青光眼模型中線粒體自噬與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的關(guān)系

馬海霞 胡欣欣 陸勤康

青光眼是以特征性視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，是導(dǎo)致不可逆性失明的主要原因[1]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal ganglion cells，RGCs）的進(jìn)行性丟失是各類青光眼視神經(jīng)損傷病理生理改變中的關(guān)鍵因素[2-3]。目前認(rèn)為高眼壓是青光眼主要的危險(xiǎn)因素，也是目前臨床上唯一可治療的病因，然而即使給予確診患者降眼壓的治療，仍不能阻止RGCs的死亡及其軸突的損害，一部分患眼視功能仍繼續(xù)惡化[4]。保留RGCs的功能對于視覺信息傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)而言至關(guān)重要，任何損傷導(dǎo)致眼與腦之間連接的改變都會(huì)對視覺產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5]。因此，探究青光眼RGCs的死亡機(jī)制目前仍是青光眼領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

線粒體自噬是一種選擇性自噬，通過自噬機(jī)制選擇性清除受損線粒體或功能障礙線粒體，在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中起到重要作用[6]。已有研究表明線粒體自噬可促進(jìn)帕金森病和阿爾茨海默癥中神經(jīng)元的存活[7]，提示線粒體自噬在神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護(hù)中起著重要作用。因此線粒體自噬在青光眼的發(fā)病機(jī)制中的作用也逐漸受到關(guān)注?，F(xiàn)筆者將各類青光眼模型中線粒體自噬與RGCs的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 線粒體自噬

1.1 線粒體自噬的定義

線粒體參與體內(nèi)多種重要的細(xì)胞過程，包括能量生成、代謝產(chǎn)物合成以及細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)[8]。因此，維持體內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)十分重要。線粒體自噬以選擇性自噬的形式清除體內(nèi)缺陷或功能障礙的線粒體，有助于維持線粒體質(zhì)量和多種細(xì)胞類型中的線粒體數(shù)量控制的選擇性降解機(jī)制[9]。研究表明線粒體自噬介導(dǎo)的線粒體清除在早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[6]。隨著對線粒體自噬的深入研究，近年來研究者們發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬功能障礙與神經(jīng)退行性疾病、癌癥、糖尿病等多種疾病的病理機(jī)制相關(guān)[10]。

1.2 線粒體自噬的機(jī)制

線粒體自噬通過特異性的線粒體外膜受體或與線粒體表面蛋白結(jié)合的泛素分子促進(jìn)其在線粒體周圍形成自噬體。在酵母中，線粒體外膜蛋白自噬相關(guān)基因32（Mitochondrial outer membrane protein autophagy-related gene 32，Atg32）與線粒體表面的Atg8和Atg11相互作用觸發(fā)線粒體自噬機(jī)制。哺乳動(dòng)物的線粒體自噬途徑主要分為2 類：①受體介導(dǎo)途徑：主要有BNIP3（Bcl-2/E1b19kDa-interacting protein 3）和NIX（Bcl-2/E1B19kDa-interacting protein3-like，又稱BNIP3L）依賴性線粒體自噬以及FUNDC1（FUN14 domain containing 1）介導(dǎo)的線粒體自噬；②泛素介導(dǎo)途徑：主要為PINK/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬[11]。本文主要介紹哺乳動(dòng)物中的線粒體自噬機(jī)制。

1.2.1 受體介導(dǎo)的線粒體自噬 BNIP3、NIX/BNIP3L和FUNDC1 都具有LC3 結(jié)合基序（LC3-interacting region，LIR），起到自噬受體的作用，可直接結(jié)合LC3（哺乳動(dòng)物Atg8同源物）激活線粒體自噬[12]。

BNIP3 與NIX是缺氧條件下線粒體高效周轉(zhuǎn)所必需的。目前的研究表明在低氧條件下BNIP3表達(dá)上調(diào)并錨定在線粒體外膜（Outer mitochondrial membrane，OMM）上，促使線粒體通透性過渡孔開放、線粒體膜電位去極化以及招募LC3/GABARAPs形成自噬小體，從而誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[13]。NIX與BNIP3具有56%同源性，NIX與缺氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡、肥厚性心肌病以及紅細(xì)胞發(fā)育有關(guān)[14]。FUNDC1是1種具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的線粒體外膜蛋白，在線粒體解耦聯(lián)、缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬以及父系線粒體清除中起著線粒體自噬受體的作用[15]。在缺氧或線粒體跨膜電位下降時(shí)，線粒體磷酸酶增強(qiáng)FUNDC1與LC3的相互作用，從而促進(jìn)線粒體自噬[16]。

1.2.2 泛素介導(dǎo)的線粒體自噬 PINK/Parkin依賴性線粒體自噬是由PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）和Parkin（Parkin RBR E3ubiquitin protein ligase，PRKN，又稱Parkin）介導(dǎo)的線粒體自噬途徑。PINK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，表達(dá)于線粒體外膜，感知線粒體跨膜電位變化；Parkin是E3泛素連接酶，主要位于細(xì)胞質(zhì)[17]。在線粒體受到損傷時(shí)，線粒體膜電位下降發(fā)生去極化，PINK1積聚在OMM上，導(dǎo)致已附著在OMM上的泛素分子磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Parkin由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體，并觸發(fā)其泛素連接酶活性，隨后Parkin泛素化線粒體外膜蛋白，招募自噬受體蛋白，例如optineurin（OPTN）、P62以及自噬受體核點(diǎn)蛋白52（Nuclear dot protein 52，NDP52，又稱CALCOCO2）結(jié)合于線粒體上，誘導(dǎo)下游自噬相關(guān)蛋白LC3 包裹線粒體形成自噬體，并通過溶酶體降解[18]。此外，Lazarou等[19]研究表明，parkin也可以獨(dú)立于PINK1直接招募NPD52和optineurin蛋白到線粒體誘導(dǎo)線粒體自噬。

2 線粒體自噬與RGCs

2.1 RGCs的特殊代謝需求

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分，被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物代謝最活躍的部位之一。RGCs是視網(wǎng)膜唯一的傳出神經(jīng)元，RGCs軸突形成視神經(jīng)并將視覺信息經(jīng)視覺通路傳遞到大腦的高級(jí)視覺處理中樞[20]。RGCs軸突、郎飛結(jié)以及軸突末梢的無髓鞘區(qū)需要高密度的線粒體用以滿足神經(jīng)纖維傳導(dǎo)和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的高能量需求，因此RGCs容易受到氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙的影響[21]。

2.2 線粒體自噬參與RGCs發(fā)育與分化

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬對RGCs發(fā)育、分化過程起著至關(guān)重要的作用[22-23]，如Esteban-Martinez等[22]研究發(fā)現(xiàn)小鼠RGCs的分化及發(fā)育過程受線粒體自噬調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)觀察到RGCs分化過程中線粒體數(shù)量減少而抑制線粒體自噬則減弱RGCs分化；在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育早期階段，微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3（MAP1LC3/LC3）積累，基礎(chǔ)自噬通量增強(qiáng)，線粒體自噬相關(guān)因子NIX、PINK及Parkin表達(dá)增加，RGCs自噬小體內(nèi)觀察到線粒體，且在溶酶體降解功能受到抑制后，線粒體數(shù)量增加，提示RGCs發(fā)育過程中線粒體數(shù)量減少是由線粒體自噬介導(dǎo)。當(dāng)組織發(fā)生缺氧時(shí)，BNIP3L/NIX表達(dá)增加影響RGCs正常發(fā)育過程[23]。由此可見，線粒體自噬是RGCs正常分化及發(fā)育過程中不可缺少的重要部分。

2.3 線粒體自噬與視神經(jīng)退行性疾病

近年來研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程中RGCs的損傷可能與線粒體自噬有關(guān)。遺傳性線粒體缺陷與多種視神經(jīng)疾病相關(guān)，包括Leber遺傳性視神經(jīng)?。↙eber's hereditary optic neuropathy，LHON）以及常染色體顯性視神經(jīng)萎縮（Autosomal dominant optic atrophy，ADOA）。LHON以RGCs變性和無痛性中央視力喪失為特征，其中mtDNA點(diǎn)突變被認(rèn)為與線粒體功能障礙直接相關(guān)[24]。研究發(fā)現(xiàn)攜帶LHON特異性mtDNA突變的細(xì)胞線粒體自噬顯著受損，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；而激活線粒體自噬可改善線粒體缺陷，從而提高攜帶mtDNA突變細(xì)胞的存活率[25]。ADOA是一種常見的遺傳性視神經(jīng)病變，研究發(fā)現(xiàn)大約75%的病例是由線粒體蛋白OPA1基因突變引起的[26]，主要影響RGCs其軸突退化導(dǎo)致視力障礙。研究發(fā)現(xiàn)OPA1突變或缺失導(dǎo)致小鼠和線蟲的RGCs中存在不受調(diào)控的線粒體自噬[27]。通常，線粒體自噬與神經(jīng)保護(hù)相關(guān)，然而不受調(diào)控的線粒體自噬會(huì)降低線粒體密度，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[7]。上述研究表明，線粒體自噬的穩(wěn)態(tài)在視神經(jīng)退行性疾病中對于維持線粒體功能以及細(xì)胞活性的作用是不可忽視的。

3 青光眼模型中的RGCs與線粒體自噬

人類視網(wǎng)膜約有150萬個(gè)RGCs，由于正常生理衰老，每年RGCs損失量約為0.4%，而在青光眼患者中每年損失可達(dá)4%[28]。因此，探尋視網(wǎng)膜神經(jīng)元的潛在保護(hù)機(jī)制對青光眼的治療具有重要意義。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在青光眼視神經(jīng)病變中，眼壓升高導(dǎo)致RGCs軸突橫切面增加，單位面積的視神經(jīng)內(nèi)線粒體數(shù)量減少，導(dǎo)致RGCs軸突損傷，由于RGCs軸突損傷先于RGCs死亡，也有研究者認(rèn)為受損神經(jīng)元的線粒體從視神經(jīng)頭的軸突脫出，并以溶酶體融合的方式被鄰近膠質(zhì)細(xì)胞降解。近年來的研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬參與青光眼中RGCs的損傷。

3.1 谷氨酸興奮毒性模型

不斷有研究者發(fā)現(xiàn)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對于谷氨酸興奮毒性細(xì)胞模型中的RGCs具有一定的保護(hù)作用。谷氨酸是視網(wǎng)膜中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要由光感受器細(xì)胞、雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞釋放[29]。1957 年，Lucas和Newhouse首次觀察到注射谷氨酸后視網(wǎng)膜內(nèi)層出現(xiàn)顯著的細(xì)胞丟失[30]，隨著研究深入，谷氨酸興奮毒性被認(rèn)為是青光眼性視神經(jīng)退行性變的重要病理生理機(jī)制之一。Hu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸興奮毒性青光眼細(xì)胞模型中RGCs軸突中線粒體數(shù)量明顯增加，線粒體膜電位去極化，線粒體自噬相關(guān)parkin和optineurin蛋白表達(dá)上調(diào)；而parkin過表達(dá)可以恢復(fù)谷氨酸興奮毒性下RGC中線粒體膜電位水平，對RGCs具有保護(hù)作用；在N-甲基-D天冬氨酸（N-Methyl-Daspartic acid，NMDA）誘導(dǎo)的興奮毒性青光眼模型中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)parkin可以促進(jìn)線粒體自噬，減少RGCs凋亡。Dai等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸興奮毒性作用下，parkin過表達(dá)可上調(diào)RGCs中LC3-II/LC3-I比值和溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1水平，同樣提示parkin過表達(dá)對RGCs具有保護(hù)作用。上述研究表明線粒體自噬對于谷氨酸興奮毒性青光眼模型中在線粒體功能以及減少RGCs死亡等方面具有一定積極作用。

3.2 DBA/2J小鼠模型

近年來研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬功能障礙導(dǎo)致受損的線粒體不斷累積，可能對RGCs活性具有一定影響。Kim等[33]在DBA/2J小鼠青光眼模型中發(fā)現(xiàn)眼壓升高后活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加，氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，DBA/2J小鼠的RGCs軸突和樹突中線粒體形態(tài)異常，RGCs死亡數(shù)量增多，提示眼壓升高后RGCs中受損線粒體數(shù)量增加可能影響RGCs的存活。Coughlin等[34]在DBA/2J小鼠繼發(fā)性青光眼模型中發(fā)現(xiàn)，眼壓升高后各年齡段的視神經(jīng)中存在線粒體自噬功能障礙，具體表現(xiàn)為線粒體自噬體及線粒體數(shù)量均增加，而LAMP1表達(dá)下降，提示受損線粒體并沒有被線粒體自噬體有效回收。以上研究表明受損線粒體積累會(huì)對RGCs活性產(chǎn)生一定影響，線粒體自噬途徑缺陷可能引起青光眼神經(jīng)退行性變。

3.3 UCP2敲除小鼠模型

研究發(fā)現(xiàn)UCP2 缺失的視網(wǎng)膜對青光眼的抵抗性與線粒體自噬相關(guān)。線粒體功能障礙可導(dǎo)致ROS水平增加，線粒體解偶聯(lián)蛋白2（Mitochondrial uncoupling protein 2，UCP2）基因在多種組織中表達(dá)，UCP2降低電子傳遞鏈效率，增加能量消耗，減少ROS生成[35]。Hass和Barnstable[36]通過在UCP2 敲除小鼠的前房注射微珠建立青光眼模型，發(fā)現(xiàn)UCP2缺失的青光眼小鼠模型的視網(wǎng)膜氧化損傷明顯減少，同時(shí)RGCs中的線粒體自噬增強(qiáng)，受損線粒體被及時(shí)清除，避免RGCs進(jìn)一步損傷。

3.4 慢性高眼壓SD大鼠模型

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)parkin介導(dǎo)的線粒體自噬通路可能有助于慢性青光眼大鼠RGCs的保護(hù)。Dai等[32]通過角膜緣激光光凝小梁網(wǎng)建立慢性高眼壓模型，發(fā)現(xiàn)眼壓升高后視神經(jīng)中受損線粒體及功能障礙線粒體數(shù)量增加，RGCs死亡數(shù)量增加，RGCs細(xì)胞中觀察到大量的自噬體以及線粒體自噬體，同時(shí)LC3-II/LC3-I比例增加，LAMP1 表達(dá)水平下調(diào)，表明青光眼大鼠RGCs中存在線粒體自噬功能障礙。Hu等[31]在慢性高眼壓模型的研究中發(fā)現(xiàn)OPA1 過表達(dá)可促進(jìn)OPA1 和parkin表達(dá)，此外促使線粒體自噬增加，進(jìn)而減少RGCs死亡。由此可見，parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對慢性高眼壓模型RGCs具有保護(hù)作用，然而目前相關(guān)研究報(bào)道甚少，其具體作用通路尚不明確。

3.5 急性高眼壓模型

研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在急性高眼壓模型中可能通過降低氧化應(yīng)激對RGCs起到保護(hù)作用。視神經(jīng)擠壓/切斷（Optic nerve crush，ONC）是一種常見的青光眼模型，Rodriguez-Muela和Boya[37]發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷、青光眼和其他視神經(jīng)疾病的情況下，清除受損線粒體對于防止ROS產(chǎn)生、細(xì)胞質(zhì)和軸突損傷以及減少RGCs死亡至關(guān)重要。Rosignol等[38]通過視神經(jīng)擠壓構(gòu)建小鼠青光眼模型，利用mito-QC報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)擠壓損傷7 d后視網(wǎng)膜中RGCs數(shù)量明顯減少，線粒體自噬明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬誘導(dǎo)物DFP對氧化應(yīng)激的RGCs具有顯著保護(hù)作用。因此，線粒體自噬對于急性高眼壓模型RGCs的保護(hù)作用可能是通過增強(qiáng)線粒體自噬以清除受損線粒體以及減少氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的，但目前相關(guān)研究較少，仍需更多的研究以進(jìn)一步明確。

4 小結(jié)

綜上所述，RGCs是將視覺信息從視網(wǎng)膜傳輸?shù)酱竽X的重要神經(jīng)元，如何減少青光眼患者RGCs死亡是青光眼診療的關(guān)鍵。目前研究發(fā)現(xiàn)在不同類型的實(shí)驗(yàn)性青光眼模型中的RGCs存在線粒體自噬功能障礙。近年來對線粒體自噬在視神經(jīng)病變中的研究取得顯著進(jìn)展，大量數(shù)據(jù)表明，調(diào)控線粒體自噬通路可保護(hù)RGCs。然而，目前線粒體自噬在青光眼發(fā)生發(fā)展中的具體信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍處于初級(jí)階段，隨著線粒體自噬在青光眼中的深入研究，線粒體自噬有望成為青光眼等視神經(jīng)退行性疾病的治療靶點(diǎn)并提供新的治療方案以減緩其進(jìn)展。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明馬海霞：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。胡欣欣：參與選題、設(shè)計(jì)、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。陸勤康：參與選題、設(shè)計(jì)和修改論文的結(jié)果、結(jié)論