環(huán)孢菌素A眼用納米粒溫敏凝膠的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

彭靜雨,梁 雪,周四元,成 穎

空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥劑學(xué)與藥事管理學(xué)教研室,西安 710032

干眼癥又稱角膜干燥癥,是常見(jiàn)的眼部疾病。由于電子產(chǎn)品的過(guò)度使用、角膜接觸鏡的濫用等,干眼癥在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),并且發(fā)病年齡有降低的趨勢(shì)[1-2]。干眼癥的臨床表現(xiàn)為由淚液分泌不足或者淚液的流體力學(xué)性質(zhì)改變而引起的眼睛干澀、發(fā)癢、酸脹,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致角膜渾濁甚至失明[3]。炎癥是干眼癥的主要發(fā)病機(jī)制[4-5],環(huán)孢菌素A(cyclosporine A,CsA)能有效抑制炎癥因子在眼部組織的浸潤(rùn),同時(shí)提高抗炎細(xì)胞因子的釋放水平,進(jìn)而增加淚液的分泌,是臨床治療重度干眼癥的首選藥物[6]。但CsA的相對(duì)分子質(zhì)量大,且由于其具有較強(qiáng)的親脂性,眼部直接給藥,藥物與淚液的相容性差,故難以在眼部滯留,影響其發(fā)揮治療作用[7-8]。

納米技術(shù)是改善難溶性藥物溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度的制劑新技術(shù)[9]。通過(guò)制備納米粒能增加難溶性藥物的飽和溶解度,加快其溶出速度,繼而可以將其制備成適合多種給藥途徑的藥物制劑。溫敏凝膠能根據(jù)溫度變化發(fā)生物理狀態(tài)的改變。將眼用制劑設(shè)計(jì)為溫敏凝膠,能滿足藥物在使用前為液體(具備良好的流動(dòng)性)、眼部給藥后迅速膠凝化(延長(zhǎng)藥物在眼球表面的滯留時(shí)間)的要求[10]。將納米制劑與溫敏凝膠給藥系統(tǒng)結(jié)合,制備的CsA納米粒眼用溫敏凝膠能延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間,減小對(duì)眼部的刺激,提高生物利用度,更加符合臨床需求。

本研究先制備CsA納米粒,再以泊洛沙姆407(poloxamer 407,F127)、泊洛沙姆188(poloxamer 188,P188)和殼聚糖作為基質(zhì)制備溫敏凝膠,包裹CsA納米粒。用中心點(diǎn)復(fù)合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法篩選最優(yōu)的凝膠處方,并對(duì)制得的CsA眼用納米粒溫敏凝膠的釋藥行為及釋藥機(jī)制進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

精密水銀溫度計(jì)、恒溫水浴鍋、HMS-18型磁力攪拌器均購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司;AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);JNB10型高壓均質(zhì)機(jī)(廣州聚能生物科技有限公司);水浴恒溫振蕩器(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司);納米粒度電位儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);透射電子顯微鏡(日本日立公司);低溫恒溫冰箱(青島海爾股份有限公司);高速冷凍型微量離心機(jī)(美國(guó)賽洛捷克公司);超純水機(jī)(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

環(huán)孢菌素A(cyclosporine A,CsA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%,上海源葉生物科技有限公司);泊洛沙姆407(poloxamer 407,F127)、泊洛沙姆188(poloxamer 188,P188)、殼聚糖均購(gòu)自德國(guó)巴斯夫公司;丙酮(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);乙腈(賽默飛世爾科技有限公司);無(wú)水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司);氯化鈉、氯化鉀、二水氯化鈣、碳酸氫鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 CsA納米粒溫敏凝膠的制備

2.1.1CsA納米粒的制備 用納米沉淀-高壓均質(zhì)法制備CsA納米粒溶液。稱取20 mg CsA溶于1 mL丙酮作為有機(jī)相;稱取100 mg F127溶于10 mL去離子水作為水相。在室溫條件下邊攪拌邊將有機(jī)相勻速滴入水相中。在通風(fēng)櫥中自然攪拌揮發(fā)丙酮,收集溶液。所得溶液用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行粒徑均化處理(設(shè)置條件:1 500 bar,均質(zhì)10次,4 ℃),獲得泛乳光的納米粒溶液,見(jiàn)圖1。如圖1所示,CsA納米粒的粒徑為(220±10) nm;Zeta電位為(-10±1) mV。納米粒的透射電鏡圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),納米粒分散均勻。用超高效液相色譜儀檢測(cè)CsA納米粒溶液中藥物的質(zhì)量濃度,將CsA納米粒溶液中藥物的質(zhì)量濃度稀釋至1 mg·mL-1。

注:A.CsA納米粒粒徑圖;B.CsA納米粒電位圖。

圖2 CsA納米粒的透射電鏡圖

2.1.2CsA眼用納米粒溫敏凝膠的制備 用低溫溶脹法制備CsA眼用納米粒溫敏凝膠。按優(yōu)化處方投料比分別稱取F127、P188、殼聚糖,加入相應(yīng)體積的CsA納米粒溶液中。將樣品靜置于4 ℃冰箱中(≥48 h),待所有凝膠基質(zhì)充分溶脹,即得CsA眼用納米粒溫敏凝膠溶液。

2.2 膠凝溫度的測(cè)定

2.2.1人工淚液的配制 稱取氯化鈉6.78 g、氯化鉀1.38 g、二水氯化鈣0.08 g、碳酸氫鈉2.18 g,用去離子水溶解并定容至1 000 mL,振蕩至溶液澄清無(wú)顆粒[11],即得。

2.2.2原始膠凝溫度T1的測(cè)定 將精密溫度計(jì)插入制備好的CsA納米粒溫敏凝膠溶液中,一并置于恒溫水浴鍋(起始溫度為20 ℃,設(shè)定溫度為50 ℃)中緩慢升溫。將試管傾斜90°觀察液體流動(dòng)情況,以玻璃棒攪動(dòng)難易程度確定膠凝溫度。

將試管傾斜90°,當(dāng)藥液呈半固體凝膠狀無(wú)流動(dòng)、用玻璃棒攪動(dòng)藥液有輕微阻力感時(shí),記錄溫度計(jì)讀數(shù)。取出試管自然冷卻至藥液恢復(fù)呈液體狀,再次記錄溫度計(jì)讀數(shù)。平行測(cè)量3次,計(jì)算3次的平均值,即為膠凝溫度。

2.2.3用模擬人工淚液稀釋后膠凝溫度T2的測(cè)定 將CsA眼用納米粒溫敏凝膠溶液與人工淚液按照40∶7的體積比混勻[12],按照2.2.2項(xiàng)下的方法測(cè)定用模擬人工淚液稀釋后的膠凝溫度T2。

2.3 處方優(yōu)化

2.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用軟件Design Expert 13以中心點(diǎn)復(fù)合響應(yīng)面法設(shè)計(jì)3因素5水平實(shí)驗(yàn)[13]。選取對(duì)CsA眼用納米粒溫敏凝膠的膠凝溫度影響顯著的3個(gè)因素,即F127、P188、殼聚糖的質(zhì)量占比為自變量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在滿足實(shí)驗(yàn)?zāi)康那疤嵯?確定自變量的取值區(qū)間依次為18%～28%、0～8%、1%～4%。根據(jù)軟件內(nèi)置代碼±α(α=1.68),±1,0設(shè)計(jì)5水平實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表1[14-15]。膠凝溫度為測(cè)量指標(biāo),具體處方和結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 3因素5水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 中心點(diǎn)復(fù)合響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 (n=3)

2.3.2模型擬合 用Design Expert 13軟件,以實(shí)驗(yàn)變量為自變量,以膠凝溫度為因變量,分析自變量與因變量的關(guān)系,擬合方程建立線性回歸。其中x1表示F127的質(zhì)量占比,x2表示P188的質(zhì)量占比,x3表示殼聚糖的質(zhì)量占比。

T1=25.41-5.26x1+3.78x2-1.52x3-1.3x1x2+0.254 2x1x3+0.195 8x2x3+1.29x12+0.331 1x22-0.042 4x32

T2=33.54-7.62x1+4.06x2-1.09x3+0.566 7x1x2+1.04x1x3+0.058 3x2x3+1.56x12-0.009 4x22-0.233 3x32

膠凝溫度模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,R2>0.9并且信噪比>4,表明T1和T2模型的擬合度好。P<0.01且F值顯著,表明模型穩(wěn)定性好。失擬誤差顯著(>0.1)表明擬合的模型效果好。以二次多項(xiàng)式方程為數(shù)學(xué)模型繪制三維響應(yīng)面圖,見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),當(dāng)殼聚糖質(zhì)量占比為定量時(shí),F127和P188的質(zhì)量占比對(duì)膠凝溫度的影響較大。經(jīng)模擬淚液稀釋后,各實(shí)驗(yàn)組的膠凝溫度均有不同程度的升高,見(jiàn)圖4。加入淚液后,殼聚糖的質(zhì)量占比對(duì)膠凝溫度的影響增大。

表3 膠凝溫度模型方差分析

圖3 F127、P188、殼聚糖質(zhì)量比對(duì)T1的三維響應(yīng)面圖

圖4 F127、P188、殼聚糖質(zhì)量比對(duì)T2的三維響應(yīng)面圖

2.3.3響應(yīng)面優(yōu)化與工藝驗(yàn)證 構(gòu)建模型的最終目的是設(shè)計(jì)符合眼部給藥要求的凝膠制劑,滿足凝膠制劑在儲(chǔ)存條件下具有良好的流動(dòng)性、在眼部給藥后相變?yōu)榘牍腆w狀態(tài)、形成藥物儲(chǔ)庫(kù)的要求。有文獻(xiàn)報(bào)道,將T1控制在25～30 ℃、T2控制在30～35 ℃是眼用凝膠制劑的理想狀態(tài)。設(shè)置25 ℃≤T1≤30 ℃、30 ℃≤T2≤35 ℃的目標(biāo)范圍,軟件給出的100個(gè)符合條件的凝膠處方,從中任意挑選4個(gè)處方,按照2.1.2項(xiàng)下的方法制備凝膠,驗(yàn)證該模型的可靠性,見(jiàn)表4。如表4所示,4個(gè)凝膠處方實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的偏差在可接受的范圍內(nèi)(±5%)。其中處方4的制劑產(chǎn)品符合理想眼用凝膠制劑的標(biāo)準(zhǔn)。最終確定F127、P188與殼聚糖的質(zhì)量比為22.108∶1.754∶1.734。

表4 凝膠處方驗(yàn)證 (n=4)

2.4 體外評(píng)價(jià)

2.4.1凝膠溶蝕考察 稱取適量CsA眼用納米粒溫敏凝膠,置于西林瓶中預(yù)先膠凝化,平行制備3份。將人工淚液作為溶蝕介質(zhì),沿瓶壁加入提前保溫的人工淚液,再一并置于恒溫水浴振蕩器中振蕩溶蝕,每隔30 min將溶蝕介質(zhì)全部取出,稱取西林瓶的質(zhì)量,再加入新鮮人工淚液3 mL繼續(xù)振蕩溶蝕。結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,CsA眼用納米粒溫敏凝膠的時(shí)間-凝膠溶蝕率曲線呈線性關(guān)系,7 h內(nèi)CsA眼用納米粒溫敏凝膠的體外溶蝕率達(dá)75%。

圖5 CsA眼用納米粒溫敏凝膠體外溶蝕曲線

2.4.2凝膠釋藥行為及機(jī)制研究 稱取適量CsA眼用納米粒溫敏凝膠預(yù)先膠凝化,平行制備3份。為滿足漏槽條件,以含有體積分?jǐn)?shù)10%乙醇的人工淚液作為釋藥介質(zhì)。

沿壁加入提前保溫的人工淚液,再一并置于恒溫水浴振蕩器中振蕩,分別在0.5、1、2、4、8、20、24 h取釋放介質(zhì),處理后注入超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC)系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件:色譜柱為ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(85∶15);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;柱溫為50 ℃;流速為0.2 mL·min-1;進(jìn)樣量為5 μL。釋藥結(jié)果見(jiàn)圖6,在滿足漏槽條件的前提下,24 h凝膠累積釋放度能達(dá)到90%以上,CsA眼用納米粒溫敏凝膠具有緩釋的作用。

圖6 CsA眼用納米粒溫敏凝膠的體外釋藥曲線

為了闡明CsA眼用納米粒溫敏凝膠的釋藥機(jī)制,用DD.solver.1.0軟件對(duì)釋藥曲線進(jìn)行擬合,經(jīng)過(guò)對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行比較,確定CsA眼用納米粒溫敏凝膠釋藥曲線滿足Peppas-Sahlin模型(R2=0.998 8),釋藥方程為F=11.307t0.877-0.352t1.754,見(jiàn)圖7。表明藥物的釋放機(jī)制為非Fick擴(kuò)散,釋藥是擴(kuò)散與溶蝕并存的過(guò)程[16-17]。

圖7 釋藥曲線擬合模型——Peppas-Sahlin模型

3 討論

CsA水溶性差,直接制備CsA溫敏凝膠,藥物的含量極低,為了解決藥物溶解性的問(wèn)題,實(shí)驗(yàn)采用納米化技術(shù)提高CsA在溶液中的溶解度。溫敏凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使藥物納米粒嵌入凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中,從而達(dá)到緩釋的效果[18]。二者結(jié)合滿足理想眼部給藥系統(tǒng)的條件。

F127和P188是常用的凝膠基質(zhì),對(duì)黏膜的刺激性小且安全性高[19]。殼聚糖的生物相容性好、眼部耐受性高。此外,研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖能夠作為藥物穿過(guò)角膜屏障的促進(jìn)劑,能延長(zhǎng)藥物在眼球表面的停留時(shí)間,增加藥物在眼內(nèi)的滲透性,提高藥物的生物利用度[20-21]。本研究結(jié)果顯示,F127與殼聚糖的質(zhì)量比增大會(huì)使膠凝的溫度降低,而P188則相反。因此,調(diào)整3種輔料的質(zhì)量比能改變CsA眼用納米粒溫敏凝膠的溫度,制備出理想的能夠在眼部溫度下成功膠凝的溫敏凝膠。本實(shí)驗(yàn)研究3個(gè)變量對(duì)凝膠溫度的影響,不同于單因素實(shí)驗(yàn)中自變量與因變量一對(duì)一的關(guān)系,多因素之間由于存在交互作用,變量與膠凝溫度的關(guān)系無(wú)法用二維關(guān)系表示,因此需要運(yùn)用專業(yè)軟件Design Expert 13設(shè)計(jì)三維響應(yīng)面構(gòu)建凝膠處方優(yōu)化模型。

溫敏凝膠溶蝕速度受多個(gè)因素影響,包括凝膠溶蝕面積、振蕩頻率和溶蝕溫度等?？傮w而言,在滿足漏槽條件的情況下,凝膠溶蝕量與時(shí)間呈一次線性關(guān)系。溫敏凝膠的釋藥行為呈現(xiàn)出緩釋的效果,釋藥機(jī)制研究結(jié)果顯示,凝膠釋藥是溶蝕和擴(kuò)散并存的過(guò)程。

綜上所述,CsA眼用納米粒溫敏凝膠具有較理想的凝膠溫度和緩釋作用。后續(xù)還需要在細(xì)胞和動(dòng)物水平對(duì)該制劑的安全性和有效性進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。