苗藥白龍須對RA滑膜細胞STAT-3/IL-17炎癥通路的影響

楊慶萬 藍天座 安陽 謝良山 潘曉藝 仇維斌 雷玉梅

【摘 要】 ??目的： 觀察苗藥白龍須對類風濕關節(jié)炎患者滑膜成纖維細胞（RA-FLS）增殖及STAT-3相關炎癥通路的影響，揭示白龍須對RA滑膜炎癥的調控機制。 方法： 培養(yǎng)3～5代RA-FLS細胞，分為空白組（胎牛血清）、正常組（正常兔血清）、雷公藤多苷（TG）組、來氟米特（LEF）組、白龍須低劑量組、白龍須中劑量組和白龍須高劑量組，按各組劑量加含藥血清培養(yǎng)，用CCK8法檢測各組RA-FLS增殖抑制率的差異，ELISA法檢測RA-FLS與CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液中炎癥細胞因子IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α濃度，蛋白印跡法（Wersten Blots）檢測RA-FLS中pSTAT-3、SOCS-3的蛋白表達。 結果： 白龍須能夠抑制RA-FLS的增殖，降低共培養(yǎng)體系細胞上清中IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α等4種炎癥細胞因子的濃度，降低RA-FLS中pSTAT-3的表達量，同時上調SOCS-3蛋白表達。 結論： 白龍須可能通過抑制STAT-3/IL-17炎癥通路的活化發(fā)揮抗炎作用，抑制RA-FLS持續(xù)性增殖。

【關鍵詞】 ?類風濕關節(jié)炎；滑膜細胞；白龍須；信號傳導及轉錄激活蛋白3；白介素17

【中圖分類號】R285.5 ??【文獻標志碼】A ???【文章編號】1007-8517（2023）13-0017-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202313005

Effects of Bailongxu on STAT-3/IL-17 Inflammatory Pathway in RA Synovial Cells

YANG Qingwan1，3 LAN Tianzuo1* AN Yang2 XIE Liangshan3 PAN Xiaoyi3 QIU Weibin3 LEI Yumei3

1.The First Peoples Hospital of Guiyang， Guiyang 550001， China;

2.The Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China;

3.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， ?Guiyang 550025， China

Abstract： ?Objective ?To observe the effect of Miao medicine Bailongxu on the proliferation of synovial fibroblasts （RA-FLS） and the inflammatory pathway related to STAT-3 in patients with rheumatoid arthritis， and to reveal the regulation mechanism of the inflammatory pathway related STAT-3/IL-17 in synoviocytes. ?Method ?We selected 3-5 generations of RA-FLS cells， and divided them into blank group （fetal calf serum）， normal group （normal rabbit serum）， triptolide （TG） group， leflunomide （LEF） group， Bailongxu low-dose group， Bailongxu medium-dose group and Bailongxu high-dose group. The cultures were cultured according to the prescribed dose with serum. Differences in proliferation inhibition of ?RA-FLS in each groups were determined by CCK8. The concentrations of inflammatory cytokines IL-6， IL-17， IL-23， and TNF-α were determined in the supernatants jointly containing RA-FLS with CD4+ T cells by ELISA. The protein expression of pSTAT-3 and SOCS-3 in RA-FLS was detected by the protein blotting method （Wersten Blots）. Results ?It could inhibit the proliferation of ?RA-FLS， ?reduce the concentration of four inflammatory cytokines： IL-6， IL-17， IL-23， and cell-TNF-α， and reduce pSTAT-3 expression and upregulate the SOCS-3 protein expression in RA-FLS. Conclusion ?It may exert an anti-inflammatory effect and inhibit RA-FLS persistent proliferation by inhibiting the activation of STAT-3 / IL-17 inflammatory pathway.

Key words： Rheumatoid Arthritis;Synovial Cells;Bailongxu;Signal Transducer and Achtivator of Transcription 3;Interleukin 17

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種由T細胞、B細胞等多種免疫細胞參與的自身免疫性疾病，該病主要病理特征是關節(jié)滑膜炎，滑膜細胞惡性增殖，形成血管翳并逐漸侵蝕關節(jié)軟骨與骨組織，最終導致關節(jié)畸形、殘廢［1］。流行病學顯示［2-3］，我國RA的患病率逐年上升，隨著人口規(guī)模不斷增多，目前我國RA的患病率為0.42%左右，其中致殘率約50.3%。RA病情控制對患者的預后和生活質量極為關鍵，控制炎癥狀態(tài)可以延緩關節(jié)損害和系統性損傷。白介素17（interleukin 17，IL-17）對RA發(fā)病發(fā)揮著重要作用，而信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and achtivator of transcription 3，STAT-3）是IL-17分泌及細胞炎癥信號傳遞的關鍵調節(jié)蛋白。細胞微環(huán)境異常表達IL-6時，滑膜等細胞膜表面的受體與之結合，形成IL-6/IL-6R復合物，進一步激活細胞膜表面糖蛋白130（Glycoprotein130，gp130），gp130與細胞膜中的Janus激酶（janus achtivated kinase，JAK）密切相聯，可招募STAT-3并使其磷酸化，從而激活JAK/STAT信號通路，誘導合成IL-6、IL-17、IL-21、23等致炎因子［4］。細胞因子信號蛋白抑制分子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS-3）是依賴STAT-3磷酸化的重要調控因子，是STAT-3信號通路的抑制蛋白［5］。干預STAT-3/IL-17信號通路，可以調節(jié)IL-17等炎癥細胞因子釋放，控制滑膜炎癥。白龍須為八角楓［ Alangium chinense ?（Lour.） Harms］的須根，又稱白金條、白筋條，具有祛風除濕、舒筋通絡、散瘀止痛等功效，是苗醫(yī)運用攻毒法治療風濕疼痛的常用藥物，研究顯示白龍須對類風濕關節(jié)炎患者及CIA模型大鼠有較好抗炎止痛效果，但具體機制的相關報道較少，故本文通過建立類風濕關節(jié)炎滑膜細胞（RA-FLS）模型，給予相應兔含藥血清干預，觀察對RA-FLS增殖、炎癥因子及關鍵蛋白pSTAT-3、SOCS-3的影響，探討白龍須的抗炎機制。

1 材料和方法

1.1 制備滑膜細胞及傳代、培養(yǎng) 滑膜取自于貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院骨二科行關節(jié)置換的RA患者，患者符合美國風濕病學會/聯合歐洲抗風濕病聯盟（ACR/EULAR）2009年類風濕關節(jié)炎分類標準，簽署患者知情同意書（院內倫理批號：PY2019054）。取RA患者關節(jié)滑膜組織，PBS溶液浸泡轉運，剔除電刀切除產生的燒焦組織、血凝塊、脂肪等其他組織，剁切成約1 mm3的組織塊，加入培養(yǎng)液制成勻漿，勻漿涂抹在細胞培養(yǎng)瓶底部，置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱孵養(yǎng)，倒置顯微鏡看到組織塊周圍增生出梭狀細胞，經Vimentin免疫細胞化學染色鑒定陽性（胞漿大量棕黃色顆粒），即得原代細胞。待梭型RA-FLS長滿瓶底的90%以上時，加入0.25%EDTA胰酶消化細胞，倒置顯微鏡看到梭狀結構變圓、間距增大及較多細胞呈圓顆粒狀隨培養(yǎng)液流動時加入培養(yǎng)液終止消化，低溫離心6 min，去上清后加入培養(yǎng)液吹打混勻，按1∶ 2進行傳代。按3 mL/瓶（25 cm2）加培養(yǎng)液，隔5d換液，或培養(yǎng)液顏色變?yōu)殚偕髶Q液。取3～5代RA-FLS用于后續(xù)試驗。

1.2 藥物與試劑 來氟米特片購自蘇州長征-欣凱制藥有限公司（批號190607），雷公藤多苷片購自貴州漢方制藥有限公司（批號1410044）， 白龍須取自八角楓科植物八角楓的須根。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗購自美國GIBCO公司，CCK8試劑盒購自APExBIO，細胞周期試劑盒購自BD Pharminen，Wersten Blots抗體購自CST，ECL試劑盒、快轉液購自美國BIO-RAD公司，RIPA裂解液、一抗/二抗稀釋液、封閉液、TEMED 、APS 、BCA測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購自Immobilon，10X TBST、PBS溶液購自北京索萊寶科技有限公司，Elisa試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司。

1.3 制備含藥血清 新西蘭大白兔18只（貴州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，免檢合格，許可證號：SCXK［黔］2020-0001），雄性，SF級，隨機分為6組，每組3只，即正常組、雷公藤多苷組（tripterygium glycoside，TG）、來氟米特組（leflunomide，LEF）、白龍須低劑量組、白龍須中劑量組、白龍須高劑量組。根據人與兔體質量換算各組給藥量，白龍須組灌服白龍須提取物溶液（成人每日用藥量6 g，據人與兔換算系數 W =3.08［6］，低、中、高分別為每日每千克用量0.1 g、0.3 g和1 g），TG組灌服雷公藤多苷水懸液3 mg/（kg·d），LEF組灌胃來氟米特片懸混液1 mg/（kg·d），正常組不予藥物灌胃，連續(xù)1周， 于末次給藥2 h后無菌條件下心臟取血，2000轉/分離心分離血清，組內血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，水浴鍋100 ℃滅活，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CD4+T細胞的獲取和制備 RA患者靜脈血4 mL，加入PBS 4 mL混勻，沿試管內側壁緩慢加入含同等體積Ficoll試管，常溫離心20 min，吸取管中呈白膜狀的交界層至另一試管，加入4倍體積PBS，離心10 min棄上清，進行細胞計數。加入Buffer 80 μL重懸細胞，加入CD4磁珠 20 μL混勻后4 ℃靜置15 min，Buffer洗滌、重懸細胞，固定MS分選柱，Buffer清洗1次，將細胞懸液加入MS柱，待懸液流凈后加入清洗MS柱，重復3次，取下分選柱加入Buffer 1 mL，用力迅速下壓分選柱活塞，即得到到CD4+T細胞。

1.5 CCK8法檢測滑膜細胞增殖抑制率 取3～5代RA-FLS，計數后按5×103個/孔接種至96孔板。設置空白組、正常組、TG組、LEF組、白龍須低劑量組、白龍須中劑量組、白龍須高劑量組等7組，其中空白組予胎牛血清、正常組予正常兔血清，對照孔接種細胞后加入普通培養(yǎng)液，另設校正孔（不接種細胞），每組6孔，配制相應濃度培養(yǎng)液，每孔加入適量各濃度培養(yǎng)液（與細胞懸混液共200 μL），空白孔加入PBS，恒溫箱孵育24 h，每孔加入加入CCK8試劑溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，酶標儀450 nm檢測OD值，細胞抑制率=（空白孔-實驗孔）/空白孔×100%。

1.6 ELISA法檢測共培養(yǎng)體系細胞上清相關細胞因子 取3～5代RA-FLS，計數后按1×105個/孔接種至6孔板，每孔加入CD4+T細胞1×106，實驗分組及給藥方法同1.4。各組加入含藥血清培養(yǎng)液1 mL后孵育48 h，取培養(yǎng)液4 ℃、1500轉/分離心8 min去除雜質后即得細胞上清。取板條置于室溫下平衡30 min，設置標準孔和樣品孔，每孔設置2個復孔，按說明書酶標儀450 nm處測各孔OD值。繪制標準曲線，運用EXCEL以標準品濃度為X軸、標準孔OD值為Y軸繪制回歸曲線，得到函數計算各孔濃度。

1.7 Wersten Blots檢測SOCS-3、pSTAT-3表達量 按5×105個/瓶將RA-FLS置于25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，實驗分組及給藥方法同1.4。恒溫箱孵育24 h后每瓶加入3 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。消化、離心收集細胞，加入細胞裂解液3 mL，冰上靜置15 min，4 ℃、12000轉/分離心5 min，取上清進行BCA定量加入5X Loading buffer，煮沸后迅速冰浴。制膠進行SDS-PAGE電泳，用半干轉法電轉至激活的PVDF膜，將轉好的PVDF膜鑷子取出置于定性濾紙，手術刀片切出目標條帶，置于分格盒，加快轉封閉液3～4 mL，置于脫色搖床，p-STAT-3條帶搖5 min，SOCS-3與內參（兔抗GAPDH）條帶搖15 min。封閉完成后吸除封閉液，每格加入對應的一抗溶液4 mL，4 ℃靜置過夜后加TBST溶液4 mL搖蕩5 min洗滌三次，加二抗溶液4 mL搖蕩1 h。將轉印膜置于潔凈曝光板，滴加適當顯影劑，Bio-Rad ChemiDocTM Touch 超靈敏多功能化學發(fā)光成像系統曝光機板上進行曝光、測取各條帶的標準化光密度值。WB結果相對值=目標蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

1.8 統計學分析 所有實驗數據用SPSS22.0進行統計分析。對上述數據進行正態(tài)性檢驗，若 P >0.05即為符合正態(tài)性分布，所有數據均符合正態(tài)分布。數據采用單因素方差分析，分析結果以均數加減標準差（ x ±s ）進行記錄， P ＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 白龍須對RA-FLS增殖抑制率的影響 干預24 h并加入CCK8試劑反應4 h，將96孔板上酶標儀檢測，450 nm測得各組OD值，結果見表1。與空白組、正常組比較，各組對RA-FLS抑制率明顯升高（ P ＜0.05）；白龍須低劑量組低于其余治療組，白龍須高劑量組抑制率顯著高于TG組、LEF組（ P ＜0.05），TG組、LEF組、白龍須中組組間無統計學差異（ P ＜0.05）。

2.2 ELISA法檢測細胞上清相關細胞因子 干預48 h后，取細胞上清用Elisa法檢測IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α的濃度，結果見表2。各組IL-6濃度結果顯示：TG組、LEF組、 白龍須中劑量組、白龍須高劑量組與空白組、正常組比較有統計學差異（ P＜ 0.05），白龍須中劑量組、白龍須高劑量組明顯高于TG組、LEF組（ P ＜0.05），白龍須低劑量組IL-6下降不明顯（ P ＞0.05）。IL-17濃度：各治療組與正常組比較明顯降低（ P ＜0.05），白龍須高劑量組明顯低于TG組、LEF組（ P ＜0.05），白龍須中劑量組低于TG組（ P ＜0.05），但TG組、LEF組、白龍須低劑量組組間無明顯差異（ P ＞0.05）。IL-23濃度：各治療組顯著低于正常組（ P ＜0.05），但治療組間比較無統計學差異（ P ＞0.05）。TNF-α濃度：各治療組與正常組比較明顯降低（ P ＜0.05），白龍須高劑量組明顯低于其他治療組（ P ＜0.05），除白龍須高劑量組外其他治療組組間濃度無明顯差異（ P ＞0.05）。

2.3 Wersten Blots檢測SOCS-3、pSTAT-3 給藥48 h后，Wersten Blots法檢測各組細胞中pSTAT-3、SOCS-3蛋白的表達量，結果見表3，如圖1。各治療組pSTAT-3蛋白表達絕對值與相對值均明顯低于空白組、正常組（ P ＜0.05），白龍須中劑量、高劑量組顯著低于其他3個治療組（ P ＜0.05）。在SOCS-3絕對值與相對值方面，各治療組與空白組、正常組比較均能明顯增加;RA-FLS中SOCS-3的表達，以白龍須中劑量組、白龍須高劑量組表達量最高；白龍須低劑量組與LEF組、TG組比較無差異（ P ＞0.05）。內參（兔抗GAPDH）各組間比較均差異無統計學意義。

3 討論

RA是一種以對稱性關節(jié)炎為特征的免疫系統疾病，主要病理基礎是持續(xù)性滑膜炎，具體病因及發(fā)病機制尚未明確。研究［7］顯示，高度異常表達的細胞因子在RA疾病過程中發(fā)揮著重要的作用，以TNF-α、白介素家族為代表的炎癥細胞因子既是炎癥發(fā)生的關鍵原因，也是炎癥反應的重要產物。高水平的IL-6作用于滑膜細胞，導致滑膜組織及周圍結締組織的血管通透性增加，從而出現關節(jié)腫脹、疼痛。未受控制的炎癥過程是RA引起全身器官損傷的主要原因，控制炎癥反應即可有效控制RA病情進展，STAT-3/IL-17通路是最為經典的炎癥調控通路之一，干預該路徑能有效促使RA緩解。在STAT-3/IL-17信號通路中，IL-6是上游刺激因子，通過關鍵蛋白STAT-3調節(jié)TNF-α、IL-17、IL-23等下游效應細胞因子的釋放和表達，該過程受SCOS-3的負反饋調節(jié)，如圖2所示。

STAT-3是STAT家族7個成員中生物活性最強的成員，Tomoaki等［8］研究報道了IL-6過度表達，游離性IL-6與其受體結合后提升細胞膜表面gp130活性，招募并磷酸化STAT蛋白，激活JAK/STAT信號通路，促使CD4+T細胞誘導向Th17分化，合成IL-6、IL-17、IL-23等致炎因子，促使CD4+T細胞誘導向Th17分化，合成IL-6、IL-17、IL-23等致炎因子。RA患者外周血中STAT-3通路過度活化，運用STAT-3抑制劑可以令RA患者T細胞功能得到恢復［9］。SOCS家族是JAK/STAT信號傳導通路的主要抑制機制，可以對炎癥細胞因子激發(fā)的免疫反應進行精準的負反饋調節(jié)［10-12］。SOCS1、SOCS-3是SOCS家族8個成員中活性最高的2個成員，SOCS-3可以直接與被激活的細胞因子相關受體如Toll樣受體等結合，競爭性抑制JAK酶和STAT-3蛋白與相應位點結合，從而阻斷JAK/STAT-3通路的傳導途徑，介導細胞的增殖、分化和凋亡。SOCS-3失活將使JAK/STAT通路的抑制調節(jié)路徑減弱，導致RA患者關節(jié)滑膜的持續(xù)惡性增生、炎癥放大，而運用JAK酶抑制劑前激活SOCS-3的高表達比單用JAK拮抗劑的效果更優(yōu)［13］。

IL-17是以二聚體形式存在的一類致炎因子，與IL-17R結合后發(fā)揮生物學作用，RA活動期患者血漿、關節(jié)液及滑膜組織中均有高水平的IL-17和IL-17R。2005年科學家在膠原蛋白誘導關節(jié)炎（CIA）等免疫性疾病模型中發(fā)現IL-17主要由新的輔助性T細胞亞群即Th17分泌［14］，后續(xù)研究［15］發(fā)現在IL-23的參與下γδT淋巴細胞通過維甲酸相關孤核受體α（retinod id receptor related orphan receptor α，RORα）途徑可以增加IL-17的分泌。IL-17刺激角質細胞釋放細胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達促進T細胞的活化增殖，使得大量的T細胞、粒細胞被集附到關節(jié)滑膜等組織，造成滑膜炎；在TNF-α等其他因子的協同作用下，IL-17促使滑膜細胞合成前列腺素（PG）、MMP1等炎癥介質，擴大炎癥反應，造成軟骨和骨質的破壞，加重免疫系統損傷。TNF-α作為一種多肽類促炎因子，主要參與了RA的炎癥過程和骨質破壞。在活動期的RA患者血清中TNF-α水平明顯高于低活動度RA患者［16］。TNF-α的高表達促進了粘附因子分泌，進而誘導滑膜成纖維細胞的增殖和活化，導致滑膜進行性增生。

RA在苗醫(yī)理論中被稱為冷骨風、骨節(jié)風、貓頭風，外界潮濕之氣侵襲人體，或體內水氣太過，聚為濕毒，夾雜風毒、冷毒，留滯于骨節(jié)、筋脈，氣血瘀阻于關節(jié)，出現關節(jié)疼痛、麻木、活動不利等不適，這與“風、寒、濕邪合而為痹”的中醫(yī)理論在一定程度上相一致，與當今感染、抗原等外因啟動關節(jié)滑膜炎癥的認識亦有相通之處。攻毒法是指苗醫(yī)藥理論中運用有毒藥物去攻除致病毒素的一種治法，有毒之物藥力峻猛、易傷人體，但合理使用能夠起到療頑疾、起沉疴之效，在跌打損傷、風濕痹痛等損傷嚴重或病勢纏綿難愈的疾病中常常使用攻毒法［17］。白龍須是苗醫(yī)運用攻毒法治療風濕疼痛的常用藥物之一，含有八角楓堿、水楊苷、馬錢子苷酸等多種化合物，其中水楊苷、馬錢子苷酸有很好的抗炎作用，八角楓堿又稱毒藜堿，是引起八角楓毒性的主要原因［18-19］。白龍須有效成分的藥理作用主要包括肌肉松弛、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抑制呼吸及中樞等［20］。張威等［21］采用熱板法和扭體法考察白龍須總提物對小鼠的鎮(zhèn)痛作用，采用二甲苯引起小鼠耳廓腫脹實驗觀察白龍須總提物的抗炎作用，結果表明白龍須總堿具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。江勇等［22］通過研究證實了白龍須提液能夠減輕 CIA模型大鼠的炎癥反應、關節(jié)軟骨退化及骨破壞，而其機制可能與下調血清中IL-1β、TNF-α水平，調節(jié)OPG／RANKL／RANK通路平衡有關。徐李玲等［23］將白龍須蒸煮、濃縮制成膠丸，用于治療CIA大鼠并與雷公藤多苷比較，發(fā)現白龍須丸劑及雷公藤多苷組均顯著降低CIA大鼠血清IL-6水平 ，同時降低大鼠踝關節(jié)滑膜組織IL-6、TLR4蛋白表達及IRAK1、TLR4 mRNA相對表達量，提示白龍須可能通過抑制炎癥因子水平及NF-κB信號通路的激活發(fā)揮對RA的治療作用。

本研究發(fā)現，白龍須不同濃度對滑膜細胞增殖均有抑制作用，并呈劑量依賴特征，標準劑量及3倍劑量白龍須的增殖抑制作用優(yōu)于RA臨床運用較廣的雷公藤多苷和來氟米特。進一步對STAT-3/IL-17炎癥通路研究發(fā)現，白龍須能抑制RA-FLS中pSTAT-3蛋白的表達，而該通路的負調控蛋白SOCS-3表達量增加，同時RA-FLS與CD4+T細胞共培養(yǎng)體系上清中的上下游細胞因子濃度均明顯降低，低劑量白龍須與雷公藤多苷、來氟米特的差異不明顯，但標準劑量白龍須和高劑量白龍須對相應蛋白和細胞因子IL-6、IL-17的調控效果均優(yōu)于雷公藤多苷、來氟米特，提示白龍須能較好地下調滑膜細胞STAT-3/IL-17炎癥通路活化水平，可能抑制CD4+T細胞向Th17轉化，減少RA-FLS釋放炎癥細胞因子，進而有效控制滑膜炎癥。

本研究也存在一定不足，細胞模型不一定能完全反應人體在體實驗和動物模型試驗的情況，存在局限性，因此需要在臨床試驗和動物模型中進一步驗證和探討白龍須對STAT-3/IL-17炎癥通路的關鍵蛋白和細胞因子的調控作用。但是，本研究證實了白龍須對滑膜細胞STAT-3/IL-17炎癥通路具有抑制作用，能阻斷炎癥信號傳導，控制滑膜持續(xù)性炎癥。

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（收稿日期：2022-10-19 編輯：劉 斌）