半刺厚唇魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定

張晶晶

（福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州 350002）

0 引言

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)是隸屬于氣單胞菌科，氣單胞菌屬的革蘭氏陰性致病菌。其最適生長(zhǎng)溫度為28～37℃[1]，夏、秋兩季在水體環(huán)境中繁殖最快。作為一種條件致病菌，維氏氣單胞菌廣泛存在于自然界水體、土壤和水生動(dòng)物體中，并且在人、獸和水生動(dòng)物中都有相關(guān)的感染報(bào)道[2]。維氏氣單胞引起的水生動(dòng)物疾病在全國范圍可見廣泛報(bào)道，感染魚體常出現(xiàn)體表潰爛出血、剖檢可見內(nèi)臟器受損出血，且伴隨腸炎、腹水等癥狀，嚴(yán)重時(shí)魚體可發(fā)生較高的死亡率[3]。目前感染的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物有克氏原螫蝦[4]、西伯利亞鱘[5]、羅非魚[6]、錦鯉[7]、虹鱒[8]、大黃魚[9]、草魚[10-11]、鰻鱺[12]等。

半刺厚唇魚(Acrossocheilus hemispinus)，俗稱“石板魚”、“坑魚”，隸屬于鯉科(Cyprindae)、鲃亞科(Barbinae)、光唇魚屬(Acrossocheilus)，主要分布于福建省的閩江、九龍江、交溪、霍童溪等江河水系和湖南省的湘江、資水、沅水、澧水[13]。半刺厚唇魚肉質(zhì)嫩滑、味道鮮美，在閩浙一帶深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏?。由于傳統(tǒng)棲息環(huán)境的破壞、非法捕撈和濫捕、各種污染源破壞等，野生種質(zhì)資源量銳減，為了保護(hù)其野生種質(zhì)資源，福建省將半刺厚唇魚納入《福建省水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)規(guī)劃》保護(hù)經(jīng)濟(jì)物種，并建立了浦城縣南浦溪和順昌縣麻溪2個(gè)半刺厚唇魚國家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)。近年來相關(guān)科研院所在半刺厚唇魚人工繁育、苗種培育、飼料營(yíng)養(yǎng)、病害防治等技術(shù)研究方面取得了一定的突破[14-15]，但是由于半刺厚唇魚養(yǎng)殖處于剛發(fā)展階段，有關(guān)養(yǎng)殖過程中的病害研究相對(duì)較少，目前僅有小瓜蟲寄生蟲[16]、寄生性嗜酸性卵甲藻[17]和扁彎口吸蟲[18]感染的報(bào)道，未見細(xì)菌性感染報(bào)道。

2021 年8 月順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖半刺厚唇魚陸續(xù)發(fā)生少量死亡，死亡魚體皮膚潰爛形成潰瘍?cè)睢⑽馋挸溲?，眼部發(fā)紅渾濁，剖檢可見肝腎、脾臟腫大與出血；養(yǎng)殖池發(fā)病魚體出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、體色偏黑、食欲不振等癥狀。本研究開展病魚的細(xì)菌分離純化和鑒定與致病性研究，明確了發(fā)病病原為維氏氣單胞菌溫和生物型，同時(shí)開展了分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)，為養(yǎng)殖生產(chǎn)中疾病的防控提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

具有典型癥狀的發(fā)病半刺厚唇魚（體質(zhì)量85～120 g）和回歸感染用健康半刺厚唇魚（體質(zhì)量35～40 g），均由順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司提供。營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、羊血瓊脂平板、甲基紅、纖維二糖、D-甘露醇、七葉苷、水楊苷、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。DNA 2×Premix Taq 聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，DNA Marker購自北京擎科生物科技有限公司。引物合成與測(cè)序送至上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司完成。

1.2 致病菌的分離與純化

取發(fā)病癥狀典型的患病半刺厚唇魚，在無菌超凈臺(tái)用滅菌鑷子挑取少量肝、脾、腎組織，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線，28℃恒溫培養(yǎng)。24 h后挑取平板上優(yōu)勢(shì)菌落，重復(fù)劃線純化3 次。純化菌株于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面5℃冰箱和25%甘油的LB液體-80℃低溫冰箱保存。

1.3 回歸感染實(shí)驗(yàn)

健康半刺厚唇魚于100 L連續(xù)爆氣的玻璃缸暫養(yǎng)2 周，溫度控制26～28℃。純化的菌株過夜培養(yǎng)后，用0.9%無菌生理鹽水清洗，10倍稀釋制成不同濃度菌懸液。回歸感染設(shè)置6組，每組7尾健康半刺厚唇魚，背部肌肉注射不同濃度細(xì)菌懸液0.1 mL，對(duì)照組注射0.1 mL 0.9%無菌生理鹽水。同時(shí)，平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌懸液濃度。試驗(yàn)期間不投餌，每天換水1次，每次換水40%，水溫控制26～28℃。每天記錄各組發(fā)病情況，對(duì)瀕臨死亡、癥狀明顯的患病魚體再次分離和純化細(xì)菌。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察純化的菌株于28℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體染色以及形態(tài)特征。

1.4.2 生理生化特性測(cè)定使用梅里埃公司的VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行分析，對(duì)照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[1]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[19]，補(bǔ)充甲基紅、纖維二糖、D-甘露醇、水楊苷、七葉苷、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、羊血瓊脂溶血實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 16S rDNA與gyrB基因分子鑒定用接菌環(huán)挑取純化菌株單菌落于無菌離心管中，加入500μL無菌雙蒸水，渦旋30 s，置95℃水浴5 min，12000 r/min 離心2 min，取上清液為DNA 模板。16S rDNA 通用引物上、下游引物序列分別為 AGAGTTT GATCCTGGCTCAG 和 TACGGCTAC CTTGTTAC GACTT[20]；gyrB 上、下游引物序列分別為TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 和TTGTCC GGGT TGTACTCGTC[21-22]。PCR 反應(yīng)體系50 μL：2×Premix Taq 25 μL，DNA 模板4 μL，上下游引物各1 μL(10μmol/L)，ddH2O 19μL。16S rDNA 序列的PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。gyrB基因PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，66℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，34 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在BLSAT(Basic Local Alignment Search Tool)網(wǎng)站進(jìn)行線上序列同源性比對(duì)，采用MEGA11.0.10 軟件鄰接法(Neighbor joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)定Bootstrap為1000。

1.5 毒力基因擴(kuò)增

合成細(xì)胞毒性腸毒素(ast、act、alt)、氣溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、IV 型菌毛基因(tapA)引物[23-25]（表1）。PCR反應(yīng)體系25μL，其中2×Premix Taq 12.5μL，DNA模板2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)如下：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，act退火溫度55℃，延伸20 s，ast退火溫度55℃，延伸25 s，alt退火溫度55℃，延伸30 s，aerA退火溫度68℃，延伸時(shí)間30 s，hlyA退火溫度62℃，延伸時(shí)間40 s，tapA退火溫度55℃，延伸時(shí)間40 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序分析。

1.6 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

純化菌株過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于無菌生理鹽水制成菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛认♂?.5麥?zhǔn)蠞岫?1.0×108CFU/mL)，取100μL 稀釋菌懸液均勻涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，待平板表面干后，將藥敏紙片粘貼于平板表面，每種藥物3個(gè)平行，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量平板上的抑菌圈并計(jì)算平均值，根據(jù)產(chǎn)品說明書判斷該細(xì)菌的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)特征

從癥狀典型瀕死亡魚體肝臟分離純化得到單一優(yōu)勢(shì)菌株，將其命名為AS0829L1。菌株過夜培養(yǎng)后出現(xiàn)圓形凸起，表面光滑濕潤(rùn)的灰黃色菌落，菌體直徑約為2～4 mm（圖1）。細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果陰性，兩端鈍圓，短桿狀（圖2）。

圖1 AS0829L1培養(yǎng)菌落形態(tài)

圖2 AS0829L1菌株革蘭氏染色陰性(100×)

2.2 回歸感染實(shí)驗(yàn)

對(duì)健康半刺厚唇魚實(shí)驗(yàn)魚背部注射菌液，注射濃度分別為5×1010、5×109、5×108、5×107、5×106CFU/mL?；貧w感染后第1 天，5×1010CFU/mL 濃度組全部死亡，5×109CFU/mL濃度組死亡率71.4%，第2天全部死亡；5×108CFU/mL濃度組第3天出現(xiàn)死亡，至14 d死亡率為28.6%，其他濃度組以及對(duì)照組無死亡情況（表2）。實(shí)驗(yàn)組活動(dòng)異常，部分魚呈現(xiàn)體表發(fā)紅、潰爛、鱗片脫落、爛尾等癥狀，剖檢可見肝臟發(fā)黃發(fā)白、脾臟發(fā)黑腫大（圖3）。

圖3 人工感染后半刺厚唇魚出現(xiàn)的癥狀

表2 分離菌株AS0829L1回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離菌株16S rDNA和gyrB基因序列的擴(kuò)增與分析

16S rDNA通用引物和gyrB基因特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果分別獲得大小為1452 bp（GenBank 號(hào)OP268346）和1080 bp（GenBank 號(hào)OP311617）的序列。通過NCBI 的Blast 程序進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示菌株序列與維氏氣單胞菌(A.veronii)同源性最高，分別達(dá)到99.93%（登錄號(hào)MF716690.1）和99.34%（登錄號(hào)KJ747137.1）。根據(jù)16SrDNA 與gyrB 基因序列采用NJ 法分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，AS0829L1 菌株與維氏氣單胞菌聚為一類，可確定分離菌為維氏氣單胞菌（圖4）。

圖4 分離菌株16S rDNA序列(a)與gyrB基因序列(b)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 生理生化鑒定

2.4.1 生理生化鑒定VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定菌株與氣單胞菌屬的溫和氣單胞菌的相應(yīng)特征相符，置信度89%，α-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)陽性，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶陽性，與溫和氣單胞菌生理生化特征不符（表3）。補(bǔ)充生化檢測(cè)結(jié)果，甲基紅、纖維二糖、D-甘露醇為陽性，水楊苷、鳥氨酸脫羧酶為陰性，羊血-瓊脂溶血實(shí)驗(yàn)呈β-溶血（圖5），根據(jù)伯杰氏細(xì)菌分類手冊(cè)[1]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[26]，綜合生化反應(yīng)結(jié)果該分離菌可鑒定為維氏氣單胞菌。

圖5 AS0829L1菌株溶血性β-溶血

表3 分離菌株AS0829L1生理生化鑒定結(jié)果

2.4.2 菌株生物型鑒定維氏氣單胞菌溫和生物型具有act、aer A、alt、hly A、tap A基因，維氏氣單胞菌維羅納生物型具有ast、alt、act、hlyA、aer A基因[25,27]（表1）。分離菌株毒力基因擴(kuò)增得到act、aer A、alt、hly A、tap A（圖6），因此，此檢測(cè)結(jié)果與維氏氣單胞菌溫和生物型一致。精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和七葉苷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，精氨酸雙水解為陽性，賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)為陰性，七葉苷水解實(shí)驗(yàn)為陰性。維氏氣單胞菌溫和生物型精氨酸雙水解為陰性，賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)為陽性，七葉苷水解實(shí)驗(yàn)為陽性，維氏氣單胞菌維羅納生物型精氨酸雙水解為陽性，賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)為陰性，七葉苷水解實(shí)驗(yàn)為陰性[26]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合維氏氣單胞菌溫和生物型特征。

圖6 毒力基因擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.5 藥物敏感性

由表4 可知，菌株AS0829L1 對(duì)所測(cè)試的37 種抗菌藥物中的β-內(nèi)酰胺類的頭孢曲松、頭孢派酮、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢銨芐、頭孢拉定，氨基糖苷類卡那霉素、慶大霉素、新霉素、丁胺卡那，磺胺類復(fù)方新諾敏、甲氧芐啶，喹諾酮類環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星；氯霉素類氯霉素，糖肽類多粘霉素B，青霉素類派拉西林鈉，硝基呋喃類呋喃唑酮20種藥物高度敏感；對(duì)β-內(nèi)酰胺類羧芐西林，氨基酸苷類鏈霉素，氯霉素類氟苯尼考，福霉素類利福平，米諾環(huán)素類二甲胺四環(huán)素5種藥物中度敏感；對(duì)β-內(nèi)酰胺類的青霉素，喹諾酮類的諾氟沙星，大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、羅紅霉素、麥迪霉素，四環(huán)素類的四環(huán)素、多西環(huán)素，糖肽類的萬古霉素，林可酰胺類的克林霉素、青霉素類阿莫西林、苯唑西林、硝基咪唑類抗生素甲硝唑12種藥物耐藥。

表4 分離菌株AS0829L1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

維氏氣單胞菌是一種人、獸、魚共患病原菌，與其他致病菌相比，維氏氣單胞菌感染的魚類物種范圍更廣，可引起蝦類[4]、蟹類[28]、貝類[29]和魚類等水產(chǎn)動(dòng)物致病。感染維氏氣單胞菌的魚體癥狀各有差異，但主要以皮膚潰瘍，臟器出血和嚴(yán)重腹水等癥狀為主。相關(guān)報(bào)道表明，維氏氣單胞可引起鯉魚和鱸魚的紅腫病，病魚腹部出現(xiàn)紅斑，肛門紅腫等癥狀[30-31]；羅非魚、鱸魚、鯽魚、鯉魚、和西伯利亞鱘魚的出血性敗血癥，主要癥狀表現(xiàn)為體表及內(nèi)臟的出血、充血等[32-33]；青蝦的“軟殼綜合征”，主要癥狀表現(xiàn)為軟殼、掉肢、肌肉水腫等[34]；黃顙魚的“潰瘍綜合征”，主要癥狀表現(xiàn)為體表潰瘍和潰爛等[35]。

16S rDNA序列分析是細(xì)菌種屬鑒定的常用方法，但在區(qū)分種間親緣關(guān)系較近的菌株準(zhǔn)確性較差[36]。gyrB基因編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，在細(xì)菌中普遍存在且不會(huì)發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移，更適合親緣關(guān)系較近的菌種鑒別[10]。溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌理化特性比較接近，因此這2 種氣單胞菌在鑒定時(shí)容易混淆[37-38]，本研究同時(shí)選用16S rDNA和gyrB基因?qū)Σ≡M(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析區(qū)分二者。在生理生化鑒定方面，東秀珠等[26]認(rèn)為增加靛基質(zhì)、V-P 試驗(yàn)、纖維二糖、甘油、蔗糖產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)氣等項(xiàng)目將二者區(qū)分開。Brenner等[1]認(rèn)為通過羊血平板溶血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證菌株溶血能力也可區(qū)分兩者。

維氏氣單胞菌有維氏氣單胞菌維羅納和維氏氣單胞菌溫和2 種生物型，其中維氏氣單胞菌溫和生物型致病性較強(qiáng)，危害較大[39]。國內(nèi)水生生物感染維氏氣單胞菌的報(bào)道多集中在維氏氣單胞菌溫和生物型，其可引起大口黑鱸肝脾腫大、腎臟出血、體表鱗片脫落及出血，腹腔注射攻毒3×107、1.5×108、3×108CFU/mL 可分別導(dǎo)致7%、40%、100%的死亡率[40]；黃鱔全身出血，腹部腫脹，肛門紅腫，解剖可見腸道出血，該菌對(duì)黃鱔的半致死濃度約為5.79×107CFU/mL[41]；青蝦掉肢、軟殼、肝胰腺發(fā)黃和肌肉水腫，該菌對(duì)青蝦的半數(shù)致死濃度為1.47×106CFU/mL 等[42]。本研究AS0829L1 菌株攻毒健康半刺厚唇魚，出現(xiàn)體表發(fā)紅潰爛、鱗片脫落、尾柄腐爛等癥狀，5×108CFU/mL菌液可導(dǎo)致健康魚體28.6%死亡，與相關(guān)報(bào)道的維氏氣單胞菌溫和型相比，該菌株毒力較為溫和，這與自然發(fā)病魚體治療前持續(xù)5 d保持日死亡量20～40條（全池約3000條），未出現(xiàn)爆發(fā)死亡的實(shí)際情況相符。

維氏氣單胞菌的致病性與毒力基因的種類、數(shù)量存在一定的相關(guān)性。目前研究對(duì)維氏氣單胞的致病機(jī)制了解較少且主要針對(duì)單一毒力因子的研究，如氣溶素、溶血素、腸毒素、外膜蛋白、菌毛、鞭毛、蛋白酶、黏附因子等[3]。本研究檢測(cè)到了5種毒力基因，其中aerA是一種能引起β型溶血能改變細(xì)胞膜的通透性的穿孔毒素，導(dǎo)致宿主內(nèi)臟器官與體表出血[43-44]；細(xì)胞毒性腸毒素(Act)能夠引起溶血、細(xì)胞毒性和腸毒性；不耐熱細(xì)胞腸毒素(Alt)能夠增加腸上皮細(xì)胞cAMP和前列腺素的水平，刺激宿主促炎反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[45]。溶血素hlyA可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的滲透性裂解和完全溶血，在維氏氣單胞菌的致病過程中起到關(guān)鍵的作用[46]。tapA參與維氏氣單胞Tap IV 型菌毛形成，Tap 菌毛的生物合成對(duì)維氏氣單胞的毒力產(chǎn)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究[3]。

細(xì)菌的藥物敏感性與分離菌株的地域、季節(jié)、寄生宿主有很大的關(guān)聯(lián)性。本研究的藥敏實(shí)驗(yàn)共分析了37 種藥物，其中耐藥藥物12 種，包括青霉素、諾氟沙星、紅霉素、羅紅霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、萬古霉素、克林霉素、阿莫西林、苯唑西林、甲硝唑。耿昕穎等[47]從東北區(qū)域分離的52 株的維氏氣單胞菌菌株對(duì)慶大霉素、阿莫西林、紅霉素全部耐藥，對(duì)阿米卡星、磺胺間甲氧嘧啶和阿奇霉素的耐藥率也較高。周光等[48]從團(tuán)頭魴養(yǎng)殖池分離鑒定了56株維氏氣單胞，藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對(duì)氨芐西林耐藥，對(duì)諾氟沙星、復(fù)方新諾明、洛美沙星的耐藥性也較高。Sáncheza等[49]從虹鱒魚分離的11 株維氏氣單胞菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有分離的菌株對(duì)頭孢拉素類藥物呈現(xiàn)耐藥性。所以從不同地域、不同魚體分離的菌株對(duì)抗生素均存在不同程度的抗性，而且耐藥水平存在一定差異。因此在細(xì)菌性疾病防治之前，應(yīng)對(duì)病原進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，確定敏感藥物，做到精準(zhǔn)、科學(xué)、有效用藥。

4 結(jié)論

本研究對(duì)人工養(yǎng)殖出現(xiàn)皮膚潰爛、尾鰭出血、肝臟腫大的半刺厚唇魚進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定以及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。從癥狀典型的病魚肝組織分離純化到菌株AS0829L1，并由人工回歸感染證實(shí)為致病菌。分離菌株理生化特性鑒定，16S rDNA、gyrB 基因序列分析以及毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明AS0829L1菌株為維氏氣單胞菌溫和生物型。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)證明該菌株對(duì)頭孢曲松、頭孢派酮、慶大霉素、新霉素、恩諾沙星、氧氟沙星等20種藥物高度敏感，對(duì)羧芐西林、鏈霉素、氟苯尼考等5 種藥物中度敏感，對(duì)青霉素、諾氟沙星、紅霉素等12種藥物不敏感。