干細胞在子宮內(nèi)膜治療中的研究進展

代陽陽,辛廖冰,葉子,張松英

人類子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)復雜,包含多種細胞成分,如上皮細胞、間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、免疫細胞等。子宮內(nèi)膜隨著體內(nèi)雌孕激素的波動發(fā)生周期性增殖、分化、退化、脫落和再生。嚴重的子宮內(nèi)膜損傷或感染可導致子宮內(nèi)膜正常結(jié)構(gòu)的破壞,出現(xiàn)子宮內(nèi)膜纖維化、內(nèi)膜過薄或慢性炎癥。這些病變不利于囊胚著床,影響子宮和胎兒早期的血液供應,容易導致反復流產(chǎn)或不孕。干細胞是一種未分化細胞,具備自我復制和多向分化潛能[1],干細胞療法作為再生醫(yī)學的一種新興的治療方法在子宮內(nèi)膜重塑領(lǐng)域引起了人們的極大關(guān)注[2]。移植外源性干細胞或干細胞衍生物均可減少子宮內(nèi)膜纖維化,增加子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目和內(nèi)膜厚度,促進子宮內(nèi)膜的新生血管生成,調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境,提高妊娠率。本文對干細胞在子宮內(nèi)膜治療中的研究結(jié)果進行綜述。

1 子宮內(nèi)膜的生物學特性

1.1 子宮內(nèi)膜的生理特性

人類子宮內(nèi)膜分為外功能層和內(nèi)基底層。前者由致密的腺體組織和疏松的結(jié)締組織間質(zhì)組成,在月經(jīng)期發(fā)生脫落;后者包括血管、腺體基底層及致密層,在月經(jīng)周期中保持恒定。子宮內(nèi)膜具有高度再生能力,在正常月經(jīng)周期中,功能層脫落后,內(nèi)膜創(chuàng)面會迅速上皮化和逐步增厚,實現(xiàn)無瘢痕的完全修復和功能重建,子宮內(nèi)膜的完整性保證了正常月經(jīng)的形成和胚胎的順利植入。

1.2 子宮內(nèi)膜干細胞

子宮內(nèi)膜的高度自我修復和更新能力使研究者推測其中存在干細胞,這種干細胞在內(nèi)膜的周期性無瘢痕再生中發(fā)揮了重要作用[3]。Chan RWS等[4]在2004年首次從人子宮全切標本的內(nèi)膜組織中分離并鑒定出一類具有克隆形成能力的細胞(colony-forming unit fibroblasts,CFU-F),CFU-F可被誘導分化為脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞和骨細胞,具有間充質(zhì)干細胞的典型分子標志。在小鼠的子宮內(nèi)膜中也存在一群標志保留細胞,同樣具備干細胞的多向分化潛能和分子標志[5]。CD140bCD146是目前最為廣泛采用的子宮內(nèi)膜干細胞(endometrial mesenchymal stem cell,eMSC)的表面標志。利用表面分子標志,研究者發(fā)現(xiàn)eMSCs主要定位于內(nèi)膜基底層和功能層的血管周圍,而基底層中eMSCs含量明顯高于功能層[6]。

eMSCs在子宮內(nèi)膜的周期性修復中起到重要作用。eMSCs含量在月經(jīng)周期各個時期基本穩(wěn)定,且各時期的eMSCs在克隆形成能力上也無明顯差異,但月經(jīng)期eMSCs表現(xiàn)出更強的自我更新能力,這提示月經(jīng)期子宮內(nèi)膜微環(huán)境的改變會激活eMSCs的增殖能力,促進月經(jīng)后的組織修復[6]。小鼠子宮內(nèi)膜中的標志保留細胞在分娩后表現(xiàn)出明顯的增殖行為,待子宮內(nèi)膜完全修復后,這些細胞則重新回歸靜息狀態(tài)[7]。這些研究結(jié)果表明,eMSCs對生理狀態(tài)下內(nèi)膜修復至關(guān)重要,當內(nèi)膜中eMSCs數(shù)量不足和/或功能障礙時,就可能導致內(nèi)膜增生和/或功能障礙。

2 子宮內(nèi)膜的病理變化及其發(fā)病機制

子宮內(nèi)膜纖維化是由子宮內(nèi)膜損傷、侵襲性刮宮術(shù)、炎癥等原因引起的子宮內(nèi)膜基底層損傷,是導致子宮性不孕癥最常見的病理變化。功能層再生修復障礙導致內(nèi)膜部分或完全缺失,子宮創(chuàng)面由于缺乏上皮層覆蓋而發(fā)生粘連,形成宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)或更嚴重的Asherman綜合征。內(nèi)膜基底層損傷及局部炎癥還會引起薄型子宮內(nèi)膜,其病理可表現(xiàn)為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達下降、血管發(fā)育異常、子宮血液供應減少、內(nèi)膜纖維化和腺體數(shù)量減少。不明原因的子宮內(nèi)膜動脈血流阻力升高引起腺上皮發(fā)育不良,而VEGF主要由腺上皮細胞產(chǎn)生,這兩者互相影響最終導致薄型內(nèi)膜[8]。此外,內(nèi)膜干細胞的功能缺陷也是引起薄型內(nèi)膜的重要原因[9]。

子宮內(nèi)膜炎是另一種與不孕癥相關(guān)的內(nèi)膜病理狀況,組織學上表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)中漿細胞浸潤。慢性炎癥子宮內(nèi)膜中固有免疫和適應性免疫細胞比例升高[10]。

3 子宮內(nèi)膜再生的干細胞治療

正常的子宮內(nèi)膜是妊娠發(fā)生和維持的基礎(chǔ),薄型內(nèi)膜、IUA等內(nèi)膜異常性疾病會使內(nèi)膜容受性降低,導致女性生育力下降甚至不孕。因此,促進子宮內(nèi)膜無瘢痕再生并提高內(nèi)膜容受性是治療內(nèi)膜性不孕的關(guān)鍵。目前臨床常用療法如手術(shù)、激素補充、宮腔內(nèi)放置屏障裝置等在一定程度上可以促進內(nèi)膜再生并改善患者的妊娠結(jié)局,但部分中重度IUA患者術(shù)后粘連復發(fā)率高,仍存在子宮內(nèi)膜修復障礙。干細胞療法為薄型子宮內(nèi)膜和IUA等疾病治療提供了新的思路。

3.1 干細胞治療

3.1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmMSCs)從骨髓間質(zhì)中分離,易獲取且培養(yǎng)周期短,是再生醫(yī)學領(lǐng)域最常用的干細胞之一。在人和小鼠的子宮內(nèi)膜中,都發(fā)現(xiàn)了bmMSCs的存在,故bmMSCs很可能對內(nèi)膜再生有促進作用[11]。

Alawadhi F等[12]從雄性小鼠骨髓中提取bmMSCs并注射入雌性小鼠體內(nèi),后續(xù)檢測發(fā)現(xiàn),受損內(nèi)膜處可以檢測到更多的Y染色體陽性細胞,這說明損傷內(nèi)膜可募集bmMSCs到子宮內(nèi)膜局部。此外,接受bmMSCs移植的小鼠內(nèi)膜損傷處纖維化程度減輕,妊娠率得到顯著提高。在另一研究中,Cervelló I等[13]將人CD133+的bmMSCs通過小鼠尾靜脈注射或?qū)m腔注射的方式移植,觀察到bmMSCs在子宮內(nèi)膜血管旁聚集,并且顯著促進了周圍內(nèi)膜細胞的增殖并減輕了細胞外基質(zhì)的沉積。Wang G等[14]發(fā)現(xiàn),注射bmMSCs后,大鼠受損內(nèi)膜雌孕激素受體表達水平上升,而雌孕激素受體水平與內(nèi)膜的容受性密切相關(guān)。比較尾靜脈注射和宮腔注射后的bmMSCs駐留率發(fā)現(xiàn),接受尾靜脈注射的小鼠子宮處能檢測到更多的外源bmMSCs,并且能獲得更好的組織修復和功能恢復[15],這一差異或許是因為宮腔內(nèi)的干細胞懸液有可能隨著子宮收縮被排出體外影響了治療效果。盡管給藥途徑不同可能導致修復效果的差異,但無論靜脈注射或?qū)m腔注射都能促進內(nèi)膜的修復并提升動物IUA模型的生育力。

3.1.2 臍帶間充質(zhì)干細胞 臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,ucMSCs)具有低免疫原性、高自我復制潛能、易獲得的特點,能分泌多種活性細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)控和促進組織修復效應。Sun B等[16]將ucMSCs與米非司酮誘導損傷的內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),ucMSCs可顯著改善受損內(nèi)膜間質(zhì)細胞的形態(tài)和增殖能力。Zhang L等[17]發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射ucMSCs可以改善酒精損傷大鼠的子宮形態(tài),并可提高大鼠的妊娠率和胚胎數(shù)量,在組織學上則表現(xiàn)為內(nèi)膜纖維化水平降低,新生血管增多,此外,ucMSCs在大鼠體內(nèi)也表現(xiàn)出抗炎效果:接受2次和3次ucMSCs注射的大鼠子宮內(nèi)膜促炎因子干擾素γ和腫瘤壞死因子α水平均顯著下降。此外也有研究發(fā)現(xiàn),ucMSCs促進子宮內(nèi)膜修復的機制也可能與Akt信號通路有關(guān)[18]。

3.1.3 經(jīng)血間充質(zhì)干細胞 經(jīng)血間充質(zhì)干細胞(menstrual blood mesenchymal stem cells,menMSCs)是從健康女性月經(jīng)血中收集提取得到的一類間充質(zhì)干細胞,具有和bmMSCs相似的分化潛能。menMSCs和其他類型MSCs具有許多相似的特性,如促修復、免疫調(diào)節(jié)與促血管新生等。Zhang Y等[19]發(fā)現(xiàn)menMSCs在體內(nèi)可以激活Akt和ERK信號通路,促進VEGF等細胞因子的表達,促進內(nèi)膜局部血管新生,改善內(nèi)膜形態(tài)并提高生育力;在體外,menMSCs可以促進血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖,抑制氧化應激所導致的細胞損傷。Wang X等[20]將menMSCs與血小板源性生長因子共同注射于小鼠損傷的宮腔中,發(fā)現(xiàn)二者能夠激活內(nèi)膜局部的Akt和BAT,并增強CD34的表達,在促進內(nèi)膜修復的效果上具有協(xié)同作用。

3.1.4 脂肪來源間充質(zhì)干細胞 脂肪來源間充質(zhì)干細胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,adMSCs)是從脂肪組織中分離得到的一類成體干細胞,基質(zhì)血管旁成分(stromal vascular fraction,SVF)是提純adMSCs前的一類混合細胞群,這兩者均具有明顯的促修復效應。adMSCs可調(diào)節(jié)內(nèi)膜間質(zhì)細胞的行為,并減少細胞外基質(zhì)沉積,這提示adMSCs對于內(nèi)膜異常纖維化可能有修復效果[21]。體外培養(yǎng)的adMSCs可以分化成子宮內(nèi)膜上皮細胞,接受adMSCs移植的大鼠受損子宮在30 d時可以觀察到內(nèi)膜明顯增厚,腺體和微血管數(shù)目顯著增加,并且再生內(nèi)膜處的雌孕激素受體表達水平也得到恢復,與對照組相比,adMSCs移植組的妊娠率明顯提高[22]。在小鼠模型中,移植adMSCs能夠提高骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7和Smad5的表達水平,提示adMSCs可能通過這一通路促進內(nèi)膜組織的修復[23]。

3.1.5 人羊膜間充質(zhì)干細胞和人羊膜上皮細胞 人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)來源于人羊膜上皮層下間質(zhì),人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)來源于羊膜上皮層,都表現(xiàn)出典型的干細胞特性[24]。研究證明,hAMSCs和hAECs對子宮內(nèi)膜均有良好的修復作用,在動物模型中表現(xiàn)為內(nèi)膜厚度增加、腺體數(shù)量增多、微血管形成旺盛以及纖維化程度降低等,能促進生育力的恢復。Li B等[25]發(fā)現(xiàn)hAECs能促進內(nèi)膜間質(zhì)細胞增生,并可能通過促進VEGF表達促進血管新生。Yu J等[26]證實了Notch信號通路的激活參與介導hAMSCs向內(nèi)膜上皮細胞的分化從而促進內(nèi)膜再生。并且hAMSCs和hAECs能夠調(diào)節(jié)內(nèi)膜局部的微環(huán)境,抑制炎癥因子和促纖維化因子TGFβ的表達[27]。

3.2 干細胞衍生物治療

間充質(zhì)干細胞在移植后主要通過旁分泌作用發(fā)揮效應,如干細胞分泌組中的親環(huán)素A可促進內(nèi)膜局部血管新生[28]。間充質(zhì)干細胞還可分泌細胞外囊泡(extracellular vesicles,EV),包括外泌體(exosome,exo)、凋亡小體和微囊泡[29],其表面和內(nèi)部含有一些活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA、DNA和細胞因子等。

間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在子宮內(nèi)膜修復中的研究獲得了廣泛關(guān)注。Feng Y等[30]在體外觀察到,ucMSC來源的外泌體(ucMSC-exo)能夠促進內(nèi)膜腺上皮細胞的遷移能力。在動物模型中,ucMSC-exo單獨或聯(lián)合雌激素使用均能發(fā)揮顯著的免疫調(diào)節(jié)效果,減輕內(nèi)膜局部炎癥反應,增加內(nèi)膜VEGF表達,顯著降低內(nèi)膜纖維化程度[31]。在大鼠中,bmMSC-exo能夠改善內(nèi)膜間質(zhì)細胞的鐵死亡[32]。MSC-EVs中的miRNA是參與內(nèi)膜修復的重要分子,miR-233-3p能夠增強內(nèi)膜上皮前體細胞的活性[33]。Yao Y等[34]發(fā)現(xiàn)bmMSC-exo能夠逆轉(zhuǎn)TGFβ1誘導的內(nèi)膜上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,在兔IUA模型中,bmMSC-exo也可以顯著抑制TGFβ1和TGFβ1R的表達,降低纖維化程度。

間充質(zhì)干細胞在移植后由于宿主免疫排斥等因素容易發(fā)生凋亡,但干細胞移植仍能發(fā)揮修復效應,因此凋亡小體介導的修復效果逐漸受到關(guān)注。筆者所在團隊首次報道ucMSCs宮腔移植后會迅速凋亡,干細胞凋亡小體可能進一步發(fā)揮修復效果。因此體外制備干細胞凋亡小體并將其負載于水凝膠中,體內(nèi)外實驗證實負載了凋亡小體的水凝膠表現(xiàn)出良好的促進細胞增殖、調(diào)控細胞代謝,免疫調(diào)節(jié),促血管新生以及降低纖維化的效果,接受負載干細胞凋亡小體凝膠治療的動物子宮生育力得到了顯著恢復[35]。這一研究為干細胞修復子宮內(nèi)膜的研究方案提供了新的選擇,也為干細胞療法的機制提供了新的角度。

3.3 干細胞療法與生物材料的結(jié)合

生物材料的應用對再生醫(yī)學有著重要作用。目前內(nèi)膜再生領(lǐng)域常用的生物材料主要有膠原支架、透明質(zhì)酸水凝膠、脫細胞支架等。

膠原支架的引入為干細胞提供粘附,延長了干細胞在宮腔的駐留時間,并在損傷急性期為宮腔提供一定的物理阻隔,減少粘連形成[36]。利用膠原支架負載間充質(zhì)干細胞可實現(xiàn)干細胞的原位遞送并增強干細胞的修復效果[37],除遞送干細胞外,本團隊在膠原支架上負載UCMSC-exo,發(fā)現(xiàn)膠原支架復合外泌體能夠促進局部巨噬細胞的M2表型轉(zhuǎn)變,實現(xiàn)內(nèi)膜的修復[38]。

透明質(zhì)酸在臨床已被廣泛應用于宮腔操作后預防粘連的發(fā)生。利用透明質(zhì)酸水凝膠可以實現(xiàn)在宮腔遞送間充質(zhì)干細胞或外泌體等,促進子宮內(nèi)膜的修復[39-40]。本團隊在前期研究中,同樣采用透明質(zhì)酸水凝膠作為遞送干細胞凋亡小體的載體,在IUA的急性與慢性損傷模型中均實現(xiàn)內(nèi)膜組織學與生育力的修復[35]。

脫細胞支架保留了細胞外基質(zhì)基本的組成成分及三維空間結(jié)構(gòu),其表面天然的分子結(jié)構(gòu)能作為調(diào)節(jié)細胞行為的信號[41]。人羊膜脫細胞支架和人絨毛膜脫細胞支架能夠促進間充質(zhì)干細胞的體外增殖并高表達VEGF和血管生成素等因子,將adMSCs負載于人羊膜脫細胞支架后,可實現(xiàn)大鼠損傷內(nèi)膜增厚、腺體數(shù)量增加以及生育力的恢復[42]。

3.4 干細胞促進子宮內(nèi)膜再生的臨床研究

2011年Nagori C等[43]首次利用重度IUA患者自身bmMSCs進行宮腔灌注,術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)患者超聲下子宮內(nèi)膜增厚至8 mm,并通過體外受精-胚胎移植成功妊娠。Singh N等[44]采用超聲引導子宮內(nèi)膜下注射自體bmMSCs的方法治療了6例重度IUA患者,隨訪發(fā)現(xiàn)這些患者子宮內(nèi)膜均獲得了不同程度的增厚。該團隊后續(xù)納入更多IUA和薄型子宮內(nèi)膜患者,并對其中15例隨訪5年后發(fā)現(xiàn),這些患者除內(nèi)膜厚度增加外,3例患者成功妊娠并生產(chǎn)[45]。在另一項前瞻性研究中,Santamaria X等[46]分離復發(fā)性宮腔粘連患者自身CD133+bmMSC并注射入子宮螺旋動脈,術(shù)后3個月和6個月超聲和宮腔鏡隨訪發(fā)現(xiàn)宮腔形態(tài)改善且子宮內(nèi)膜厚度增加。在后續(xù)的回顧性研究中,De Miguel-Gómez L等[47]分析此前接受自體CD133+bmMSCs移植前后的內(nèi)膜標本,發(fā)現(xiàn)bmMSCs移植后可能通過旁分泌作用促進了內(nèi)膜局部增生和血管新生相關(guān)因子表達,并降低內(nèi)膜局部炎癥反應。近期有研究報道,富血小板血漿宮腔灌注聯(lián)合自體bmMSCs干細胞移植可實現(xiàn)內(nèi)膜生育力的恢復[48]。Zhao G等[49]利用膠原支架負載患者自體bmMSCs后移植入宮腔,發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜局部ΔNp63表達降低,內(nèi)膜增生活躍,在接受移植的10例患者中,5例成功妊娠并生產(chǎn)。我國一項納入53例患者的臨床試驗結(jié)果顯示,接受自體bmMSCs或自體bmMSCs聯(lián)合透明質(zhì)酸凝膠宮腔移植的患者,術(shù)后子宮內(nèi)膜均獲得明顯增厚,并且妊娠率顯著增加[50]。

ucMSCs應用于人體子宮內(nèi)膜修復的有效性和安全性也有相應的臨床證據(jù)。Cao Y等[51]將ucMSCs負載于膠原支架后移植到因復發(fā)性IUA而不孕的患者宮腔內(nèi),隨訪30個月未發(fā)現(xiàn)與移植相關(guān)的嚴重并發(fā)癥;與治療前相比,26例患者內(nèi)膜平均厚度明顯增加,組織學分析證實內(nèi)膜雌激素受體Ki67等表達量上升,并且10例接受治療的患者成功妊娠,8例患者分娩健康后代。本團隊也開展了ucMSCs結(jié)合膠原支架治療IUA的臨床試驗,在完成試驗的16例患者中均未發(fā)生與治療相關(guān)的嚴重并發(fā)癥,術(shù)后3個月隨訪可觀測到內(nèi)膜平均厚度顯著提高(5.87±0.77 mm vs 4.08±0.26 mm),免疫組化提示內(nèi)膜處雌孕激素受體表達升高、細胞增生和血管新生活躍;3例患者治療后通過凍胚移植成功妊娠,2例患者自然妊娠[52]。

其他已應用于臨床研究的干細胞包括自體月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細胞以及自體脂肪間充質(zhì)干細胞或基質(zhì)血管旁組分。在一項納入7例重度IUA患者的前瞻性研究中,接受自體menMSCs移植的患者內(nèi)膜均有明顯增厚,5例患者內(nèi)膜厚度達到胚胎移植標準,并且2例移植后成功妊娠并生產(chǎn)[53]。在另一項單中心研究中,Lee SY等[54]評估了移植后患者自體脂肪來源基質(zhì)血管旁組分對其內(nèi)膜修復的效果,發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜厚度顯著增加,且未發(fā)生與移植有關(guān)的嚴重并發(fā)癥,這說明自體脂肪來源干細胞用于內(nèi)膜修復是安全且有效的。

4 小結(jié)

IUA和薄型子宮內(nèi)膜是導致全球女性不孕的兩大病因。目前臨床傳統(tǒng)治療手段并不能很好防止中重度IUA的復發(fā)。與傳統(tǒng)治療相比,干細胞療法能使內(nèi)膜達到更好的修復效果。然而干細胞療法也存在一些亟待解決的問題,如移植后局部駐留率低、免疫排斥、干細胞質(zhì)量控制未建立統(tǒng)一標準等,臨床應用面臨阻礙。干細胞衍生物研究應用實現(xiàn)了干細胞療法的“無細胞治療”,這些衍生物在降低活細胞療法潛在風險的同時保留了干細胞的大部分生物效應,但其制備過程相對更復雜。生物材料的引入是干細胞療法的另一突破。生物支架不僅能為內(nèi)膜修復提供必要的物理支撐,也可以作為干細胞或衍生物的遞送載體,延長局部駐留時間,增強修復效果。并且隨著研究進展,越來越多具有特殊性質(zhì)的新興生物材料不斷涌現(xiàn),如可注射水凝膠、溫敏水凝膠、緩釋膠原支架等,這些生物材料的發(fā)展為內(nèi)膜修復提供了更多的可能性。干細胞療法在人體用于內(nèi)膜修復的研究仍然較少,目前仍缺少嚴格設(shè)計的多中心大樣本臨床研究提供更充足的臨床證據(jù)推動利用干細胞修復子宮內(nèi)膜的療法從實驗到臨床的轉(zhuǎn)化。再生醫(yī)學技術(shù)在不斷發(fā)展,新的研究結(jié)果也不斷涌現(xiàn),相信在不久的將來,子宮內(nèi)膜修復能夠取得新的突破。