一例牛中華泰勒蟲病的分子生物學(xué)診斷及分析

遲 雪，劉耀亮，張子健，李 齊，郭小雨，邢向東，田萬年*

1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林吉林市 132101；2.吉林省和龍市科技信息服務(wù)中心，吉林和龍 133500

牛泰勒蟲病是由泰勒科泰勒的原蟲寄生于牛的紅細(xì)胞內(nèi)的血液原蟲病[1]。寄生在牛紅細(xì)胞內(nèi)的泰勒蟲，蟲體小于紅細(xì)胞半徑，蟲體在紅細(xì)胞內(nèi)主要呈圓形、桿狀、逗點(diǎn)形、環(huán)形和梨籽形。其中以圓形和和卵圓形為主，占總數(shù)的70%。牛感染泰勒蟲主要臨床表現(xiàn)為貧血，消瘦，反芻障礙，嚴(yán)重時可引起死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。國內(nèi)報道感染牛的泰勒蟲主要有東方泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲和中華泰勒蟲。國內(nèi)對中華泰勒蟲研究報道較少，中華泰勒蟲最先在甘肅省境內(nèi)發(fā)現(xiàn)，主要通過青海血蜱傳播，蜱蟲每年5月中旬開始叮咬放牧牛群，在6月中下旬達(dá)到高峰，在7月中旬蜱蟲數(shù)量逐漸減少，對中華泰勒蟲分子生物學(xué)研究對該病的防治具有重要意義。2021年6月27日，吉林省圖們市某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的放牧黃牛先后發(fā)病，初步診斷疑似泰勒蟲感染，對發(fā)病病牛采集血液，進(jìn)行血涂片檢測和分子生物學(xué)檢測，并對泰勒蟲MPSP基因進(jìn)行測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，為牛泰勒蟲病防治提供分子流行病學(xué)資料。

1 發(fā)病情況

吉林省圖們市養(yǎng)殖戶李某飼養(yǎng)15頭母牛，6月初開始放牧，6月27日陸續(xù)發(fā)病。病牛表現(xiàn)為鼻鏡干燥，被毛無光澤，反芻障礙，前胃遲緩，貧血，尿液發(fā)黃，在牛的頸部和后肢大腿內(nèi)側(cè)發(fā)現(xiàn)大量蜱蟲。1頭4月齡犢牛出現(xiàn)精神沉郁，被毛逆立無光澤，出現(xiàn)水樣腹瀉，頸部有大量蜱蟲，不能站立，3 d后死亡。對犢牛剖檢發(fā)現(xiàn)漿膜有出血點(diǎn)，淋巴結(jié)腫脹。脾臟腫大，被膜有大量出血點(diǎn)。肝臟腫大，膽囊腫大，充滿粘稠膽汁。腸黏膜有出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)腫大，出血。

2 實驗室診斷

2.1 血液涂片采集

分別對發(fā)病牛頸靜脈采血10 mL，同時制作血涂片，顯微鏡鏡檢?？鼓湃氡袃?nèi)，實驗室-20 ℃冰箱保存。血涂片進(jìn)行標(biāo)號后，分別加2～3滴甲醇進(jìn)行固定，室溫放置7 min。血涂片放入染缸內(nèi)進(jìn)行吉姆薩染色8 h，用蒸餾水對吉姆薩染色后血涂片進(jìn)行沖洗，自然晾干，用100倍油鏡鏡檢觀察紅細(xì)胞內(nèi)是否含有泰勒蟲體。

2.2 PCR檢測及序列測定

按照血液基因組提取試劑盒說明書提取牛血液DNA。根據(jù)GenBank收錄的牛泰勒蟲序列，利用在線引物設(shè)計軟件設(shè)計一對擴(kuò)增牛泰勒蟲通用引物，上游引物：5’- CTTTGCCTAGG ATACTTCCT -3’；下游引物：5’- ACGGCAAGTGGTGAGAACT -3’。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為 50 μL ：Taq PreMix 25 μL，上下游引物各1 μL ；DNA 4 μL ；ddH2O 19 μL；PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度94 ℃進(jìn)行5 min，變性溫度為94 ℃進(jìn)行45 s，退火溫度58 ℃進(jìn)行30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后延伸溫度為72 ℃進(jìn)行7 min。經(jīng)電泳鑒定為陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，AT克隆。成功克隆到大腸桿菌后，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定為陽性大腸桿菌，菌液送往吉林省庫美生物技術(shù)有限公司測序。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST中對上述測序完成的產(chǎn)物序列進(jìn)行全面搜索后，利用序列分析軟件DNAStar對搜索后的序列進(jìn)行分析和拼接，利用MEGA軟件與GenBank中公布的已知牛泰勒蟲的MPSP基因序列中華泰勒蟲（MG950143、GQ180196、MG950143、MG784415、MT240817）、東方泰勒蟲（MG733348、MN600030、KY392962）、環(huán)形泰勒蟲（JX683683、KX904525、AF214840）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

3 檢測結(jié)果

3.1 血液涂片鏡檢結(jié)果

發(fā)病牛血涂片經(jīng)姬姆薩染色，在顯微鏡下觀察顯示：紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)犁籽形和圓形蟲體，染蟲率為30%，通過紅細(xì)胞內(nèi)蟲體形態(tài)觀察初步診斷為泰勒蟲感染。

3.2 PCR檢測及測序結(jié)果

發(fā)病牛血液DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴(kuò)增出約為798 bp特異片段，而陰性對照未出現(xiàn)特異目的條帶。對PCR產(chǎn)物測序后，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST對比分析，與GenBank收錄的中華泰勒蟲新疆分離株（MG950143）同源性為99.12%，表明病牛感染蟲種為中華泰勒蟲。

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

經(jīng)MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示，基于泰勒蟲MPSP基因的遺傳進(jìn)化樹分為兩大分支，其中中華泰勒蟲與東方泰勒蟲處于同一分支，本次測序獲得的蟲株與中華泰勒蟲處于同一分支，與中華泰勒蟲馬來西亞分離株（MT240817）親緣關(guān)系較近。環(huán)形泰勒蟲單獨(dú)處于一個分支，本試驗測序獲得蟲株與環(huán)形泰勒蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

4 分析與討論

牛泰勒蟲病是經(jīng)蜱傳播的血液蟲病，對外地引進(jìn)牛和純種牛危害嚴(yán)重。中華泰勒蟲主要流行于我國甘肅、重慶、西藏、新疆、四川、山東等省[3～5]。近年來，隨著吉林省大力發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)，中華泰勒蟲已成為吉林省養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要寄生蟲病病原。國內(nèi)對泰勒蟲病的診斷主要通過臨床癥狀結(jié)合血液涂片鏡檢方法，血液涂片檢查對操作人員專業(yè)水平要求較高，需熟練掌握牛泰勒蟲蟲體的形態(tài)，血液涂片鏡檢的缺點(diǎn)不能準(zhǔn)確區(qū)分感染牛的泰勒蟲種類，牛在早期感染泰勒蟲時因紅細(xì)胞內(nèi)蟲體染蟲率較低，易出現(xiàn)誤診。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，PCR檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于牛泰勒蟲種的分子鑒定，PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，可對牛華泰勒蟲進(jìn)行早期診斷。本試驗通過血液涂片鏡檢和PCR檢測方法確定該養(yǎng)殖戶病牛感染中華泰勒蟲，豐富了中華泰勒蟲分子流行病學(xué)資料。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，本試驗測序獲得的蟲株與中華泰勒蟲處于同一分支，與馬來西亞株親緣關(guān)系較近，與環(huán)形泰勒蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本試驗結(jié)果與白啟、劉愛紅等[6,7]基于中華泰勒蟲18S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（中華泰勒蟲與環(huán)形泰勒蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)）相一致，豐富了中華泰勒蟲的分子遺傳資料。本試驗首次報道了吉林省圖們市放牧牛體內(nèi)存在中華泰勒蟲，據(jù)報道中華泰勒蟲傳播媒介為青海血蜱，下一步試驗對吉林省圖們地區(qū)優(yōu)勢蜱種進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，進(jìn)一步分析吉林省流行的中華泰勒蟲媒介傳播來源。

5 防控措施

國內(nèi)尚未研制出牛泰勒蟲病的疫苗，對該病尚無特效藥物治療。對早期感染中華泰勒蟲病牛要進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，使用體外殺蟲藥，臨床中治療該病的藥物為貝尼爾和黃色素注射液交替使用，避免藥物產(chǎn)生耐藥性。病情較嚴(yán)重的牛，可注射含地塞米松、維生素C和青霉素組成的葡萄糖注射液混合溶液進(jìn)行靜脈注射，每天2次。待病牛臨床癥狀緩解后進(jìn)行驅(qū)蟲，黃色素劑量按3～4 mg/kg，添加到0.9%氯化鈉溶液中進(jìn)行靜脈注射。當(dāng)病牛出現(xiàn)紅細(xì)胞、血紅蛋白含量顯著降低時可進(jìn)行輸血方法治療，每天輸血量為2 000 mL，連續(xù)輸血3～5 d，直到血紅蛋白恢復(fù)到25%左右。

中華泰勒蟲病的病原學(xué)和診斷技術(shù)等方面的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但還沒有有效的預(yù)防控制措施，一般是通過減少其傳播媒介的數(shù)量來減輕中華泰勒蟲病造成的危害及經(jīng)濟(jì)損失。中華泰勒蟲病的傳播媒介為蜱蟲傳播，具有一定的季節(jié)性，與蜱蟲的活動季節(jié)密切相關(guān)。在放牧?xí)r，要及時采取滅蜱措施，通過化學(xué)藥物對牛進(jìn)行噴灑和人工捕捉方法，控制本病傳播。目前，國內(nèi)還沒有中華泰勒蟲病的疫苗，因此，放牧?xí)r要注意牛頸部和大腿內(nèi)側(cè)是否有蜱蟲，如存在蜱蟲時去除體表蜱蟲?？稍诜拍燎埃瑢εＩ釃姙⑾x劑，將寄生于牛圈舍內(nèi)蜱蟲殺滅，切斷該病的傳染源。當(dāng)牛感染中華泰勒蟲后，立即停止放牧，改為舍飼，減少對蜱蟲接觸。