枸杞葉HPLC特征圖譜的研究

鄭倩倩 周雪菲 路麗娟 王小芳 趙艷普

【摘 要】 ??目的： 采用HPLC法研究枸杞葉的特征圖譜。 方法： 采用HPLC法，以槲皮素為參照物，色譜柱為Agilent 5TC-C18（2）5 μm，250 mm×4.6 mm，以甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為 35 ℃。流速為1.0 mL/min。利用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）》對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。 結(jié)果： 建立了枸杞葉的HPLC特征圖譜，共確定7個(gè)特征峰，以槲皮素峰為參照（S），10批枸杞葉樣品的相似度均＞0.900。 結(jié)論： 該方法操作簡(jiǎn)便，專屬性好，可為枸杞葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 ?枸杞葉；HPLC；特征圖譜；槲皮素

【中圖分類號(hào)】R284.1 ??【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A ???【文章編號(hào)】1007-8517（2023）13-0034-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202313008

Study on HPLC Characteristic Spectra of Lycium Barbarum Leaves

ZHENG Qianqian ZHOU Xuefei LU Lijuan WANG Xiaofang ZHAO Yanpu

Shijiazhuang Food and Drug Inspection Center，Shijiazhuang 050000，China

Abstract： ?Objective ?To study the characteristic spectra of Lycium barbarum leaves by HPLC. ?Methods ?the HPLC method was used， with quercetin as the reference substance， and the chromatographic column was Agilent 5TC-C18 （2） 5 μm， 250 mm×4.6 mm， methanol-0.4%phosphoric acid solution as mobile phase， gradient elution， detection wavelength of 360 nm， column temperature of 35 ℃. The flow rate was 1.0 mL/min. The data were collated and analyzed using the similarity evaluation system of traditional Chinese medicine fingerprints （2012 Edition）. Results ?The HPLC characteristic chromatogram of Lycium barbarum leaves was established， and seven characteristic peaks were determined. With quercetin peak as reference （S）， the similarity of 10 batches of Lycium barbarum leaves samples was>0.900. ?Conclusion ?the method is simple and specific， and can provide reference for quality standard research and quality evaluation of Lycium barbarum leaves.

Key words： Lycium Barbarum Leaves； HPLC； Characteristic Map； Quercetin

枸杞葉又名天精草、地仙苗、甜菜等，為茄科植物枸杞（ Lycium chinese ?Mill）或?qū)幭蔫坭剑?Lycium barbarum ?L.）的干燥嫩莖葉，《本草綱目》中謂其味苦甘而氣涼，具除煩益志，補(bǔ)五勞七傷，壯心氣之功效，亦可“去皮骨節(jié)間風(fēng)，消熱毒，散瘡腫，除風(fēng)明目”［1］。常炒食或用作茶葉。

枸杞葉主要含有多酚類、多糖類、黃酮類、維生素、甜菜堿，還含有多種微量元素， 現(xiàn)代研究［2-8］表明，枸杞葉有抗炎抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化，抗疲勞等藥理作用，還可以用于降血脂，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。

中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，而中藥特征圖譜具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，作為一種鑒別的手段，可用于鑒別藥材真?zhèn)巍⒃u(píng)價(jià)藥材道地性以及制劑的一致性與穩(wěn)定性，是一種綜合的可量化的鑒別手段 ［9-12］。

枸杞葉作為一種傳統(tǒng)的中藥材，日漸受到關(guān)注，孟協(xié)中等［13］進(jìn)行了枸杞葉的化學(xué)成分研究，劉賽等［14］對(duì)不同產(chǎn)地枸杞葉片中多糖、總黃酮和總酚含量進(jìn)行了差異比較分析，有學(xué)者［15-16］進(jìn)行了枸杞葉的藥理活性研究，亦有學(xué)者［17-19］對(duì)枸杞葉中的黃酮提取物進(jìn)行了純化、提取工藝優(yōu)化及組成結(jié)構(gòu)分析。枸杞葉專屬性的鑒別項(xiàng)目研究未見報(bào)道，枸杞葉 特征圖譜的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亦未建立，為鑒別市面上的枸杞葉產(chǎn)品真?zhèn)?，很有必要建立其特征圖譜。本研究采用HPLC法，研究并建立枸杞葉的特征圖譜，以期更全面控制枸杞葉的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）； Satouris電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)默克公司）；FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；色譜柱Agilent 5TC-C18（2）5 μm，250 mm×4.6 mm。

1.2 試藥 對(duì)照品：槲皮素（批號(hào)100081-201509），購于中國(guó)食品藥品檢定研究院。試劑：甲醇（色譜純，Merck）；水（去離子水，電阻率≥18.2 MΩ·cm）；乙醇 （分析純，天津科密歐）；36%鹽酸（分析純，天津科密歐）；磷酸（分析純，天津科密歐）。藥材：共收集到枸杞葉藥材10批，分別來自河北（6批）、寧夏（4批）等地，經(jīng)石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心業(yè)務(wù)辦公室畢飛霞副主任藥師鑒定為茄科植物枸杞（ Lycium chinese ?Mill）或?qū)幭蔫坭剑?Lycium barbarum ?L.）的嫩莖葉。藥材信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～10 min，10%A；11～30 min，10%→35%A；31～50 min，35%→80%A；50～55 min，80%A。流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 將枸杞葉樣品粉碎，過三號(hào)篩，取粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷至室溫，再用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加入甲醇-25%鹽酸（4∶ 1）的混合溶液25 mL，加熱回流40 min，取出，放冷至室溫，分次轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制備成50 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取枸杞葉樣品粉末（GQY-6）1.0 g共1份，按照“2.2.1”項(xiàng)供試品的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各次進(jìn)樣量均為10 μL，記錄6次進(jìn)樣的HPLC圖，以5號(hào)峰（槲皮素 峰）為參照峰，分別計(jì)算7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果為相對(duì)保留時(shí)間RSD均＜0.4%，相對(duì)峰面積的RSD均＜0.5%，表明此方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取枸杞葉樣品粉末（GQY-6）1.0 g共6份，按照“2.2.1”項(xiàng)供試品的制備方法，平行操作，制備6份供試品溶液，按“2.1”色譜條件分別進(jìn)樣，各次進(jìn)樣量均為 10 μL，記錄各個(gè)HPLC圖，以5號(hào)峰（槲皮素峰）為參照峰，分別計(jì)算7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果為相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.9%，相對(duì)峰面積的RSD均＜0.6%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取枸杞葉樣品粉末（GQY-6）1.0 g共1份，按照“2.2.1”項(xiàng)供試品的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，各次進(jìn)樣量均為10 μL，記錄各個(gè)HPLC圖，以5號(hào)峰（槲皮素峰）為參照峰，分別計(jì)算7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果為相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜1.1%，相對(duì)峰面積的RSD均＜1.3%，表明此樣品的供試品溶液放置 24 h 穩(wěn)定性良好。

2.4 特征圖譜的建立及評(píng)價(jià) 分別精密稱取10批枸杞葉的樣品粉末各1.0 g，按照“2.2.1”項(xiàng)供試品的制備方法制備供試品溶液10份，按“2.1”色譜條件依次進(jìn)樣，進(jìn)樣 量均為10 μL，記錄色譜圖，將10個(gè)樣品的HPLC圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，將S1圖譜設(shè)置為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗口選擇為0.1 min，用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜（R），通過多點(diǎn)校正，進(jìn)行色譜峰匹配，共確定了7個(gè)特征峰，通過對(duì)照品比對(duì)，DAD全波長(zhǎng)掃描圖的對(duì)比，指認(rèn)了其中1個(gè)成分，為槲皮素峰（5號(hào)峰）。槲皮素作為枸杞葉中黃酮類主要成分，含量較大，出峰時(shí)間居中，分離度好，且較穩(wěn)定，故將槲皮素峰（5號(hào)峰）設(shè)為設(shè)為參照峰（S峰），計(jì)算10批枸杞葉樣品圖譜的相似度，特征圖譜疊加圖譜及相似度計(jì)算結(jié)果如圖1所示、見表2。

10批枸杞葉樣品的相似度均＞0.900，說明各批樣品成分相似度高，所建立的特征圖譜有較高的代表性，可行性好。10樣品的特征圖譜均呈現(xiàn)7個(gè)特征色譜峰，以槲皮素峰為參照峰（S），7個(gè)特征峰的平均相對(duì)保留時(shí)間分別為：0.143（峰1）、0.220（峰2）、0.443（峰3）、0.765（峰4）、1.000（S峰）、1.652（峰6）、1.886（峰7）。10批枸杞葉樣品的相對(duì)保留時(shí)間＜2.0%，說明所建立的特征圖譜重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。7個(gè)特征峰的平均相對(duì)峰面積分別為：0.233（峰1）、0.136（峰2）、0.091（峰3）、0.079（峰4）、1.000（S峰）、0.058（峰6）、0.082（峰7）。10批樣品的相對(duì)峰面積的RSD值較大，尤其是峰6，RSD值達(dá)到77.97%，說明河北產(chǎn)和寧夏產(chǎn)的枸杞葉樣品存在一定差異，而同產(chǎn)地的不同批次枸杞葉樣品差異不大，可能和地域、氣候，栽培方式不同有關(guān)。7個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積見表3、表4。

3 討論

3.1 提取溶劑、提取方式及色譜條件的優(yōu)化 提取溶劑分別考察了70%甲醇，70%乙醇，85%乙醇等，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)70%乙醇為溶劑時(shí)，出峰最多，且各峰的峰面積最大，故選擇了70%乙醇為提取溶劑。提取方式考察了加熱回流和超聲兩種提取方式，結(jié)果顯示加熱回流方式提取較完全，各峰峰面積較大，提取效果較好，料液比考察了1∶ 50，1∶ 75，1∶ 100，結(jié)果顯示料液比為1∶ 50時(shí)，提取最完全，各峰響應(yīng)值最高。通過考察不同加熱時(shí)間，最終確定了2.2.1項(xiàng)下的制備方法。

流動(dòng)相考察了甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液等不同溶劑系統(tǒng)，通過DAD檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描。又考察了不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）和流速，通過對(duì)比出峰數(shù)量、各峰響應(yīng)值大小，最終確定了2.1項(xiàng)下的色譜條件。

3.2 結(jié)果分析 本研究建立了枸杞葉的HPLC特征圖譜，并通過對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)了其中槲皮素成分。以槲皮素峰為參照峰（S），取特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間的±5%的范圍，建議7個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間分別規(guī)定為：0.14～0.15（峰1）、0.21～0.23（峰2）、0.42～0.47（峰3）、0.73～0.80（峰4）、1.000（S峰）、1.57～1.73（峰5）、1.79～1.98（峰7）。其余峰還需進(jìn)一步確證。7個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均≤2.0%，說明所建立的特征圖譜具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。產(chǎn)地分別為河北、寧夏的10批枸杞葉樣品的相似度均＞0.900，說明各產(chǎn)地枸杞葉成分相似度高，本研究所建立的特征圖譜有較好的代表性和特征性，可為枸杞葉質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2023-10-20 編輯：陶希睿）