利用Ricker親體-補(bǔ)充量關(guān)系模型即群體資源量與補(bǔ)充量之間的關(guān)系對(duì)浙江漁場(chǎng)內(nèi)三疣梭子蟹進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化的預(yù)測(cè)。上述研究為三疣梭子蟹在特定地點(diǎn)的資源量估算提供了科學(xué)的方法, 然而掃海面積法存在資金投入大、取樣時(shí)間受限制等局限性, 難以高效準(zhǔn)確地掌握三疣梭子蟹的資源量及其時(shí)間序列信息; 由于種群數(shù)量較大且呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化, 使得ECOPATH模型與Ricker親體-補(bǔ)充量關(guān)系模型法對(duì)于物種資源量的評(píng)估仍存在投入資金大、非標(biāo)準(zhǔn)取樣、對(duì)物種數(shù)量有破壞性等方面的局限性。

eDNA是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù), 是指從水、沉積物等環(huán)境樣本中提取到的DNA, 包括細(xì)胞內(nèi)DNA和細(xì)胞外DNA, 可用于監(jiān)測(cè)水生生物物種豐富度[11]。Ficetola等[12]利用eDNA信息分析成功檢測(cè)到入侵物種牛蛙的存在, 被認(rèn)為是eDNA首次用于水生生物監(jiān)測(cè)。隨后, eDNA被用來(lái)檢測(cè)海洋脊椎動(dòng)物和海洋無(wú)脊椎動(dòng)物等[13], 實(shí)現(xiàn)了對(duì)水生生物種類的評(píng)估。自2010年以來(lái), 隨著qPCR和DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展, eDNA技術(shù)逐漸從定性分析物種存在與否逐漸擴(kuò)展到定量分析物種的豐度[14-17]。海洋沉積物是許多生物的歸宿, 記錄著海洋環(huán)境長(zhǎng)期演變信息[18], 而沉積柱樣品作為胞外DNA的載體[19], 保留了多種物種的混合復(fù)雜基因組信息, 相較于其他海洋環(huán)境樣品, 基因組信息豐富, 故海洋沉積物是研究海洋生物的重要物質(zhì)[20]。評(píng)估同一地點(diǎn)不同深度沉積物中生物的DNA的含量, 有助于重建某段時(shí)間內(nèi)、某一海域某一物種的種群數(shù)量信息[21], 尤其利于某一物種的歷史變動(dòng)分析[22]。

與傳統(tǒng)的生物監(jiān)測(cè)手段不同, eDNA無(wú)需對(duì)物種本身而只要對(duì)環(huán)境樣本進(jìn)行操作處理, 具有資金投入少、取樣簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)勢(shì), 逐漸被應(yīng)用于生物物種監(jiān)測(cè)、生物量估算等方面[23]。本文通過(guò)對(duì)萊州灣同一地點(diǎn)不同深度地層沉積物進(jìn)行eDNA提取, 并利用qPCR的方法, 初步建立一種基于沉積物eDNA評(píng)估三疣梭子蟹資源量的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 三疣梭子蟹

本實(shí)驗(yàn)所用的三疣梭子蟹由青島慧鵬海水養(yǎng)殖公司(青島海清)提供, 大小為0.3 kg/只, 從養(yǎng)殖場(chǎng)取回后, 保存于?80℃冰箱里備用。

1.1.2 沉積物樣品

沉積物樣品來(lái)自萊州灣(37°30″E、119°20″N)柱狀采泥器采集的樣品, 樣品運(yùn)送過(guò)程中, 用生物冰塊保存, 收到樣品后, 保存于?80℃冰箱里備用。實(shí)驗(yàn)中采用的柱深分別為0~1 cm, 7~8 cm, 8~9 cm, 9~10 cm, 10~11 cm, 13~14 cm, 22~24 cm。每一深度沉積物在進(jìn)行eDNA提取時(shí), 取5個(gè)重復(fù)樣品。設(shè)置連續(xù)柱深和非連續(xù)柱深的目的是為驗(yàn)證不同地層深度eDNA含量的差異性。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蟹肌肉組織DNA和環(huán)境DNA提取與檢測(cè)

取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(約0.5 g)大小的三疣梭子蟹肌肉組織樣品, 剪碎, 加入550 μL DNA裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L EDTA, 5 mol/L NaCl, 10% SDS, 1 g RNA酶), 混勻后, 加入20 μL蛋白酶K, 置于56℃水浴鍋中水浴消化2~3 h至溶液透明, 采用苯酚-氯仿提取法提取三疣梭子蟹基因組DNA。分別取0.5 g不同地層深度的沉積物樣品(5個(gè)重復(fù)樣品), 采用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒提取沉積物樣品DNA, 并溶于60 μL的緩沖液中。用NANODrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)三疣梭子蟹肌肉組織DNA和沉積物樣品DNA濃度, ?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 普通PCR與qPCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物: 采用COI基因普通PCR引物序列(COIL1490, COIH2198)[24-25]擴(kuò)增三疣梭子蟹COI基因, 以進(jìn)行序列一致性分析, 利用Primer 5.0設(shè)計(jì)三疣梭子蟹特異性qPCR引物COI-qPCR for和COI-qPCR rev用于COI基因的定量分析, 用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物COI-NE for 和COI-NE rev, 擴(kuò)增特定COI基因片段, 作為模板建立qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1), 各引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物

PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件: PCR擴(kuò)增體系為25 μL, 反應(yīng)液包括12.5 μL 2×GC buffer I, 4 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/L), 0.25 μL TaKaRa LA Taq (5 U/μL), 1 μL模板DNA, 引物各1 μL(10 mmol/L), 無(wú)菌去離子水補(bǔ)齊至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? (1)95℃ 5 min; (2)95℃ 50 s, 52℃ 45 s, 72℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán); (3)72℃ 10 min。

qPCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件: 使用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司的TB Green Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) qPCR試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線, 以COI-NE for和COI-NE rev為引物, 以三疣梭子蟹肌肉組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 得到COI特定基因片段, 純化回收后作為模板用于qPCR擴(kuò)增。將模板DNA以5倍濃度進(jìn)行梯度稀釋, 進(jìn)行qPCR。qPCR擴(kuò)增體系為20 μL反應(yīng)體系, 反應(yīng)液包括SYBR?Premix ExTaq? 10 μL, 0.4 μL上、下游引物(10 μmol/L), 模板 2 μL, ROXII 0.4 μL, 水6.8 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?步法: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸32 s, 40個(gè)循環(huán)。沉積物eDNA模板不經(jīng)稀釋, 取2 μL作為模板, 采用相同的條件進(jìn)行擴(kuò)增。沉積物DNA與標(biāo)準(zhǔn)品DNA均做3個(gè)重復(fù)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 將大小正確的條帶純化回收后送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.2.3 COI基因序列比對(duì)

將測(cè)序所得到的8條序列(三疣梭子蟹肌肉組織DNA和7個(gè)沉積物eDNA)分別在NCBI Gene Bank比對(duì), 確定所擴(kuò)增序列是否為三疣梭子蟹COI基因。利用Clustal X與MEGA 7.0軟件比對(duì)各序列堿基之間的差異性。

1.2.4 qPCR分析

首先, 采用ABI 7500 Software自動(dòng)計(jì)算各樣品的t值(t值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)), 同時(shí), 根據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線模板的COI基因(1348 bp)的DNA濃度, 利用下列公式計(jì)算模板COI基因的拷貝數(shù), 以平均t值為橫坐標(biāo), 以lg(已知COI基因拷貝數(shù))為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將沉積物平均t值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算得到沉積物中COI基因的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹基因組DNA及沉積物eDNA COI基因擴(kuò)增

通過(guò)NANODrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè), 三疣梭子蟹及沉積物樣品中DNA的質(zhì)量濃度分別為8 376、446.4、336、174、156、267.6、57.6、92.4 ng/g, 以三疣梭子蟹和不同地層沉積物eDNA為模板, 采用通用型COI基因引物(COIL1490, COIH2198)擴(kuò)增COI基因, 并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果顯示, 凝膠電泳條帶明亮清晰且均可擴(kuò)增得到長(zhǎng)度在700 bp左右的目的條帶(圖1), 證明各DNA均可成功擴(kuò)增得到COI基因, 并且特異性良好。

2.2 不同柱深沉積物三疣梭子蟹COI基因序列比對(duì)

利用1.2.3方法對(duì)所測(cè)得的序列(647 bp)進(jìn)行分析。序列堿基組成分析發(fā)現(xiàn), 各樣品擴(kuò)增的COI基因的A+T的平均含量為62.27%, G+C的平均含量37.73%。序列堿基突變位點(diǎn)分析結(jié)果顯示通過(guò)通用引物擴(kuò)增得到的COI基因有11個(gè)突變位點(diǎn)(表2), 包括8個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、2個(gè)顛換位點(diǎn)和1個(gè)插入位點(diǎn)。與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的三疣梭子蟹COI基因序列相比[26], 養(yǎng)殖的三疣梭子蟹COI基因在574位插入T并在594位出現(xiàn)G-C顛換。其余地層深度所提取的eDNA擴(kuò)增的COI基因序列在134位均出現(xiàn)A-G轉(zhuǎn)換, 10~11 cm所提取的eDNA擴(kuò)增的COI基因序列在276位出現(xiàn)了G-C顛換。總體分析結(jié)果說(shuō)明7個(gè)沉積物中所提取到的eDNA擴(kuò)增得到的COI基因與2020年新上傳的三疣梭子蟹COI基因序列相似度達(dá)到99%以上[26], 表明不同沉積物中三疣梭子蟹未發(fā)生明顯的遺傳變異。

圖1 COI基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

注: M表示D2000 plus DNA Ladder; 1表示三疣梭子蟹肌肉組織DNA; 2—8分別表示不同地層沉積物DNA(對(duì)應(yīng)地層分別為0~1 cm; 7~8 cm; 8~9 cm; 9~10 cm; 10~11 cm; 13~14 cm; 22~24 cm)

表2 不同地層沉積物中eDNA擴(kuò)增的COI基因片段遺傳一致性分析

注: “-”表示無(wú)堿基變化, 括號(hào)內(nèi)為變化位點(diǎn)

2.3 qPCR定量分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以三疣梭子蟹肌肉基因組DNA為模板, COI- NE for和COI-NE rev為引物, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 獲得1 348 bp大小的COI基因片段, 將基因片段進(jìn)行純化回收, 利用NANODrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定模板質(zhì)量濃度為20.8 ng/μL。將該溶液梯度稀釋后作為模板, 并按照1.2.4公式計(jì)算COI基因的拷貝數(shù)。隨后, 采用COI-qPCR引物對(duì), 進(jìn)行qPCR。擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示, 在指數(shù)擴(kuò)增區(qū)域每條擴(kuò)增曲線之間均被隔開(kāi), 且每個(gè)反應(yīng)的熔解曲線在80~80.5℃處均出現(xiàn)單峰, 表明設(shè)計(jì)的qPCR引物特異性強(qiáng), 擴(kuò)增效果好。

依據(jù)qPCR的結(jié)果, 三疣梭子蟹COI基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示, 該曲線擬合方程為=10.183?0.265 5,2=0.992 3, 表明t值與COI基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系, 該基因可用來(lái)測(cè)定環(huán)境中三疣梭子蟹基因組DNA含量。

圖2 COI基因擴(kuò)增曲線和基因溶解曲線

圖3 COI基因拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 三疣梭子蟹基因拷貝數(shù)分析

按照1.2.4所示方法, 以不同柱深沉積物eDNA為模板, 進(jìn)行qPCR, 得到不同柱深沉積物中eDNA模板擴(kuò)增的t值, 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線, 獲得不同沉積物中三疣梭子蟹COI基因的拷貝數(shù), 進(jìn)而獲得每克沉積物中COI基因的拷貝數(shù)(圖4)。結(jié)果顯示, 0~1 cm、7~8 cm、9~10 cm、10~11 cm、22~24 cm這5個(gè)深度的COI基因拷貝數(shù)大致相同, 8~9 cm的柱狀沉積物中COI基因的拷貝數(shù)最高, 而13~14 cm的柱狀沉積物中COI基因的拷貝數(shù)最低。

圖4 地層深度與COI基因拷貝數(shù)的關(guān)系

3 討論

eDNA是生物體釋放到環(huán)境中的DNA, 其濃度與生物量有關(guān), 且不受溫度的影響[27]。研究發(fā)現(xiàn)表層沉積物中eDNA相對(duì)比較穩(wěn)定, 一旦進(jìn)入水體后會(huì)被快速降解[28-29]。因此可通過(guò)不同地層eDNA的豐度及特定物種DNA探針檢測(cè)不同生物在特定時(shí)期內(nèi)的資源量, 然而, 沉積物eDNA的提取效率一直是困擾科研人員的一個(gè)問(wèn)題。目前, 沉積物中eDNA的提取有SDS提取法、高鹽法、蛋白酶K法、試劑盒法等, 大致可以分為兩類, 即直接提取法和間接提取法[30]。本研究前期利用直接法提取不同地層深度沉積物中的eDNA, 獲得的eDNA含量低, 凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增后無(wú)條帶或條帶較暗且有雜帶和拖帶, 說(shuō)明提取的eDNA質(zhì)量較差, 可能與沉積物中所含的腐殖質(zhì)酸、eDNA提取試劑酚類化合物等抑制了PCR過(guò)程有關(guān)[31]。而試劑盒法能較好地解決該問(wèn)題, 本研究采用MP BIO公司開(kāi)發(fā)的Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒[32]對(duì)沉積物進(jìn)行eDNA快速提取, 在較短時(shí)間內(nèi)有效提取eDNA且避免PCR抑制劑等的干擾, 凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增后條帶清晰且明亮。同時(shí), 為提高eDNA提取的重復(fù)性, 在提取eDNA樣品時(shí), 采用同一平面九點(diǎn)取樣法, 大大提高了各樣品eDNA提取的效率和準(zhǔn)確率。在以后的研究中, 如何保證提取各沉積物eDNA濃度的重復(fù)性, 仍是需要研究的重點(diǎn)。

在獲取高質(zhì)量的eDNA后, 本研究以其為模板, 采用三疣梭子蟹特異性COI基因的引物COI-qPCR for和COI-qPCR rev進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 結(jié)合熒光定量PCR技術(shù), 可預(yù)估不同地層深度沉積物中三疣梭子蟹COI基因的拷貝數(shù)。參考海洋沉積物同位素年代測(cè)定結(jié)果[33-34], 預(yù)估本實(shí)驗(yàn)7~8 cm沉積物對(duì)應(yīng)年代約為2013年。從DNA拷貝數(shù)與不同地層深度的關(guān)系可知, 相較于其他地層, 8~9 cm所對(duì)應(yīng)的2012年左右所對(duì)應(yīng)的DNA拷貝數(shù)較多, 13~14 cm所處的2007年左右所對(duì)應(yīng)的DNA拷貝數(shù)較少, 其余地層深度所對(duì)應(yīng)年代的DNA拷貝數(shù)大致相同, 說(shuō)明自實(shí)施漁業(yè)修復(fù)計(jì)劃以來(lái)三疣梭子蟹產(chǎn)量有所增加, 但0~1 cm所處的地層含有的DNA拷貝數(shù)較少, 間接說(shuō)明三疣梭子蟹含量可能在降低。這一發(fā)現(xiàn), 能夠有效地監(jiān)測(cè)三疣梭子蟹在不同地層年代的資源量, 科學(xué)評(píng)價(jià)三疣梭子蟹自然資源量的變化并依此制定相應(yīng)的政策。

綜上所述, 本研究成功從不同地層沉積物中提取到包含三疣梭子蟹基因在內(nèi)的eDNA, 利用qPCR技術(shù)檢測(cè)沉積物eDNA中的三疣梭子蟹COI基因拷貝數(shù), 可用于評(píng)估三疣梭子蟹的資源量。eDNA是含有大量細(xì)胞的有機(jī)體經(jīng)過(guò)時(shí)間的推移后在環(huán)境中留下的殘骸, 是目前檢測(cè)生態(tài)物種資源量最簡(jiǎn)單高效的手段, 但eDNA技術(shù)的局限性如樣品污染、DNA的降解、PCR抑制劑以及數(shù)據(jù)庫(kù)不完整等技術(shù)性問(wèn)題, 如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)技術(shù)優(yōu)化, 提升eDNA技術(shù)在評(píng)估特定物種資源量方面的精確度, 仍是需努力解決的問(wèn)題。

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A preliminary method to assess theresource based on sedimentary eDNA

ZHANG Fan-yao1, ZHANG Zai-mei1, CHEN Meng-qi1, WEI Dong-sheng1, XU Yan-huan1, YAO Bing1, SUN Zhen-ning2, LI Hui1, YANG Yan-yan2, ZHOU Xing3, LI Fan2, CHEN Cui-xia1

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, China University of Petroleum, Qingdao 266580, China; 2. The Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology of Shandong Province, Shandong Marine Resources and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Qingdao Municipal Marine Development Bureau, Qingdao 266499, China)

This study aimed to establish a rapid method to assess theresource by analyzing sedimentary environmental DNA (eDNA). Samples were collected at different sediment depths (0~24 cm, 7 depths) from the same location (37°30″ E, 119°20″ N) in Laizhou Bay using a column mud collector. The eDNA samples extracted from the ocean sediments served as the template to amplify the cytochromeoxidase subunit 1 (COI) gene by polymerase chain reaction (PCR) and quantitative PCR (qPCR) using universal and specific primers for theCOI geneThe amplified products were used to assess theresource in Laizhou Bay. The results showed that the 700 bp COI gene fragments were amplified from all extracted eDNA, indicating the presence ofin the years represented by the sediments at different depths. Genetic consistency was analyzed by Clustal X and MEGA 7.0 software, and 11 variable sites, including 8 conversion sites, 2 inversion sites, and 1 insertion site, were found for the COI gene at the different depths, suggesting high homology ofin the years represented by the 7 sediments. The qPCR results showed that theCOI gene copy number at 8–9 cm of soil depth was higher than that at the other depths, suggesting that theresource was richer in the years represented by the 8~9 cm depth than the other years. Using sedimentary eDNA saved time and space when assessing theresource in Laizhou Bay.

eDNA; Portunus trituberculatus; COI gene; qPCR; resource

May 20, 2022

S932.5＋2

A

1000-3096(2023)5-0113-08

10.11759/hykx20220520001

2022-05-20;

2022-07-27

煙臺(tái)市科技創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃(2020MSGY056); 山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(ZR2020KE050); 煙臺(tái)市科技創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃(2021XDHZ053); 山東省教學(xué)改革重點(diǎn)項(xiàng)目(Z2022114)

[The Science and Technology Innovation Development Program of Yantai, No. 2020MSGY056; Key Project of Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2020KE050; Science and Technology Innovative Development Programme of Yantai, No. 2021XDHZ053; Shandong Province Teaching Reform Key Project, No. Z2022114]

張凡瑤(1997—), 女, 山東日照人, 碩士生, 攻讀專業(yè)為生物化工, E-mail: 1134688407@qq.com; 陳翠霞(1979—),通信作者, 山東兗州人, 博士, 教授, 主要從事肽生物材料的制備及功能研究, E-mail: chencx@upc.edu.cn; 李凡(1981—), 通信作者, 山東臨沂人, 副研究員, 主要從事漁業(yè)資源與漁業(yè)生態(tài)研究, E-mail: lifan811230@126.com

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)