姜黃素對(duì)Prdx6基因介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲的調(diào)控作用*

孫樹剛 劉英琪 施 喆 周麗媛 楊 勇 王曉輝

1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院普外科 (河北 邯鄲, 056000) 2.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院婦科

肝癌是全球常見的嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取的天然酚類色素,具有廣泛的抗腫瘤作用[1-3]。研究表明,姜黃素可抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[4]。過氧化物氧化還原蛋白 6(Prdx6)是Prdx家族的一員,同時(shí)具有磷脂酶A2和過氧化物酶雙重活性,有研究報(bào)道Prdx6在肝癌患者癌組織中高表達(dá),且表達(dá)水平與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[5]。另有研究發(fā)現(xiàn),Prdx6過表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖活性、增強(qiáng)其遷移和侵襲能力[6]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在特定情況下向間質(zhì)細(xì)胞分化的現(xiàn)象,在惡性腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起重要作用。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad的喪失以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cad和Vimentin的升高是肝癌細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移的象征[7]。本研究以肝癌HepG2細(xì)胞為對(duì)象,探討姜黃素是否可通過調(diào)節(jié)Prdx6表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物行為學(xué)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 試劑和儀器 姜黃素和MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清和培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司;Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;Prdx6過表達(dá)質(zhì)粒和空白對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;兔抗人神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cad)、上皮鈣黏蛋白(E-cad)以及波形蛋白(Vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MDC公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2以及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中,每2 d更換新的培養(yǎng)基,顯微鏡下觀察,待細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行傳代,取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,參照文獻(xiàn)[8]方法,分別用0、10、20、40和60 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μl MTT溶液,重新置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,每孔加入DMSO振蕩混勻直至紫色結(jié)晶完全溶解。置于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞活力和半數(shù)抑制濃度(IC50)。根據(jù)IC50確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用40 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞,以每孔2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、姜黃素組、空載體組、Prdx6過表達(dá)組以及Prdx6過表達(dá)+姜黃素組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將過表達(dá)PIRES-EGFP-Prdx6載體轉(zhuǎn)染Prdx6過表達(dá)組和Prdx6過表達(dá)+姜黃素組細(xì)胞,24 h后,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組細(xì)胞和姜黃素組細(xì)胞加入40 μmol/L姜黃素處理24 h;空載體組細(xì)胞轉(zhuǎn)染PIRES空載體24 h;對(duì)照組細(xì)胞不做處理。24 h后,按照1.4的實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 qRT-PCR法檢測(cè)Prdx6 mRNA相對(duì)表達(dá)量 24 h后,棄掉培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次,每孔加入1 ml Trizol試劑提取總RNA,測(cè)定RNA濃度并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,GAPDH為內(nèi)參,PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),以2-ΔΔCT法計(jì)算Prdx6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將HepG2細(xì)胞按2×103/ml密度接種于24孔板,細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí),100 μl無菌槍頭垂直培養(yǎng)板底部均勻劃線,預(yù)冷PBS清洗3次,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀測(cè)劃痕寬度。細(xì)胞劃痕愈合率(%)=(0 h細(xì)胞劃痕寬度-24 h細(xì)胞劃痕寬度)/0 h細(xì)胞劃痕寬度×100%。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基稀釋(1∶3),將50 μl稀釋后的基質(zhì)膠加入到上室中,將HepG2細(xì)胞按2×103/ml密度接種于上室,每孔150 μl。Transwell下室中加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl,將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出小室,濕棉簽將未侵襲細(xì)胞擦去,多聚甲醛固定小室20 min,并用結(jié)晶紫染色15 min,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù),隨機(jī)取3～5個(gè)視野拍照。

1.9 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中各蛋白相對(duì)表達(dá)量 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,裂解液裂解,離心取上清液,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度,煮沸。120 v恒壓電泳,直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部,0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h,TBST洗膜,室溫封閉,E-cad、N-cad和Vimentin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,ECL顯色液顯影,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 不同濃度(0、10、20、40、60 μmol/L)姜黃素處理24 h后,HepG2細(xì)胞存活率(%)分別為100.00、82.05±3.55、63.76±4.13、46.70±3.50、33.98±3.28,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與0 μmol/L姜黃素組比較,各濃度姜黃素組細(xì)胞存活率降低,且具有濃度依賴性(P<0.05)。經(jīng)計(jì)算,姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50為36.87 μmol/L,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用40 μmol/L姜黃素處理細(xì)胞。

2.2 姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞Prdx6 mRNA表達(dá)的影響 Prdx6 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組(6.38±1.04)比較,姜黃素組Prdx6 mRNA(1.29±0.08)相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組Prdx6 mRNA(3.87±1.12)相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與空載體組(6.42±1.03)比較,Prdx6過表達(dá)組Prdx6 mRNA(8.97±1.10相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與Prdx6過表達(dá)組比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組Prdx6 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。

2.3 姜黃素和Prdx6表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞存活率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組(100.00%)比較,姜黃素組細(xì)胞存活率(63.65±4.05)降低(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組細(xì)胞存活率(81.86±4.01)升高(P<0.05);與Prdx6過表達(dá)組(98.79±5.36)比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。對(duì)照組、空載體組(98.21±5.22)以及Prdx6過表達(dá)組細(xì)胞存活率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 姜黃素和Prdx6表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕愈合率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組(77.82±4.25)比較,姜黃素組細(xì)胞劃痕愈合率(47.98±3.46)降低(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組細(xì)胞劃痕愈合率(65.36±4.37)升高(P<0.05);與空載體組(78.55±4.13)比較,Prdx6過表達(dá)組細(xì)胞劃痕愈合率(91.22±5.62)升高(P<0.05);與Prdx6過表達(dá)組比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05)。對(duì)照組和空載體組細(xì)胞劃痕愈合率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

2.5 姜黃素和Prdx6表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響 侵襲細(xì)胞數(shù)組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組(125.58±6.37)比較,姜黃素組侵襲細(xì)胞數(shù)(57.22±4.28)減少(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組侵襲細(xì)胞數(shù)(94.37±5.72)增多(P<0.05);與空載體組(127.33±6.56)比較,Prdx6過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05);與Prdx6過表達(dá)組(197.67±6.58)比較,Prdx6過表達(dá)+姜黃素組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。對(duì)照組和空載體組侵襲細(xì)胞數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 結(jié)晶紫染色圖

2.6 姜黃素和Prdx6表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖3 細(xì)胞中各蛋白表達(dá)電泳圖 (A為對(duì)照組,B為姜黃素組,C為空載體組,D為Prdx6過表達(dá)組,E為Prdx6過表達(dá)+姜黃素組)

3 討論

肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,具有起病隱匿、進(jìn)展速度快以及易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),臨床上治療肝癌的抗癌藥物常引起多種不良反應(yīng),且長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)耐藥性,因此尋找一種毒副作用小且有效的藥物,用于治療肝癌和提高患者生活質(zhì)量至關(guān)重要[9]。

姜黃素是從姜黃中提取得到的一種植物多酚,具有多種藥理學(xué)活性,Liang等[10]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素通過促進(jìn)HepG2細(xì)胞焦亡和凋亡,誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生死亡,從而在肝癌中發(fā)揮抗癌作用。Han等[11]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素通過下調(diào)DJ-1表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。本研究采用不同濃度姜黃素處理HepG2細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞的存活率隨姜黃素濃度的升高而降低,且具有濃度依賴性。結(jié)果表明：姜黃素可抑制肝癌細(xì)胞增殖。Prdx6是一種廣泛存在于各組織器官中的過氧化酶,由224個(gè)氨基酸組成,近年來,Prdx6在癌癥中的作用受到廣泛關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌組織中Prdx6高表達(dá),過表達(dá)Prdx6可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,抑制細(xì)胞凋亡[12]。研究表明,敲除Prdx6的HepG2細(xì)胞分裂減緩、線粒體功能發(fā)生障礙,細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,因此在肝癌中發(fā)揮抗癌作用[13]。He等[14]研究發(fā)現(xiàn),食管鱗癌組織中Prdx6表達(dá)顯著高于正常組織,過表達(dá)Prdx6可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)Prdx6在結(jié)腸癌中呈陽性表達(dá),沉默HCT-116細(xì)胞中Prdx6表達(dá)則顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲?；谝陨涎芯?我們猜測(cè)姜黃素可能通過抑制Prdx6表達(dá)從而在肝癌中發(fā)揮抗癌作用。本研究結(jié)果顯示：HepG2細(xì)胞中Prdx6過表達(dá)后細(xì)胞存活率和劃痕愈合率升高,侵襲細(xì)胞數(shù)增多,給予姜黃素處理后細(xì)胞存活率和劃痕愈合率降低,侵襲細(xì)胞數(shù)減少。結(jié)果表明姜黃素可拮抗Prdx6的促癌作用。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種具有極性的上皮細(xì)胞在某些病理情況下與微環(huán)境相互作用向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[16]。E-cad是廣泛分布在上皮組織上的一種跨膜糖蛋白,在維持上皮細(xì)胞形態(tài)和極性,以及上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮不可或缺的作用,E-cad的表達(dá)與腫瘤分化程度和發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān),表達(dá)降低或缺失導(dǎo)致癌細(xì)胞的黏附能力下降,上皮性癌細(xì)胞則順利實(shí)現(xiàn)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用,是發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵蛋白[17]。Vimentin是一種重要的骨架蛋白,在維持細(xì)胞完整性方面具有重要作用,主要表達(dá)與間充質(zhì),正常上皮組織中不表達(dá)或低表達(dá),是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白之一。N-cad也是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移[18]。Cao等[19]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素逆轉(zhuǎn)IL-6/STAT3介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制TCE誘導(dǎo)的肝癌發(fā)展。本研究結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞中Prdx6過表達(dá)后N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)升高,而E-cad蛋白表達(dá)降低,給予姜黃素處理后N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)降低,而E-cad蛋白表達(dá)升高。結(jié)果表明：姜黃素可抑制Prdx6誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

綜上所述,姜黃素可抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其可能是通過降低Prdx6表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用,為臨床治療肝癌提供新的思路。