砂糖橘精氨酸脫羧酶CrADC基因的克隆及表達分析

吳秀蘭 任詩欣 李桂花 唐文武

摘 ? ?要：【目的】克隆砂糖橘精氨酸脫羧酶基因（CrADC），分析其在干旱脅迫下的表達模式，為探究CrADC基因調控多胺合成的抗旱分子機制提供理論參考。【方法】利用RT-PCR技術克隆砂糖橘CrADC基因，采用生物信息學進行蛋白序列及進化分析，利用qPCR檢測不同組織和干旱脅迫下的基因相對表達量，并進行植物表達載體構建與煙草遺傳轉化驗證。【結果】砂糖橘CrADC基因全長2262 bp，編碼753個氨基酸，含有一個吡哆醛結合域。序列及進化分析顯示果樹ADC蛋白序列較保守且分為3類，起源于溫帶的蘋果、李、棗、葡萄等8種落葉果樹為一個進化分支，起源于熱帶或亞熱帶的柑橘、杧果、番木瓜等6種果樹屬于另一分支。qPCR實驗表明，CrADC基因在砂糖橘葉、花、果肉和果皮組織均能表達，但不同時期葉片和果實不同部位的表達量差異顯著，干旱脅迫24 h內的基因表達量會逐步上升。轉基因實驗表明，CrADC基因在煙草根、莖、葉組織中也能穩(wěn)定表達，轉基因系比對照煙草的電導率和丙二醛含量更低，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性更高，表現出更好的抗旱生理特征?！窘Y論】砂糖橘CrADC序列較保守，起源于亞熱帶或熱帶果樹的進化分支。CrADC基因具有組織表達特異性，在干旱脅迫后24 h內該基因表達量上升，使轉基因系比對照煙草具有更好的抗旱生理特性。

關鍵詞：砂糖橘；CrADC基因克?。桓珊得{迫；表達分析

中圖分類號：S666.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）07-1318-12

Cloning and expression analysis of arginine decarboxylase gene （CrADC） from Citrus reticulata ‘Shatangju

WU Xiulan1， REN Shixin1， LI Guihua3， TANG Wenwu2*

（1College of Food and Pharmaceutical Engineering， Zhaoqing University， Zhaoqing 526061， Guangdong， China; 2College of Life Sciences， Zhaoqing University， Zhaoqing 526061， Guangdong， China; 3Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， Guangdong， China）

Abstract： 【Objective】 Shatangju （Citrus reticulata Blanco） is one of the most widely cultivated citrus in southern China and often encounters drought stress during cultivation. Polyamines can reduce drought damage by regulating stomatal closure and promoting root development. The arginine decarboxylase as a rate-limiting enzyme in polyamine synthesis， catalyzes conversion of arginine to putrescines， which is further converted into other polyamines. Therefore， in this study， arginine decarboxylase gene （CrADC） was cloned from Shatangju and its expression pattern was examined under drought stress， in order to provide understanding of the molecular mechanism regulating polyamines synthesis in drought resistance. 【Methods】 The cDNA sequence of CrADC was obtained by reverse transcription PCR （RT-PCR）. The coding sequences of CrADC was amplified from cDNA， then cloned into the vector pMD19-T and transformed into DH5α by heat shock. The DH5α was cultured overnight at 37 ℃， then DNA from the plasmid was extracted and sequenced after PCR identification. Bioinformatics tools were used to analyze the characteristics and evolutionary relationship of the CrADC protein. The quantitative real-time PCR （qPCR） was used to detect the expression level of the CrADC gene in different tissues （young leaves， old leaves， flowers， 30d fruit flesh， and 30d fruit peel） and at different times （0， 3， 6， 9， 12， 24， 36 h） after exposure to 10% PEG-6000 solution. Transgenic tobaccos were obtained by leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens， and the expression level of the CrADC in the transgenic tobacco plants was detected by qPCR. Related physiological parameters， such as water loss （FL）， electrolyte leakage （EL）， malondialdehyde （MDA）， and activities of catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD） were compared between transgenic lines （TL） and non-transgenic lines （CK） after drought stress. 【Results】 The cDNA sequence of the CrADC had 3076 bp including a 2262 bp open reading frame （ORF） encoding a protein with 753 amino acids. Bioinformatics analysis indicated the relative molecular weight of the CrADC protein was 80.84 ku; the theoretical isoelectric point was 5.13; the instability coefficient was 40.98; and the average hydrophilic coefficient was -0.009. The CrADC protein belongs to an unstable hydrophilic protein. There was no transmembrane domain in CrADC， and there was a pyridoxal binding domain （Orn_Arg_deC_N） between 139th and 414th amino acids. Pairwise sequence alignment of ADC protein sequences from 16 fruit trees species was performed. The results showed that the CrADC protein from Shatangju was highly similar to those of C. sinensis， C. clementina and C. trifoliata， with a sequence identity higher than 96.5%. The sequence identity was the lowest between CrADC and Musa acuminata ADC protein （62%）. Phylogenetic analysis showed the amino acid sequences of ADC from the 16 fruit tree species were relatively conservative and could be divided into three clusters. Eight deciduous fruit species， such as M. domestica， Vitis riparia and Ziziphus jujuba， belonged to an evolutionary branch from temperate areas. Six fruit tree species， such as Citrus， Mangifera indica and Carica papaya， belonged to another evolutionary branch from tropical or subtropical areas. The results of qPCR showed the CrADC was expressed in leaves， flowers， fruit flesh and peel. The highest expression level of the CrADC gene was detected in fruit peel at day 30， and the lowest expression was detected in the old leaves. Furthermore， the expression level of CrADC gene in the peel at day 30 was 3.18 folds higher than that in the flesh. The expression level of CrADC in young leaves from spring was 3.41 folds higher than that in old leaves in winter. In total， the CrADC gene has expression specificity at different development stages. The expression level of CrADC gene obviously increased with the extension of drought treatment time， and the highest level was detected at 24 h and 3.82 folds higher than that at 0 h. Transgenic tobacco experiments showed that the CrADC gene was stably expressed in root， stem and leaf of transgenic tobacco. Transgenic physiological experiment showed the EL and MDA in transgenic tobacco were lower than in non-transgenic tobacco （CK）， indicating that the cell membrane permeability of transgenic lines was lower than that of CK. The CAT and SOD in transgenic tobacco were higher than in CK， conferring higher ability in scavenging reactive oxidative species （ROS） to the transgenic plants. Therefore， the transgenic tobacco has greater drought resistance than CK. 【Conclusion】The amino acid sequence of CrADC is relatively conservative， and the CrADC protein belongs to the evolutionary branch from the tropical or subtropical area. The CrADC gene has expression specificity at different development stages of Shatangju， and the expression level of the CrADC increases with the extension of drought， and the transgenic tobacco has greater drought resistance than non-transgenic tobacco.

Key words： Shatangju; CrADC cloning; Drought stress; Gene expression

砂糖橘（Citrus reticulata Blanco ‘Shatangju）是我國南方地區(qū)的主栽柑橘品種，僅廣東、廣西種植面積就達到16.67萬hm2，年產量約250萬t，是華南地區(qū)山區(qū)農民增收的重要樹種，在鄉(xiāng)村產業(yè)振興方面具有重要的經濟社會價值[1]。砂糖橘主要種植于南方山地、丘陵等干旱缺水地帶，干旱脅迫是影響砂糖橘生長發(fā)育、果實品質、高產穩(wěn)產的重要因素，如何降低干旱對柑橘的脅迫作用是生產中亟待解決的問題[2]。柑橘抗旱品種選育及推廣是防止干旱脅迫最經濟有效的措施，因此揭示柑橘干旱脅迫生理機制并克隆相關抗性基因，對砂糖橘抗旱品種選育具有重要意義[3]。

多胺（polyamines，PAs）是一類具有生物活性的低分子脂肪族含氮堿，參與柑橘植物胚胎發(fā)生、根系形態(tài)建成、芽形成及植株生長、成花及開花調控、果實形成及發(fā)育、氣孔閉合及氣體交換、光合作用及葉綠素熒光現象等諸多生長發(fā)育和生理過程[4]。植物PAs主要以二胺的腐胺（putrescine，Put）、三胺的亞精胺（spermidine，Spd）以及四胺的精胺（spermine，Spm）形式存在。在PAs合成過程中，首先通過3種精氨酸代謝途徑來合成Put，第一種途徑植物會通過精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）催化的精氨酸脫羧產生胍基丁胺，然后在胍基丁胺脫氨酶和N-氨基甲酰腐胺酰胺水解酶連續(xù)催化下形成Put；第二種途徑是精氨酸能在ADC催化下直接合成Put，或者胍基丁胺在胍基丁胺脲水解酶作用下合成Put；第三種途徑主要存在于動物和真菌中，精氨酸被線粒體中的精氨酸酶催化為鳥氨酸，然后在鳥氨酸脫羧酶作用下轉變成Put。Spd、Spm合成則需要借助甲硫氨酸代謝途徑，L-甲硫氨酸在S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及脫羧酶的催化下生成脫羧S-腺苷甲硫氨酸（decarboxylated S-adenosylmethionime，dcSAM），然后在亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）催化作用下，Put接受dcSAM提供的一個氨丙基生成Spd；最后在精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）催化下，Spd接受一個氨丙基后轉變?yōu)樗陌返腟pm[4]。前人研究表明多胺與植物抗旱性狀密切相關，Yang等[5]發(fā)現水稻能通過增強葉片的PAs生物合成來維持細胞滲透壓，從而適應干旱脅迫。Shi等[6]研究報道了PAs能通過調控葉片的氣孔閉合，抑制葉片水分和電解質流失，從而緩解干旱脅迫。Yao等[7-8]研究發(fā)現外噴PAs能增加黎檬（C. limonia）的根長、根系表面積、根體積和根尖數，促進根系吸水，緩解干旱脅迫。在植物PAs合成過程中，Spd、Spm是以Put為底物進一步合成，而ADC是植物通過精氨酸代謝途徑合成Put的第一關鍵限速酶，因此克隆植物ADC基因對研究PAs合成調控及干旱脅迫生理機制具有重要意義。

目前在葡萄[9]、枳[10]、甜橙[11]、桃樹[12]、杜梨[13]等果樹中已分離并克隆了ADC基因，上述果樹ADC基因不含內含子結構，其開放閱讀框（ORF）介于2178～2262 bp之間，編碼720～753個氨基酸。但關于砂糖橘CrADC的基因克隆以及表達與功能分析等研究尚未見報道。筆者在本研究中以砂糖橘為材料，成功克隆得到CrADC基因并進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR檢測不同組織中和干旱脅迫處理下該基因的表達量，并通過穩(wěn)定遺傳轉化煙草對該基因進行功能驗證，以期為CrADC基因參與 PAs生理調控的分子機制提供基礎，并為砂糖橘抗旱分子育種提供候選基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為廣東地區(qū)種植的砂糖橘品種，由肇慶市四會果園提供。選擇6年生砂糖橘植株并參照唐文武等[14]的方法獲取春梢期嫩葉、越冬期老葉、花芽期花苞、30 d幼果果肉以及30 d幼果果皮，置于-80 ℃冰箱保存后提取總RNA，用于不同組織的基因表達分析。選用6年生砂糖橘的新發(fā)秋梢，于10% PEG-6000溶液中模擬干旱脅迫處理，處理時間分別為0、3、6、9、12、24和36 h，3次重復，每個處理所采葉片置于液氮速凍后提取總RNA，用于干旱脅迫下的CrADC基因表達特征分析。

1.2 主要試劑

柱式植物RNAout 2.0試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，M-MLV反轉錄試劑盒購自美國Life technology公司，TaKaRa LA Taq?酶、各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、凝膠回收試劑盒Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0以及載體構建的In-Fusion? HD Cloning Kit等試劑盒均購自TaKaRa公司（日本），SYBRTM Green Ⅰ核酸熒光染料購自ThermoFisher公司，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、農桿菌GV3101感受態(tài)細胞、克隆載體pMD19-T和植物表達載體pBI121均由筆者課題實驗室保存提供。主要設備儀器：ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher公司）、T100 PCR儀（美國Bio-Rad公司）、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 砂糖橘CrADC基因克隆

1.3.1 ? ?葉片總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 ? ?取6年生砂糖橘果樹的嫩葉，按照柱式植物RNAout試劑盒說明提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA第一鏈。

1.3.2 ? ?引物序列設計及PCR擴增 ? ?根據柑橘泛基因組育種數據庫（http：//citrus.hzau.edu.cn）公布的甜橙（C. sinesisi）v3.0版ADC基因序列（Gene ID：Cs_ont_8g020080），設計并篩選到1對PCR引物（CrADC-F/CrADC-R），其引物序列見表1。以反轉錄合成的cDNA為模板擴增砂糖橘CrADC基因的cDNA序列，PCR反應體系50.0 μL，包括0.5 μL LA Taq，5.0 μL 10×PCR buffer，2 μL dNTP （2.5 mmol·L-1），CrADC-F和CrADC-R（10 μmol·L-1）各1.0 μL，2.0 μL cDNA （100 ng），加ddH2O補充至50 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min；設置30個循環(huán)，94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的片段。

1.3.3 ? ?CrADC基因測序 ? ?以pMD19-T為克隆載體，將目的基因CrADC與克隆載體連接后，轉化到感受態(tài)細胞DH5α中，經涂板、培養(yǎng)、質粒DNA提取及PCR鑒定后，送上海生工公司進行測序。

1.4 序列分析及系統(tǒng)進化分析

利用Prot Param進行目標基因編碼的蛋白質基本理化性質預測，利用Prot Scale進行親疏水性分析，利用SOPMA、Predict Protein預測其二級結構，利用SMART對其功能結構域進行分析，利用DNAMAN和MEGA7軟件進行蛋白序列多重比較和系統(tǒng)進化樹分析。

1.5 CrADC基因表達分析

利用qPCR檢測CrADC基因在不同組織及干旱脅迫下的轉錄表達量，嫩葉、老葉、花、果皮、果肉等樣品總RNA提取及cDNA合成參照試劑盒的方法。根據CrADC基因序列，設計并篩選了1對特異性引物（QCrADC-F/QCrADC-R，表1），以柑橘ACTB基因作為內參基因[15]。擴增反應采用SYBR Green Ⅰ染料法在ABI 7500實時定量PCR儀上進行，設置3次生物學重復，數據分析采用2-△△CT法計算[16]。

1.6 植物表達載體構建與煙草遺傳轉化

設計含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位點的引物TranADC-F/TranADC-R（表1），然后PCR擴增CrADC基因。利用BamHⅠ和Sac Ⅰ雙酶切pBI121空載體，采用In-Fusion? HD Cloning Kit法，將CrADC基因連接到pBI121載體，轉化后經PCR及測序鑒定，獲得重組pBI121-CrADC植物表達載體。制備根癌農桿菌GV3101感受態(tài)細胞并經凍融法轉化重組載體，然后采用農桿菌介導的葉盤法轉化煙草[17]，經浸染、共培養(yǎng)、抗性芽篩選、生根培養(yǎng)及分子鑒定獲得轉CrADC基因煙草植株。以煙草β-actin為內參基因[18]，利用實時熒光qPCR檢測CrADC基因在轉基因植株中的表達情況。

1.7 轉基因煙草抗旱性鑒定

選取轉基因煙草后代中CrADC基因表達量高的T3純合株系，以及對照普通煙草種子。上述種子播種出苗后，移至植物培養(yǎng)箱在24 ℃、70%濕度、16 h光照下正常澆水種植30 d后，停止?jié)菜?0 d進行干旱脅迫處理。取轉基因和對照煙草的葉片，參照李合生[19]方法測定干旱脅迫后的葉片電導率、丙二醛（MDA）含量，以及過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性。參照Wu等[20]方法取正常生長30 d的煙草葉片稱質量，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中自然脫水，分別于15、30、60、90、120 min后稱質量，測定自然脫水后的葉片失水率。上述試驗均3次重復，利用SPSS軟件進行LSD檢驗。

2 結果與分析

2.1 CrADC基因克隆及序列測定

以砂糖橘嫩葉總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，利用CrADC-F/QCrADC-R引物擴增后得到一條約3.0 kb特異條帶（圖1）。該擴增條帶經回收純化后進行基因測序，結果顯示，砂糖橘CrADC基因cDNA序列全長為3076 bp，含有1個2262 bp的開放閱讀框（ORF），編碼753個氨基酸（圖2）。

2.2 CrADC蛋白序列比對

利用Prot Param分析的結果表明，CrADC蛋白相對分子質量為80.84 ku，理論等電點為5.13，不穩(wěn)定系數為40.98。Prot Scale的疏水性分析表明，該蛋白第203位氨基酸疏水性最高，為2.567，第743位疏水性最低，為-2.689，平均親水性系數為-0.009，屬于不穩(wěn)定親水性蛋白。SOPMA二級結構預測顯示（圖3-A），該蛋白二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占41.30%和37.45%，β-轉角僅6.61%，擴展束占14.61%。TMHMM跨膜區(qū)分析表明該蛋白不含跨膜結構域（圖3-B），屬于非跨膜蛋白。SMART預測顯示該蛋白的139～414區(qū)域為吡哆醛結合域Orn_Arg_deC_N（圖3-C），與精氨酸脫羧酶功能密切相關[21]。

為分析果樹ADC基因間進化關系，從NCBI數據庫中選取15種果樹ADC蛋白與CrADC進行序列比對分析。雙序列比對表明砂糖橘CrADC與甜橙（C. sinensis，XP_006487299.2）、克里曼丁橘（C. clementina，XP 006423501.1）、枳（C. trifoliata，AEE99192.1）的ADC蛋白序列高度相似，序列一致性超過96.5%，與香蕉（Musa acuminata，XP_009393201.1）ADC蛋白序列一致性最低（62.0%）。多序列比對（圖4）顯示，16種果樹的ADC蛋白序列相似性較高，均包含一個完整的吡哆醛結合域Orn_Arg_deC_N，該結構域的氨基酸序列高度保守，表明果樹進化過程中ADC蛋白作為關鍵酶促蛋白，氨基酸序列較保守。

2.3 CrADC蛋白進化分析

系統(tǒng)進化分析（圖5）顯示，16種果樹的ADC蛋白聚為三類。其中蕓香科柑橘屬的甜橙、克里曼丁橘、枳、砂糖橘，以及杧果（Mangifera indica，XP_044488993.1）、番木瓜（Carica papaya，XP_021889268.1）6種果樹ADC蛋白聚為一類，是主要起源于亞熱帶或熱帶地區(qū)的果樹，處于同一進化分支。薔薇科的甜櫻桃（Prunus avium，XP_021806331.1）、桃（Prunus persica，XP_007200307.1）、李（Prunus dulcis，XP_034226752.1）、蘋果（Malus domestica，XP_008358425.2），以及葡萄科的葡萄（Vitis riparia，XP_034681234.1）、鼠李科的棗（Ziziphus jujuba，XP_015892431.2）等果樹ADC蛋白聚為一類，是主要起源于溫帶地區(qū)的落葉型果樹，處于同一進化分支。芭蕉科的香蕉（Musa acuminata，XP_009393201.1）與杜鵑花科的藍莓（Vaccinium darrowii，KAH7835244.1）與其他ADC蛋白差異較大，被聚為一類。

2.4 砂糖橘CrADC基因表達分析

對砂糖橘不同組織CrADC基因的qPCR結果（圖6）顯示，CrADC基因在砂糖橘春梢期嫩葉、越冬期老葉、花、30 d幼果果皮和30 d幼果果肉等組織中均有表達，且除嫩葉與花外，其他組織間基因表達差異均達到顯著水平。以30 d幼果果皮的表達量最高，其次是嫩葉和花，老葉中基因表達量最低。進一步比較發(fā)現，30 d幼果果皮表達量是果肉的3.18倍，春梢期嫩葉表達量是越冬期老葉的3.41倍，表明CrADC基因在葉片生長的不同時期，以及果實不同部位的基因表達量具有顯著差異，表現出基因表達的時空特異性，這可能與CrADC基因參與的生理調控功能或多胺區(qū)域化分布差異有關。

為研究CrADC基因在干旱脅迫時的表達特征，利用10%的PEG-6000溶液來模擬干旱脅迫環(huán)境。剪取6年生新發(fā)秋梢進行干旱脅迫處理，并于3、6、9、12、24、36 h提取葉片總RNA進行相對定量qPCR分析，以0 h為對照。試驗結果（圖7）顯示，隨著干旱脅迫時間的延長，CrADC基因表達量也相應上升，并在處理24 h時達到最高，其表達量是0 h對照的3.82倍。當干旱脅迫繼續(xù)延長后，其基因表達量開始下降，處理36 h時表達量僅為最高24 h時的59.5%。該結果表明，砂糖橘在干旱脅迫24 h內，可顯著提高CrADC基因的表達量，推測該基因的高表達將促進腐胺等PAs的合成來適應干旱脅迫，上述推測還有待于進一步試驗驗證。

2.5 CrADC基因轉化煙草研究

將含有pBI121-CrADC重組質粒的農桿菌GV3101，通過葉盤法轉化煙草，經Kan抗性篩選后獲得25個轉基因抗性植株。利用擴增片段包括載體與目的基因序列的特異性引物TranPCR-F/TranPCR-R進行PCR檢測，結果發(fā)現18株轉基因抗性植株中檢測到特異性條帶（圖8），表明CrADC基因已整合到煙草基因組中。

為了檢測CrADC基因在轉基因煙草中的表達情況，分別提取轉基因煙草和對照非轉基因煙草的根、莖、葉組織總RNA，經反轉錄cDNA后進行qPCR實驗，以煙草actin為內參基因。結果顯示（圖9），CrADC基因在轉基因煙草的根、莖、葉組織中均能表達，以煙草嫩葉中表達量最高，其次為根系，莖組織表達量最低，而非轉基因對照的組織中未檢測到該基因表達水平。

2.6 轉基因煙草抗旱性分析

對上述轉基因T0代植株，進行續(xù)代、篩選鑒定后獲得一批T3代純合株系。對T3代純合株系進行表達分析，篩選出1個CrADC基因表達量最高的株系11-2a開展抗旱性分析。選取該轉基因株系和對照煙草正常生長30 d后，剪取葉片進行自然脫水處理后，并于不同時間段取樣測定失水率，結果見圖10。由圖10可知，在120 min內轉基因系的失水率在不同時間段都低于對照普通煙草。該結果表明CrADC基因在煙草中超表達后，表現出明顯的抗脫水性。

進一步對轉基因系和對照煙草進行20 d的干旱脅迫處理，并分別測定衡量細胞膜通透性的電導率、丙二醛含量指標，以及清除過氧化氫、活性氧的抗氧化酶活性，相關結果見圖11。由圖11-A～B可知，轉基因系的電導率和丙二醛含量均低于對照普通煙草，兩者間差異分別達到顯著和極顯著水平，表明超表達CrADC的轉基因系能降低葉片細胞膜通透性，從而表現出較高的抗旱性。由圖11-C～D可知，轉基因系的CAT酶和SOD酶活性均高于對照煙草，兩者間差異均達到極顯著水平，表明在干旱脅迫后，轉基因系提高了葉片的抗氧化酶活性，更能有效清除體內活性氧，避免轉基因植株的生理損傷，從而表現較強的抗旱性。

3 討 論

PAs是生物體普遍存在的一類低分子脂肪族含氮堿，在柑橘屬植物的細胞分化、根系建成、成花過程、果實發(fā)育、氣孔調節(jié)和氣體交換等生理代謝活動中發(fā)揮重要作用[4]。ADC作為PAs生物合成途徑中的第一個關鍵限速酶，能通過調控PAs合成速率來調節(jié)植物代謝活動，降低逆境脅迫對植物生長的不利影響[22]。目前在柑橘屬PAs合成途徑的相關基因中，僅報道了甜橙（C. sinensis）CsSAMDC [23]、砂糖橘CsSAMDC [14]，以及枳（C. trifoliata）PtADC [10]的基因克隆相關研究，柑橘屬廣泛栽培的其他柑、橘、橙、柚等物種的ADC基因克隆及相關功能研究尚未報道。本研究克隆了砂糖橘CrADC基因，與Wang等[10]報道的枳PtADC（AEE99192.1）的氨基酸序列一致性為96.5%，均含有一個序列高度保守的吡哆醛結合域Orn_Arg_deC_N（PF02784），與精氨酸脫羧酶功能密切相關[21]。對16種果樹ADC蛋白進化分析顯示，起源于溫帶的蘋果、李、棗、葡萄等8種落葉果樹為一個進化分支，起源于熱帶或亞熱帶的柑橘、杧果、番木瓜等6種果樹屬于另一分支。表明在果樹進化過程中ADC蛋白作為關鍵酶促蛋白，氨基酸序列較為保守。

前人研究發(fā)現，果樹ADC基因在植物根、莖、葉、果實等多個組織中均能表達，在杜梨的葉片中表達量最高，而在枳的果皮中表達量最高，在一定脫水時間內果樹ADC基因相對表達量會上升[10，13]。本研究CrADC基因在砂糖橘的葉、花、果等組織中均有表達，以30 d幼果果皮的表達量最高。在干旱脅迫的24 h內，CrADC基因表達量隨時間延長也相應穩(wěn)步上升，與枳[10]、桃樹[12]、杜梨[13]等果樹在脫水環(huán)境下的ADC基因表達特征基本相似。Miller等[24]報道干旱脅迫會誘導植株體內活性氧積累，從而造成細胞膜損傷。PAs作為滲透調節(jié)劑具有保護酶活性和降低丙二醛含量，清除體內活性氧自由基，增強植物的抗干旱脅迫能力的功能[25]。Shi等[6]和Zhang等[26]研究發(fā)現干旱或脫水會導致植物葉片氣孔保衛(wèi)細胞中的PAs濃度上升，而天然PAs會強烈抑制氣孔開放、誘導氣孔關閉，植物氣孔關閉能減少水分蒸發(fā)及電解質流失，從而保持植株在干旱環(huán)境下正常生長。在根系建成中，PAs能充當細胞增殖分化等激素的第二信使，通過控制生長素/細胞分裂素的比率，從而誘導根系發(fā)育[27]。Yao等[7-8]發(fā)現外施PAs能增加黎檬（C. limonia）的根長、根系表面積、根體積和根尖數，增強根系吸水能力，緩解干旱脅迫。本研究中，篩選出的轉CrADC基因煙草在自然脫水處理后，其葉片相較于對照煙草表現出明顯的抗脫水性。在20 d干旱脅迫后，轉基因系的電導率、丙二醛含量均低于對照，表現出更低的細胞膜通透性；其CAT酶、SOD酶活性均高于對照，表現強抗氧化酶活性從而避免細胞膜損傷，表現出更好的植株抗旱性。通過基因表達水平和轉基因煙草功能分析，筆者推測柑橘在干旱脅迫的誘導下，CrADC基因高表達后促進腐胺等PAs合成，PAs可調節(jié)細胞內滲透物質含量，增強吸水性，同時PAs具有保護抗氧化酶活性，清除活性氧而減輕膜脂過氧化程度。高濃度PAs能導致葉片保衛(wèi)細胞控制氣孔關閉，同時PAs作為第二信使促進根系發(fā)育而增強吸水能力，從而緩解干旱脅迫對植物生長的不利影響。上述假設還有待于SPMS、SPDS等PAs合成途徑基因的克隆及表達特征分析，并繼續(xù)開展干旱脅迫下砂糖橘內源PAs濃度和氣孔閉合、根系生長發(fā)育等表型的關聯(lián)性分析，從而為探究CrADC等基因通過調控PAs合成代謝，抵御干旱等非生物脅迫的生理機制提供分子生物學證據。

4 結 論

克隆了砂糖橘CrADC基因，其全長2262 bp，編碼753個氨基酸，屬起源于亞熱帶或熱帶果樹的進化分支。CrADC基因在砂糖橘葉、花、果等組織中均能表達，但不同時期葉片和果實不同部位的表達量均有顯著差異，在干旱脅迫24 h內基因表達量隨時間延長而逐步上升，轉基因系比對照煙草有更好的抗旱生理特性。

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