一種可以應(yīng)用于脂滴成像的希夫堿類衍生物

程文靜，張 瑜，王 林，甄 帥，呼 蕾

脂滴是真菌、植物和動物體內(nèi)普遍存在的富含脂質(zhì)的細(xì)胞器， 在多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴（lipid droplets，LD）是富含脂質(zhì)的球形細(xì)胞器， 它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER） 衍生的細(xì)胞器， 主要由甘油三酯和膽固醇酯組成，并被磷脂單分子膜和相關(guān)蛋白包圍，使它們與所有其他細(xì)胞器區(qū)分開，被認(rèn)為是用于能量存儲的惰性儲存庫[2]。 LD 是具有生命力的動態(tài)物體，其具有必要的細(xì)胞分配功能，包括膜運(yùn)輸、融合和參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最近的證據(jù)表明，LD 和許多生理過程都與脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。 近年來人們對LD產(chǎn)生了極大的興趣。 LD 的異常蓄積與肥胖、 高脂血癥、肝囊腫、動脈粥樣硬化和腎癌等癌癥有關(guān)[4]。此外，LD 還與炎癥和傳染病有關(guān)[5]。據(jù)報(bào)道，LD 參與了各類病原體的傳染病發(fā)病機(jī)制，如病毒[6]、細(xì)菌[7]、真菌[8]、原生生物[9]，這表明LD 參與宿主對感染的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。 宿主LD 也可能被利用作為病原體逃避免疫系統(tǒng)適應(yīng)的一部分，并作為細(xì)胞內(nèi)病原體的能量來源[10，11]。 因此，準(zhǔn)確監(jiān)測LD 對分析其生物代謝至關(guān)重要，有助于診斷相關(guān)早期疾病。

脂滴的固有環(huán)境是親脂性的。 據(jù)此判斷具有高疏水性的親脂性有機(jī)染料可能具有潛在的脂滴染色能力。 帶受體-供體的有機(jī)染料通過引入大雜環(huán)來增加受體的吸電子能力， 得到的有機(jī)染料通常表現(xiàn)出更紅的熒光、 更高的疏水性和更大的雙光子吸收截面，但細(xì)胞穿透性較低。 因此應(yīng)調(diào)整疏水性和細(xì)胞滲透性之間的平衡。然而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的空間非常有限。另一方面，基于二萘酰亞胺的供體-受體分子已被證明是活體細(xì)胞熒光檢測和生物成像的優(yōu)異探針[12]。通過引入二萘酰亞胺的受體單元， 筆者合成了一個(gè)新的基于芘的希夫堿類脂滴熒光探針——1 氫-苯并異喹啉衍生物[1-pyrenecarboxaldehyde，2-（2，3-dihydro-1，3-dioxo-2-propyl-6-yl）hydrazone，BPD]，用于活細(xì)胞中的脂滴可視化并實(shí)現(xiàn)了對脂滴的可視化成像， 為實(shí)時(shí)檢測脂滴動態(tài)水平提供了一種可行的方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4-溴-1，8-萘二甲酸酐、正丙胺、80%水合肼、1-芘甲醛、冰醋酸、無水乙醇、甲醇、二氯甲烷（分析純。富宇化工，中國）、普朗克127（中國阿拉丁試劑公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

V-550 紫外可見分光光度計(jì) （SHIMADZU 島津公司，日本）；F-4700 熒光光譜儀（日立公司，中國）；FM4 積分球；MercuryPlus-400 核磁共振光譜儀（Bruker 布魯克公司， 瑞士）；WATERS I-Class VION IMS QTof 質(zhì)譜儀 （沃特世科技公司， 美國）；Nikon A1MP（尼康公司，日本）；120 kV 投射電子顯微鏡（賽默飛科技公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 探針分子的合成方法

探針分子的合成分為三步。首先以4-溴-1，8-二萘酸酐和丙胺為原料在無水乙醇溶劑中合成S1，然后將S1 與過量的80%水合肼反應(yīng)得S2， 之后進(jìn)一步與1-比甲醛反應(yīng)得到脂滴探針分子芘希夫堿類的衍生物BPD。 合成路線如圖1。

圖1 探針BPD 的合成路線Fig.1 Diagram of synthetic route of probe BPD

1.2.1.1 4-溴-N-丙基-1，8-萘二甲酰亞胺（S1）的合成 分別稱取1 108 mg 的4-溴-1，8-萘二甲酸酐（4 mmol）和236 mg 正丙胺（4 mmol），置于20 mL 甲醇溶液中，于氮?dú)夥諊聞×覕嚢枭郎赜?5 ℃，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色由淺黃色變?yōu)闇\棕色。 持續(xù)反應(yīng)8 h 后，將整個(gè)體系冷卻至室溫，有淺棕色固體析出、過濾，用冰甲醇溶液反復(fù)洗滌3 次，然后放入溫度設(shè)置為40 ℃的真空干燥箱中干燥， 得到粗產(chǎn)物4-溴-N-丙基-1，8-萘二甲酰亞胺，即S1。

1.2.1.2 6-肼基-2-丙基-1H-苯并異喹啉-1，3-（2H）-二酮（S2）的合成 將312 mg 4-溴-N-丙基-1，8-萘二甲酰亞胺溶液（0.8 mmol）置于圓底燒瓶中，加入15 mL 甲醇溶液，之后滴加1.5 ～2.0 mL 80%水合肼溶液（大大過量）于圓底燒瓶中，于下劇烈攪拌下回流過夜；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系顏色由淺棕色逐漸變?yōu)槌壬?，反?yīng)完成后，倒入100 mL 冰水中，有大量沉淀析出，過濾，用冰水反復(fù)洗滌3 ～5 次，于真空干燥箱干燥后得粗產(chǎn)物， 經(jīng)真空干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物6-肼基-2-丙基-1H-苯并異喹啉-1，3-（2H）-二酮，即S2。

1.2.1.3 芘希夫堿類的衍生物BPD 的合成 將240 mg 6-肼基-2-丙基-1H-苯并異喹啉-1，3-（2H）-二酮（0.5 mmol）和115 mg 1-芘甲醛（0.5 mmol）置于盛有10 mL 的圓底燒瓶中，加入1 滴冰醋酸溶液，回流反應(yīng)5 h；冷卻至室溫后析出大量紅橙色沉淀，過濾，于真空干燥箱中干燥后得到紅橙色固體，用甲醇溶液進(jìn)行重結(jié)晶最終得到目標(biāo)產(chǎn)物，即芘希夫堿類的衍生物BPD。

1.2.2 結(jié)構(gòu)表征方法

用MercuryPlus-400 核磁共振光譜儀測量化合物的核磁共振氫譜（nuclear magnetic resonance1H spectrum，1H-NMR）；F-4700 熒光光譜儀用于測試熒光光譜；FM4 積分球用于測試熒光量子產(chǎn)率；WATERS IClass VION IMS QTof 質(zhì)譜儀用于測試高分辨質(zhì)譜。

1.2.2.1 熒光光譜測試 稱取目標(biāo)分子2.4 mg，轉(zhuǎn)移至干燥的容量瓶中。 用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）定容至5 mL，得到濃度為10–3mol/L 的探針分子母液。 熒光光譜測量時(shí)激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5 nm，激發(fā)波長380 nm，在不同溶劑的發(fā)射波長為510 ～600 nm。

1.2.2.2 光物理特性和pH 依賴性測試 研究BPD在DMSO、乙腈、丙酮四氫呋喃甲苯正己烷常用溶劑中的光物理特征（V-550 紫外可見分光光度計(jì)）。為了在生理環(huán)境中監(jiān)視細(xì)胞中的脂滴， 探針應(yīng)在較寬的pH 范圍內(nèi)保持穩(wěn)定性。 因此，分別測量了在各種pH環(huán)境下的BPD 的熒光光譜。 通過熒光強(qiáng)度變化來表征探針的穩(wěn)定性。

1.2.3 探針BPD-納米顆粒的制備和測量

為了使其具有水溶性， 將10 mg 探針BPD 溶于10 mL 四氫呋喃中，加入80 mg 普朗克F127（一種兩親性聚合物），超聲溶解后，迅速倒入100 mL 去離子水中，攪拌12 h，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，得到水溶性的BPD 納米顆粒（nano-particles，NP），使用超濾離心管濃縮至10 μmol/L。 對其進(jìn)行動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS） 測試， 使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）進(jìn)行測試。

1.2.4 選擇性測試和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

V-550 紫外可見分光光度計(jì)用于測試吸收光譜；徠卡共聚焦顯微鏡（德國，SP8 DIVE）用來進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn)。

通過測試光密度， 研究底物F-、Cl-、Br-、I-、CN-、CO32-、NO2-、PO32-、SCN-、SO32-、ClO-、H2O2、SO42-、Al3+、Ca2+、Co2+、Cr2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Ni+、Zn2+、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia，Hcy）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、葡萄糖（glucose）對BPD 熒光特性的研究。 熒光強(qiáng)度與對照組無太大變化，則說明研究底物對探針無識別干擾。 使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行了生物成像，BPD 探針孵育Hela 細(xì)胞30 min，反復(fù)洗滌3 次后，放置于共聚焦顯微鏡下成像，采用四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 進(jìn)行探針BPD 的細(xì)胞毒性測試。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較行t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)表征

BPD 分子的核磁共振峰提示結(jié)構(gòu)為1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：0.90 （t，J = 8.2，3H），1.95（m，2H），3.89（t，J=8.4，2H），7.88（m，2H），8.22（t，J =8.2，1H），8.33（t，J = 12.0，2H），8.39（m，5H），8.42（d，J=12.0，1H），8.49（d，J=8.0，1H），8.73（t，J=8.4，2H），8.85（d，J = 8.4，1H），11.69（s，1H）。 MS（mass m/z）：482.1794[M+H]+。 見圖2。

圖2 BPD 探針的氫譜Fig.2 Diagram of hydrogen spectrum of probe

2.2 探針BPD 的理論計(jì)算

通過Gaussian 09 研究了BPD 在水中的理論計(jì)算[基組為B3LYP/6-31G（d，p）]。 如圖3 所示，最高占據(jù)分子軌道 （highest occupied molecular orbital，HOMO）和最低占據(jù)分子軌道（lowest unoccupied molecular orbital，LOMO）狀態(tài)下的能量為負(fù)值（分別為- 2.34 eV、-5.46 eV），表明探針是穩(wěn)定的。 計(jì)算得到的理論偶極矩為10.49 D。 此外，能隙為3.12 eV，這意味著探針具有高的穩(wěn)定性和高的化學(xué)硬度。探針在水中的熒光很弱，可能歸因于水分子進(jìn)攻分子的受體部分；此外，芘基團(tuán)與1，8-二萘酸酐基團(tuán)之間存在較大的二面角，這二者導(dǎo)致了分子在水中的熒光很弱。

圖3 BPD 的理論計(jì)算Fig.3 Diagrams of theoretical calculation of BPD

2.3 探針BPD 的光物理性質(zhì)

探針在不同有機(jī)溶劑中的紫外吸收光譜和熒光光譜表明，隨著溶劑極性的增加，探針BPD 顯示出明顯的熒光峰紅移（表1）。探針BPD 在從520 nm（非極性溶劑正己烷）到590 nm（極性溶劑水）上表現(xiàn)出較大的熒光發(fā)射紅移（約70 nm）（圖4a）并且伴隨著明顯的顏色變化（綠色到橙色）。此外，探針BPD 在純水中熒光發(fā)射微弱， 而熒光強(qiáng)度隨著1，4-二氧六環(huán)比例的增加而逐漸增高，并伴隨著明顯的藍(lán)移最大發(fā)射從590 nm（水）到530 nm（1，4-二氧六環(huán)），這是由于分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移作用（圖4b）。 探針在1，4-二氧六環(huán)中表現(xiàn)出強(qiáng)熒光，并且熒光強(qiáng)度與在水中相比提高了約418 倍，測試得到的熒光量子產(chǎn)率為0.34。 探針的這種在低極性溶劑中的高親脂性性質(zhì)和高熒光發(fā)射性質(zhì)為其在LD 成像中的應(yīng)用提供了可能性。

表1 探針在不同溶劑中的光物理性質(zhì)Tab.1 Photophysical properties of probes in different solvents

圖4 在不同極性的有機(jī)溶劑中探針（10 μmol/L）的歸一化后的熒光光譜（a）和不同比例的1，4-二氧六環(huán)（λex=380 nm）與水的混合物中探針的熒光光譜（b）Fig.4 Normalized fluorescence spectra of probes(10 μmol/L) in organic solvents with different polarity(a) and 1, 4-dioxane in different proportions(λex=380 nm)and fluorescence spectrum of probe in mixture with water(b)

2.4 探針BPD-納米顆粒大小

水溶性的BPD-NP DLS 測試， 其粒徑大致為80.28 nm。 TEM 觀察，其形貌為圓型顆粒。 見圖5。

圖5 探針BPD-NP 的DLS 測試圖（A）和TEM 觀察結(jié)果（B）Fig.5 Images of DLS test of probe BPD-NP(A)and TEM observation result(B)

2.5 探針BPD 的pH 依賴性測試

探針于1，4-二氧六環(huán)中在寬的pH 5.0 ～9.0 內(nèi)都是穩(wěn)定的。這表明BPD 在檢測LD 于細(xì)胞中的生物學(xué)應(yīng)用方面具有很大的潛力。 見圖6。

圖6 探針的酸堿度（pH）穩(wěn)定性Fig.6 Diagram of pH stability of probe

2.6 探針BPD 的選擇性測試

熒光探針在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中應(yīng)具有良好的選擇性，因此檢測了各種分析物對BPD 熒光特性的影響。 在380 nm 激發(fā)后，其他物質(zhì)對BPD 在530 nm處的熒光幾乎沒有干擾（圖7）。 表明該探針對這些分析物呈惰性 （分析底物分別為F-、Cl-、Br-、I-、CN-、CO32-、NO2-、PO32-、SCN-、SO32-、ClO-、H2O2、SO42-、Al3+、Ca2+、Co2+、Cr2+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Ni+、Zn2+、ctDNA、Cys、GSH、Hcy、BSA、TC、glucose）。這種結(jié)構(gòu)的探針通常會對F-有特異性的識別，即使在熒光下，BPD 對F-也有任何熒光信號的變化，表現(xiàn)為惰性。

圖7 探針分子對底物的選擇性柱狀圖Fig.7 Histogram of substrate selectivity of probe molecules

2.7 探針BPD 的細(xì)胞毒性結(jié)果及在Hela 細(xì)胞中的成像

探針BPD 對細(xì)胞的毒性測試十分重要， 是判斷探針能否正常發(fā)揮功能的標(biāo)準(zhǔn)之一， 通過MTT 分析探針BPD 在HeLa 細(xì)胞中對細(xì)胞的毒性。與探針（0~30 μmol/L）孵育24 h 后，細(xì)胞的存活率高于90%。 證明探針具有良好的膜滲透性及良好的生物相容性。見圖8。

圖8 用不同濃度的探針處理Hela 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞的存活率柱狀圖Fig. 8 Survival rate histogram of Hela cells treated with different concentrations of probes for 24-hour

由圖9 可以看出， 探針對細(xì)胞進(jìn)行了良好的染色。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，脂滴是于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生的，之后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行生理活動。由圖可知，部分細(xì)胞中LD聚集在了一起上并成功可視化（放大圖），推斷LD 可能正處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。此外，值得注意的是，探針分子在細(xì)胞中呈點(diǎn)狀分布， 并且主要積累在LD 上 （放大圖）。 這表明BPD 有能力追蹤LD 的細(xì)胞內(nèi)積累及可視化活細(xì)胞中的LD 的動態(tài)運(yùn)動。

圖9 在Hela 細(xì)胞中孵育30 min 探針（10 μmol/L）后的圖像（λex ＝488 nm）Fig.9 Images(λex=488 nm)of probe(10 μmol/L)after incubation in Hela cells for 30-minute

3 討論

熒光探針由于易于制備，高選擇性和靈敏度及實(shí)時(shí)成像的潛力而被認(rèn)為是一種出色的檢測技術(shù)[13~15]。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)通常會存在較大的二面角，使其不利于電荷轉(zhuǎn)移，因此大多數(shù)的希夫堿類熒光探針發(fā)光很差甚至沒有熒光發(fā)射，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)通常會存在較大的二面角，使其不利于電荷轉(zhuǎn)移[16]。由于這個(gè)特點(diǎn)，目前存在的大多數(shù)希夫堿類熒光探針的識別機(jī)制是基于與分析物反應(yīng)后發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，導(dǎo)致整體結(jié)構(gòu)更加剛性從而有利于電荷轉(zhuǎn)移，因而其熒光團(tuán)部分發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號，到目前為止，很少存在可視化脂滴的希夫堿類熒光探針。

筆者合成的一種基于芘的希夫堿類熒光探針BPD， 該探針在1，4-二氧六環(huán)中存在強(qiáng)烈的熒光發(fā)射，而在水中熒光很弱，可能是歸因于水分子的進(jìn)攻而淬滅熒光， 這個(gè)特點(diǎn)使其更加適合用于脂滴成像，因?yàn)橹蔚慕Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致其有十分疏水的特性。希夫堿類熒光探針通常是作為反應(yīng)型探針的，其本身發(fā)光性質(zhì)并不好，因此在希夫堿類熒光探針的設(shè)計(jì)中通常加入可以淬滅熒光的識別基團(tuán)或?qū)е缕渚哂写蠖娼堑拇罂臻g位阻基團(tuán)[17，18]。 而筆者合成的基于芘的希夫堿類熒光探針BPD 與大多數(shù)染料的熒光性質(zhì)恰恰相反，探針具有極強(qiáng)的親脂性，可以靶向到LD 中，且具有很高的熒光強(qiáng)度。 通過理論計(jì)算，發(fā)現(xiàn)與其他脂滴成像探針不同， 希夫堿類熒光探針BPD 在疏水的環(huán)境中，結(jié)構(gòu)并不會變得太扭曲，而是保持幾乎在一個(gè)平面上，這也說明了分子內(nèi)仍舊存在電荷轉(zhuǎn)移，且ΔE=3.12 eV。 此外，探針具有十分良好的選擇性、抗干擾能力、良好的膜滲透性及生物相容性，并在寬泛的pH值中依舊存在強(qiáng)熒光信號。此外，探針可以在Hela 細(xì)胞中形成可視化細(xì)胞內(nèi)脂滴。

（利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突）