景觀植物白粉病重寄生菌的調(diào)查及分離方法

唐曉雪,孫 璘,哈孜拉·賽依里罕,李文麗,董沛竺,任毓忠,,李國英

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆石河子 832003;2.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室,新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】白粉病是氣傳病害,植物在感染白粉病后,葉片表面被白色粉狀霉斑覆蓋,影響植物的光合作用,造成植株早衰,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)受損[1,2]。目前有多種措施防治白粉病,生物防治已是一種重要防治措施[3]。白粉病是危害植物生長、影響植物經(jīng)濟價值的病害之一,白粉寄生孢(Ampelomycesquisqualis)是一種寄生在白粉菌上的重寄生真菌,研究景觀植物白粉病重寄生菌、篩選分離培養(yǎng)基,對白粉病的生物防控有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】重寄生是生物學(xué)的特殊寄生現(xiàn)象,是一種微生物又寄生在其他微生物上的現(xiàn)象[4-5]。白粉寄生孢(Ampelomycesspp.)是白粉病菌上常見的重寄生菌,其針對白粉病菌有嚴(yán)格的寄生性,且對其所寄生的白粉菌無特異的選擇性,寄生范圍較廣,對控制植物白粉病有一定效果。已開發(fā)出多種防治白粉病的生防制劑,如:AQ10、Q-fect、POWDERYCARE、Green Biotech和AgriLife等[6]?！颈狙芯壳腥朦c】我國對白粉寄生孢的分離鑒定、生物學(xué)特性及其互作等方面已有研究,但應(yīng)用白粉寄生孢防治白粉病的研究還未見報道[7]。另外,由于白粉寄生孢具有生態(tài)的適應(yīng)性,需開發(fā)適合當(dāng)?shù)丨h(huán)境的菌株,才能更有針對性效防治當(dāng)?shù)氐陌追鄄?。新疆是我國白粉病發(fā)病較嚴(yán)重的區(qū)域,而對白粉寄生孢的研究和開發(fā)利用鮮見報道[8-11]。需豐富關(guān)于白粉寄生孢的信息資料,針對新疆石河子地區(qū)景觀植物上白粉菌重寄生菌的寄生情況進行調(diào)查?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究白粉寄生孢在當(dāng)?shù)鼐坝^植物上的重寄生狀況,分析白粉寄生孢的分離方法,為白粉寄生孢的種類確定、生防潛能的評價及生防菌株的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

調(diào)查時間為2020年9月中旬至10月下旬,田間白粉病發(fā)生后期。調(diào)查地點為石河子市公路兩旁、公園以及明珠河公園的綠化區(qū),調(diào)查對象主要為感染白粉病的落葉喬木、草本和灌木類花卉或綠化植物等18種觀賞植物。

以石河子地區(qū)每種調(diào)查對象種植區(qū)域為一個采樣點,每個采樣點的植物上隨機采集感染白粉病的植物葉片,每點至少10張葉片,所采取葉片正面白粉病粉狀霉斑覆蓋率在60%以上。采集后葉片分別用密封袋隔離裝袋,帶回實驗室內(nèi)自然風(fēng)干后待用[12-13]。

1.2 方 法

1.2.1 白粉寄生孢寄生狀況

在解剖鏡下觀察每個點采集的感染白粉病的不同植物葉片,確定是否有白粉寄生孢的寄生。白粉寄生孢寄生的主要表現(xiàn)為,白粉菌的分生孢子、菌絲、分生孢子梗上存在棕褐色白粉寄生孢的分生孢子器[14-16],觀察到葉片有白粉寄生孢褐色分生孢子器存在的區(qū)域認(rèn)定有重寄生的發(fā)生。白粉寄生孢在田間的自然寄生狀況的評價以被白粉寄生孢寄生面積占葉片上白粉菌侵染面積的百分率分級[12-13]。

0級:白粉菌上沒有白粉寄生孢寄生;

1級:被白粉寄生孢的寄生面積在10%以內(nèi);

2級:被白粉寄生孢的寄生面積占11%～25%;

3級:被白粉寄生孢的寄生面積占26%～50%;

4級:被白粉寄生孢的寄生面積51%～100%。

白粉寄生孢寄生程度計算方法參考McKinney[13]。確定每種植物白粉病上的白粉寄生孢的寄生普遍率和寄生指數(shù)(RAmpelomyces)。

式中,RAmpelomyces表示白粉病被白粉寄生孢的寄生指數(shù),Σ(c×d) × 100 中c為所收集檢查葉片中各寄生級別的葉片數(shù);d為各級別的代表值;N為所檢查的葉片總數(shù);4為分級標(biāo)準(zhǔn)的最大值。

1.2.2 白粉寄生孢的分離

1.2.2.1 分離

分離用的材料為被白粉寄生孢寄生的荷蘭菊白粉病葉片,分離用培養(yǎng)基為改良的PSA培養(yǎng)基(PSA+20 g/L麥芽提取物),制備好的培養(yǎng)基121℃滅菌20 min待用;使用前加入濃度為50 mg/L氯霉素用于抑制細(xì)菌的生長[17-20]。分離方法有(1)直接挑取分離法[21]:將供試的荷蘭菊白粉病病葉放置在解剖鏡下觀察,用滅菌挑針直接挑取葉片上的白粉寄生孢單個分生孢子器,轉(zhuǎn)移至分離培養(yǎng)基上;(2)水瓊脂過濾改良挑取法:先將解剖鏡下觀察到的白粉寄生孢分生孢子器用滅菌挑針轉(zhuǎn)移至1%的水瓊脂培養(yǎng)基(WA)上,再將水瓊脂平板置于解剖鏡下,用挑針把分生孢子器上的雜質(zhì)及多余的菌絲剝離,粘在水瓊脂培養(yǎng)基表面,最后將分生孢子器重新轉(zhuǎn)移至改良的PSA培養(yǎng)基上。每皿接10個分生孢子器,平板背面在接菌處用記號筆畫圈做標(biāo)記,每種方法4次重復(fù),分離后將平板置于25℃光暗交替(12 h/12 h)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔1 d觀察1次,記錄白粉寄生孢和雜菌的生長狀況,7 d后觀察統(tǒng)計,計算不同分離方法的分離率和污染率。

1.2.2.2 分離用培養(yǎng)基篩選

分離培養(yǎng)基篩選的材料為被白粉寄生孢寄生的同一區(qū)域采集的荷蘭菊白粉病葉片,供試培養(yǎng)基6種,分別為察氏固體培養(yǎng)基(Czapek-Dox)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA),以及分別加入20 g/L麥芽提取物的改良PDA(PDA+M)、PSA(PSA+M)和察氏(Czapek+M)培養(yǎng)基;分離方法采用1.2.2.1所描述的水瓊脂過濾挑取法,每種培養(yǎng)基以1皿為一個重復(fù),每皿接10個白粉寄生孢分生孢子器,在皿底接種的部位畫圈標(biāo)記,重復(fù)4次。后將平板置于25℃光暗交替(12 h/12 h)培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分離后7和14 d用十字交叉的方式測量菌落直徑[17],觀察記錄不同培養(yǎng)基的分離率與菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析通過MicrosoftExcel及SPSS應(yīng)用程序處理完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉寄生孢的寄生特征

研究表明,石河子地區(qū)景觀植物在9月中旬后白粉病發(fā)生較為普遍,病菌感染葉片、葉柄、花以及莖稈。光線充足時,肉眼可見病葉片表面的白粉菌顏色暗沉并有消退的跡象病葉在解剖鏡下觀察,部分白粉病菌上有明顯寄生現(xiàn)象,除了葉片正面大量寄生外,葉背面、葉柄及莖稈的發(fā)病處也有白粉寄生孢寄生,花器部位白粉病發(fā)病一般較輕,無明顯寄生狀況;白粉寄生孢的分生孢子器在白粉菌上常成片聚集分布,極少有單個分生孢子器單獨出現(xiàn);9月中旬白粉寄生孢分生孢子器偏圓潤且飽滿,10月下旬分生孢子器略瘦長。

自然寄生狀態(tài)下的白粉寄生孢分生孢子呈棕褐色,表面油亮具光澤,形狀多樣,多數(shù)呈梭形或檸檬形,部分鴨梨形還有少數(shù)為飽滿的唇形,葉片久置風(fēng)干后,分生孢子器顏色呈棕褐色稍暗,沒有光澤,不飽滿,明顯干癟。以蒸餾水為浮載劑,將白粉寄生孢的分生孢子器挑在載玻片上,用體式顯微鏡觀察單個分生孢子器,表面有不規(guī)則網(wǎng)紋,基部有短柄,頂部有或無乳突,大小為(32.4～79.2) μm×(35.6～49.5) μm,壁薄,易破裂,滲出半透明分生孢子;分生孢子單孢,長橢圓形或卵圓形,兩端具油球,大小為(7.3～9.0) μm×(3.0～4.5) μm。圖1

注:A:田間白粉病消退癥狀; B:白粉寄生孢自然條件下寄生狀況;C:白粉寄生孢分生孢子器;D:分生孢子

2.2 白粉寄生孢的寄生

研究表明,白粉寄生孢在石河子地區(qū)觀賞植物白粉菌上的寄生較普遍,平均寄生普遍率和寄生指數(shù)分別為56.69%和28.52,但不同植物白粉病上的白粉寄生孢寄生程度存在較明顯差異。其中荷蘭菊、蛇鞭菊、黑心金光菊、百日菊白粉病上白粉寄生孢的寄生程度較高,其分生孢子器的分布和數(shù)量較多,寄生率分別為92.86%、92.86%、66.67%和85.71%,平均為84.52%,寄生指數(shù)分別為49.58、41.43、45.71和37.62,平均40.92;被寄生后的白粉病菌菌絲或分生孢子顏色暗黃色,無光澤,有輕微的消退跡象。白粉寄生孢對黃刺玫、穗花婆婆納、車前草、長藥八寶、大花金雞菊白粉病的寄生程度次之,寄生率分別為51.54%、73.33%、71.43%、51.55%和68.43%,寄生指數(shù)分別為39.62、36.67、30.71、30.56、30.26,分生孢子器的分布和數(shù)量相對較少,葉片表面的白粉菌沒有明顯變化;白粉寄生孢寄生率較低的是金銀花、苜蓿、丁香、石竹、月季白粉病;對于白榆、夏橡、刺槐等喬木植物白粉病的寄生程度相對較低,寄生指數(shù)均低于20,且葉片上白粉寄生孢分生孢子器的分布和數(shù)量很少,且葉柄及莖稈上幾乎觀察不到白粉寄生孢的分生孢子器;薄荷的病葉及莖稈上均無白粉寄生孢寄生的現(xiàn)象。表1

表1 石河子地區(qū)景觀植物白粉寄生孢狀況

2.3 白粉寄生孢分離方法

2.3.1 不同分離方法對白粉寄生孢分離效果的影響

研究表明,采用直接挑取法分離時,白粉寄生孢分生孢子器表面附著大量菌絲體和雜質(zhì),由于白粉寄生孢生長極其緩慢,在接種2～4 d時,培養(yǎng)基上還未觀察到白粉寄生孢的特征菌落,接種位點和周圍已經(jīng)出現(xiàn)污染菌菌落,其中主要為鏈格孢霉菌、青霉、曲霉和細(xì)菌,污染菌生長速度明顯快于白粉寄生孢,導(dǎo)致污染菌快速占領(lǐng)白粉寄生孢周圍的培養(yǎng)基空間,從而使白粉寄生孢無法正常生長,使得純化的難度增大,14 d后白粉寄生孢被雜菌覆蓋,幾乎不可見。采用優(yōu)化挑取法分離白粉寄生孢時,在接種1～4 d時,培養(yǎng)基表面無明顯變化,雜菌出現(xiàn)的情況極少,一般為青霉菌污染,在5～7 d時培養(yǎng)基上陸續(xù)出現(xiàn)白色至米黃色突起的小點,排列密集,氣生菌絲發(fā)達,呈絨球狀,即為白粉寄生孢的菌落,剔除周邊的雜菌,可一次性得到純凈的菌株。表2

表2 不同方法下白粉寄生孢的分離變化

優(yōu)化挑取法與直接挑取法分離白粉寄生孢的分離率分別為90%和30%,2種方法之間存在極顯著的差異(P<0.01),優(yōu)化挑取法的分離率遠高于直接挑取法;優(yōu)化挑取分離法雜菌的污染率大大低于直接挑取法分離法,直接挑取法雜菌52.5%,而優(yōu)化挑取法幾乎沒有雜菌的污染。通過將白粉寄生孢的分生孢子器在水瓊脂培養(yǎng)基表面黏附過濾后,再轉(zhuǎn)移至分離培養(yǎng)基上,可以提高白粉寄生孢的分離率,有效獲得白粉寄生孢的純培養(yǎng)物。

2.3.2 不同培養(yǎng)基對分離的影響

研究表明,白粉寄生孢在供試的6種培養(yǎng)基上均會產(chǎn)生特征性的菌落,但不同培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯菌落的時間存在明顯差異,接種7 d時,PDA、Czapek+M、PDA+M和PSA+M培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯的特征性菌落,分離率在92.5%～95.0%;Czapek與PSA培養(yǎng)基上未出現(xiàn)白粉寄生孢菌落。接種14 d時,供試的6種培養(yǎng)基上均有白粉寄生孢的特征性菌落出現(xiàn),分離率在90.0%～95.0%,不同培養(yǎng)基間分離率沒有明顯的差異;白粉寄生孢在6種供試培養(yǎng)基上均能生長。

白粉寄生孢在供試6種培養(yǎng)基上的生長速度存在顯著差異,白粉寄生孢在PSA+M和Czapek+M培養(yǎng)基上的生長速度最快,菌落直徑平均分別為7.83和7.77 mm,其次為PDA+M培養(yǎng)基,菌落直徑為6.58 mm;白粉寄生孢在PDA、PSA和Czapek培養(yǎng)基上生長速度較緩慢,菌落直徑分別為2.81、1.36和1.27 mm,且在培養(yǎng)基上菌絲稀疏。

在真菌分離培養(yǎng)常用的Czapek、PDA、PSA培養(yǎng)基中加入2%的麥芽提取物可以有效改善白粉寄生孢生長速度,菌落直徑比不添加麥芽提取時分別增加了6.12、2.34和5.76倍(平均4.74倍)。在分離白粉寄生孢時,最好在培養(yǎng)基中加入適量的麥芽提取物,可有明顯提高分離的成功率。表3

表3 不同培養(yǎng)基下白粉寄生孢分離變化

3 討 論

通過對石河子地區(qū)景觀植物白粉病重寄生菌的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)在采集的18種植物白粉菌葉片中有17種上都觀察到了白粉寄生孢的重寄生。寄主植物和宿主白粉菌對白粉寄生孢的寄生程度都有明顯的影響,菊科植物白粉病菌菊苣高氏白粉菌(G.cichoracearum)上白粉寄生孢的重寄生狀況最為普遍[18-21]。以王凱濤等[22]2019年對石河子地區(qū)花卉白粉病的調(diào)查及花卉白粉病的病原鑒定為依據(jù),此次調(diào)查顯示,白粉寄生孢對不同屬白粉病菌的寄生程度存在明顯的差異。白粉寄生孢寄生率較高的白粉菌有高氏白粉菌屬(Golovinomyces)的菊苣高氏白粉菌(G.cichoracearum),平均寄生指數(shù)為43.59;白粉寄生孢對單囊殼屬(Podosphaera)的P.fusca、P.pannosa和P.fuligine等3個種的寄生程度次之,白粉寄生孢的平均寄生指數(shù)為32.89;白粉寄生孢對白粉菌屬(Erysiphe)不同種的寄生程度相對較低,除小二孢白粉菌E.biocellata上未觀察到寄生外,其余6種白粉菌被白粉寄生孢的平均寄生指數(shù)為23.34。與趙福云[8]等以及孔濤等[23]報道菊科植物與薔薇科植物上白粉寄生孢重寄生結(jié)果一致;另外植物的生長環(huán)境條件對白粉寄生孢的分布也有一定影響,例如調(diào)查中發(fā)現(xiàn),田間低矮的草本植物更容易被白粉寄生孢寄生,而大型喬木上白粉寄生孢寄生較少;在溫室大棚中采集的番茄、辣椒、甜菜、月季、四葉草白粉病的病葉上未觀察到白粉寄生孢自然寄生的現(xiàn)象。

通過對荷蘭菊上白粉寄生孢的分離表明,14 d內(nèi)在供試的6種分離培養(yǎng)基上白粉寄生孢的分生孢子器均能形成菌落,分離率均在90%及以上;添加了20 g/L麥芽提取物的Czapek、PDA和PSA培養(yǎng)基對白粉寄生孢的菌落生長有良好的促進作用,菌落直徑明顯大于未添加麥芽提取物的同類型基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

對分離白粉寄生孢常用的直接挑取法進行改良,即將白粉寄生孢的分生孢子器先在水瓊脂培養(yǎng)基表面進行雜菌剝離,再轉(zhuǎn)移至PSA+M分離培養(yǎng)基上,可以明顯提高白粉寄生孢的分離成功率,并可以有效減少雜菌的侵染覆蓋,降低菌株純化難度。

白粉寄生孢作為防治白粉病的生防菌之一,但其在植物感染白粉病的初期自然重寄生程度較低,且白粉寄生孢傳播較慢,因此在自然條件下該菌對白粉病的控制作用不明顯。通過調(diào)查篩選,分離出寄生范圍廣,活性強的菌株或通過基因改良技術(shù)來提高白粉寄生孢防治效果,將其應(yīng)用于白粉病的發(fā)病初期,才能有利于抑制白粉病的擴展蔓延。目前還缺少關(guān)于重寄生真菌對于殺菌劑的抗性及對干旱、低溫和高溫等脅迫的耐受性研究,需要對許多生物因素和非生物因素進行廣泛的研究,以提高白粉寄生孢的生物防治潛力。

4 結(jié) 論

白粉寄生孢在石河子地區(qū)景觀植物白粉病上寄生情況較為普遍,檢出率達94.4%,其中菊科植物白粉病菌菊苣高氏白粉菌(G.cichoracearum)上最易被寄生,平均寄生普遍率和寄生指數(shù)分別為84.52%和40.92。葉片、葉柄及莖稈病部可觀察到白粉寄生孢的分生孢子器,其分布多聚生(少散生),表面有不規(guī)則網(wǎng)紋,基部有短柄,頂部有或無乳突,大小為(32.4～79.2)μm×(35.6～49.5) μm;分生孢子單孢,長橢圓形或卵圓形,兩端具油球,大小為(7.3～9.0) μm×(3.0～4.5) μm。分離過程中采用水瓊脂過濾的改良方法挑取分生孢子器分離率達90%以上,添加了麥芽提取物的PSA和Czapek培養(yǎng)基可有效提升白粉寄生孢的生長速率,增幅分別為5.76倍和6.12倍。