當(dāng)歸多糖對多囊卵巢綜合征大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)改善的機(jī)制

鈕紅麗,翟一陽,王 莉,馬志賓,周曉景

1.河南大學(xué)附屬南陽市第一人民醫(yī)院生殖中心,南陽 473000;2.洛陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,洛陽 471000

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是臨床常見的內(nèi)分泌紊亂疾病[1]。PCOS易引發(fā)胰島素抵抗、血脂代謝紊亂、糖尿病等疾病[2]。目前PCOS臨床治療多以服用激素類藥物為主,存在服用周期長、毒性和不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)[3]。當(dāng)歸多糖(Angelicasinensispolysaccharide, ASP)具有抗氧自由基損傷、抗炎、降糖、降脂、補(bǔ)血、活血等藥理作用[4]。研究表明ASP可通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)緩解PCOS患者的癥狀[5]。本研究通過建立PCOS大鼠模型,探討ASP對PCOS大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的改善作用及可能的作用機(jī)制,旨在為ASP藥物的開發(fā)及PCOS的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BX53全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)(日本Olympus公司);組織切片機(jī)(RM2235,德國LEICA公司);垂直電泳儀(Bio-rad1658001,美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

當(dāng)歸多糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,貨號為Y11898,西安金萃坊植物技術(shù)開發(fā)有限公司);來曲唑片(國藥準(zhǔn)字H203428,海南錦瑞制藥有限公司);二甲雙胍(常州制藥廠有限公司);雌二醇(estradiol, E2)、促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、睪酮(testosterone, T)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone, FSH)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)試劑盒均購自北京雅安達(dá)生物科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;抗β-actin兔多克隆抗體、兔抗核因子E2相關(guān)因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 實驗動物

60只7周齡SPF級雌性SD大鼠,合格證號為SCXK(京)2016-0011,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。體質(zhì)量約為(210±20) g,清潔級飼養(yǎng),環(huán)境溫度為(23 ℃±2 ℃),環(huán)境相對濕度為55%～65%,環(huán)境光暗周期為晝12 h、夜12 h,通風(fēng)良好,所有大鼠共同進(jìn)行7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng),期間提供充足的飲水和普通飼料,飼養(yǎng)環(huán)境符合實驗動物環(huán)境設(shè)施要求。

2 方法

2.1 PCOS大鼠模型的建立

7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)選取48只大鼠每天上午同一時間灌胃給藥0.5 mg·kg-1來曲唑溶液建立PCOS模型[6],連續(xù)給藥21 d。造模第11天開始同一時間進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片,對比動情周期變化。大鼠動情周期平均為5 d,不在此范圍則視為動情周期紊亂,模型組大鼠動情周期全部無規(guī)律則視為建模成功[7]。

2.2 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、ASP低劑量組、ASP高劑量組和西藥組,各12只;其余大鼠作為對照組(12只)。參照文獻(xiàn)中的方法[8-9],ASP低劑量和高劑量組分別灌胃給藥50、200 mg·kg-1ASP(用生理鹽水配制),西藥組灌胃給藥200 mg·kg-1二甲雙胍溶液,對照組及模型組給予等量生理鹽水,各組給藥每日1次,連續(xù)給藥28 d。

2.3 標(biāo)本采集

末次給藥后,所有大鼠禁食、不禁水,24 h后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,摘取眼球取血,靜置30 min,4 ℃下以3 000 r·min-1高速離心15 min,離心半徑為12 cm,分離血清,-20 ℃保存。采血完畢,斷頭法處死大鼠。開腹采集雙側(cè)卵巢組織,分離表面脂肪與肌肉組織,稱取卵巢的質(zhì)量并測量卵巢的長度、寬度、厚度,計算卵巢體積(卵巢體積=0.52×卵巢長度×卵巢寬度×卵巢厚度,單位為mm3),一側(cè)卵巢組織于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h備用,另一側(cè)卵巢組織于-80 ℃保存,備用。

2.4 血清性激素水平測定

取出ELISA試劑盒,試劑盒放至室溫后按照試劑盒說明書配制洗滌劑、顯色劑、稀釋劑、對照品等。按照E2、FSH、LH及AMH試劑盒說明書操作,取出試劑盒中的96孔板,每孔加入工作稀釋劑50 μL,將不同質(zhì)量濃度的對照品稀釋液50 μL加入各微孔中,孵育120 min,用400 μL洗滌劑清洗微孔。將酶標(biāo)測試抗體100 μL加入各微孔中,室溫覆膜孵育120 min,用400 μL洗滌劑清洗微孔。加入顯色劑100 μL,室溫避光孵育30 min。將終止液100 μL加入各微孔中,終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在412 nm波長處測量各孔的吸光度(A)值。以對照品質(zhì)量濃度和A值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本的質(zhì)量濃度。

2.5 血清氧化應(yīng)激因子水平測定

將ELISA試劑盒平衡溫度至室溫后開始檢測,按照試劑盒說明書操作,用96孔板合理規(guī)劃空白組、樣品組、標(biāo)準(zhǔn)組,先于各微孔中加入基液20 μL,于各測定組微孔中加入待測樣品5 μL,對照品微孔中加入不同質(zhì)量濃度對照品稀釋液5 μL,用移液槍反復(fù)吹打混勻,37 ℃恒溫孵育30 min,洗滌劑清洗微孔。再將顯色液20 μL加入各微孔中,37 ℃恒溫水浴箱孵育20 min,用洗滌劑清洗微孔。將終止液50 μL加入各微孔中,待反應(yīng)完全后用酶標(biāo)儀在510 nm處測定A值,根據(jù)對照品質(zhì)量濃度及其A值導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)合待測樣品A值結(jié)果計算樣品的質(zhì)量濃度并做好記錄。

2.6 HE染色觀察

取出已固定的卵巢組織,用梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液脫水,二甲苯∶乙醇(1∶1)透明60 min,透明后浸入石蠟中,再把組織放入裝有石蠟的包埋盒中,于冷卻臺上進(jìn)行冷卻,待石蠟完全凝固,用切片機(jī)切成厚5 μm的薄片,貼于處理后的載玻片上,置于37 ℃恒溫箱中過夜,將切片再次用二甲苯、梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液進(jìn)行脫蠟復(fù)水。滴加蘇木精染色液浸染3 min,流水沖洗4 min去除多余染劑,吸取伊紅乙醇溶液復(fù)染30 s,流水沖洗4 min,脫水透明,吸取中性樹膠滴于組織處,平整按壓蓋玻片以避免氣泡產(chǎn)生,封存固定,最后將切片置于光學(xué)顯微鏡下,觀察卵巢組織的病理變化并拍照。

2.7 Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)水平

取出冷凍備用的卵巢組織,解凍后剪碎,置于EP管中,加入TRIzoL 500 μL,反應(yīng)后移入研磨管內(nèi)充分研磨,勻漿液裂解后在4 ℃以12 000 r·min-1高速離心10 min,吸取上清液,加入氯仿,離心后加入異丙醇,得到的沉淀即為粗純度RNA,將質(zhì)量濃度測定合格的RNA樣品定容至統(tǒng)一質(zhì)量濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。構(gòu)建PCR反應(yīng)體系,Mix Ex Taq 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,RNase free-ddH2O 7 μL。引物序列:Nrf2上游(5′-TACCGTAGGTCAGCACCAGA-3′),下游(5′-GTTTGGGAATGTGGGCAACC-3′);HO-1上游(5′-CAGATCACATGCCTTTGCCG-3′),下游(5′-TGGTTCTGCTTTGGGGTGTT-3′);β-actin上游(5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′),下游(5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′)。循環(huán)參數(shù):95 ℃變性反應(yīng)15 s,60 ℃持續(xù)退火15 s,72 ℃ 30 s進(jìn)行延伸,40個循環(huán)。分析模式為定量分析,生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線,用2-△△CT法計算目的基因相對于內(nèi)參的表達(dá)量。

2.8 Western blotting檢測Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平

取適量卵巢組織剪碎,用細(xì)胞裂解液提取總蛋白,在4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為12 cm,取上清液用BCA法檢測總蛋白質(zhì)量濃度,加入3×蛋白上樣緩沖液,沸水加熱5 min使蛋白完全變性,冷卻制成加樣液。配制好預(yù)制膠,拔出梳子加至電泳槽,將Marker和待測蛋白樣品100 μL加入上樣孔中,恒壓150 V電泳60 min即停止。于220 mA、45 min內(nèi)轉(zhuǎn)至浸泡好的PDVF膜,再浸入脫脂奶粉于搖床上封閉2 h,將目的蛋白一抗按1∶1 000稀釋,加入稀釋一抗,4 ℃過夜,TBST漂洗3次。再加入1∶2 000稀釋二抗,孵育2 h,回收二抗,TBST漂洗3次。滴加ECL發(fā)光液,放入發(fā)光成像儀中顯影曝光,觀察條帶的灰度值,并計算目的蛋白的表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血清性激素水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清E2和FSH水平降低,T和LH水平升高(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠血清E2和FSH水平升高,T和LH水平下降(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠血清E2和FSH水平升高,T和LH水平下降(P<0.05)。ASP高劑量組血清E2、FSH、T和LH水平與西藥組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3.2 血清氧化應(yīng)激水平比較

與對照組比較,模型組大鼠血清MDA水平升高,GSH-Px和SOD水平降低(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠血清MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠血清MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平升高(P<0.05);ASP高劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平的比較

3.3 卵巢質(zhì)量與體積比較

與對照組比較,模型組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢體積增大(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組大鼠卵巢質(zhì)量和卵巢體積減小(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠的卵巢質(zhì)量和卵巢體積減小(P<0.05),2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠卵巢質(zhì)量與體積的比較

3.4 卵巢組織染色比較

對照組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)完整,各級卵泡和黃體清晰可見,發(fā)育形態(tài)正常;可見多層顆粒細(xì)胞排列緊密,無水腫和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。模型組大鼠卵巢組織囊泡明顯擴(kuò)張,各級卵泡和黃體數(shù)量減少,發(fā)育形態(tài)異常;顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯減少且排列松散、紊亂,存在大量炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。與模型組比較,3個給藥組大鼠卵巢組織囊性擴(kuò)張現(xiàn)象明顯改善,可見各級卵泡和黃體,顆粒細(xì)胞層數(shù)增加且排列緊密,炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減少。見圖1。

注: A.對照組;B.模型組;C.ASP低劑量組;D.ASP高劑量組;E.西藥組。

3.5 Nrf2、HO-1 mRNA水平比較

與對照組比較,模型組卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)水平下降(P<0.05)。與模型組比較,3個給藥組卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)水平升高(P<0.05)。與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA的表達(dá)水平升高(P<0.05),ASP高劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠卵巢組織Nrf2、HO-1 mRNA水平的比較

3.6 Nrf2、HO-1蛋白水平比較

與對照組比較,模型組卵巢組織Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平下降(P<0.05);與模型組比較,3個給藥組卵巢組織Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05);與ASP低劑量組比較,ASP高劑量組和西藥組大鼠卵巢組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5、圖2。

注:A.對照組;B.模型組;C.ASP低劑量組;D.ASP高劑量組;E.西藥組。

表5 各組大鼠卵巢組織Nrf2、HO-1蛋白水平的比較

4 討論

PCOS患者機(jī)體對胰島素的敏感性低,使胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的作用無法發(fā)揮,機(jī)體代償性分泌過多胰島素,以致垂體胰島素受體釋放過多LH,促進(jìn)T分泌,引起性激素水平紊亂[10-11]。治療時首選激素藥物,提高患者排卵后孕激素水平、改善黃體功能,但對卵巢功能修復(fù)效果不佳[12]。PCOS患者存在生殖障礙,不易受孕,雖然可通過促進(jìn)排卵和調(diào)節(jié)激素水平增加受孕機(jī)會,但是卵巢功能差、囊性擴(kuò)張仍會使患者流產(chǎn)風(fēng)險遠(yuǎn)高于正常孕婦[13-14]。ASP是從當(dāng)歸干燥根中提取的水溶性成分,能通過質(zhì)量濃度依賴方式改善氧化損傷[15-16]。本研究用來曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型,從分子機(jī)制上探討ASP對PCOS大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和卵巢功能的修復(fù)作用。結(jié)果顯示,模型組大鼠血清E2、FSH、GSH-Px和SOD的水平降低,T、LH和MDA的水平升高,表明模型組大鼠PCOS模型建立成功,出現(xiàn)明顯性激素紊亂、代謝受到影響且處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。給予不同劑量ASP和西藥的大鼠血清E2、FSH、GSH-Px和SOD水平均升高,T、LH和MDA水平降低,表明ASP可以改善PCOS大鼠性激素水平,降低體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。另外,ASP各劑量組和西藥組大鼠卵巢組織HE染色結(jié)果也表明,大鼠卵巢囊樣擴(kuò)張現(xiàn)象得到改善,間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少。

HO-1是細(xì)胞Ⅱ期酶家族成員之一,在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、對抗由過氧化產(chǎn)生的活性氧自由基中發(fā)揮著重要作用[17-18]。Nrf2可調(diào)節(jié)Ⅱ期酶上游活性轉(zhuǎn)錄因子,正常情況下,Nrf2與ECH-1蛋白穩(wěn)固結(jié)合而失去活性,受到機(jī)體氧化應(yīng)激刺激時,Nrf2與ECH-1蛋白分離并通過調(diào)控HO-1提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性,減輕機(jī)體氧化損傷,因此,Nrf2/HO-1信號通路是調(diào)控氧化應(yīng)激損傷的重要通路[19-20]。在本研究中,與模型組比較,ASP各劑量組和西藥組大鼠卵巢組織Nrf2和HO-1 mRNA蛋白的表達(dá)水平升高,卵巢質(zhì)量和卵巢體積均減小,結(jié)合氧化因子水平變化,表明ASP可以有效減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。

綜上所述,ASP能夠調(diào)整PCOS大鼠血清氧化因子水平,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),改善卵巢囊樣擴(kuò)張,可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路發(fā)揮作用的,可為臨床治療PCOS提供實驗依據(jù)。