基于TGF-β/Smads通路分析上調(diào)miR-34b對前列腺癌模型大鼠的影響

田景昌 田兵 宗德斌 李猛 李勇 胡明宇 薛佐興 荊孝東

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院泌尿外科,遼寧 大連 116021)

前列腺癌為男性常見惡性腫瘤,早期無明顯癥狀,易被忽略〔1,2〕,主要臨床表現(xiàn)為夜尿增多、尿頻、尿痛、尿急等。前列腺癌與其他不同部位癌癥有相同的治療原則,要早期發(fā)現(xiàn),早期診斷,早期治療〔3,4〕。臨床治療主要以根治性放射及根治性手術(shù)治療為主。近年來我國前列腺癌發(fā)病率居高不下,如何有效治療仍是臨床研究熱點〔5〕。微小 RNA(miRNA) 在前列腺癌中具備一定的機制作用,miR-34b屬于微小 RNA家族的一員,但現(xiàn)今研究中對于miR-34b在前列腺癌中的相關(guān)機制研究報道較為稀少〔6〕。基于上述背景,本文分析上調(diào)miR-34b對前列腺癌模型大鼠細胞外信號調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路的影響,以明確 miR-34b 是否經(jīng) TGF-α/Smads 信號通路影響并調(diào)控前列腺癌的發(fā)生及發(fā)展,具有一定的創(chuàng)新性。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠〔河北中旭檢驗檢測技術(shù)有限公司,使用許可證號:SYXK(冀)2020-009〕,7～10周齡,平均(8.6±1.2)周齡;體質(zhì)量216～240 g,平均(227.9±9.6)g。于(23.8±3.1)℃環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑:兔抗大鼠白細胞介素(IL)-1抗體(Selleck公司);小鼠抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體(Invitrogen公司);兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3抗體(Hyclone公司);小鼠抗兔總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗體(Gibco公司);大鼠抗小鼠Toll樣受體(TLR)4(BD公司);小鼠抗兔TGF-β/Smads抗體(Sigma公司)。

1.2建模及分組 隨機挑選10只大鼠為正常組,不做任何處理。其余30只建立前列腺癌模型:大鼠禁食12 h后進行麻醉處理,開腹使大鼠前列腺暴露于術(shù)野,使用無菌棉對大鼠前列腺組織進行保護,向兩側(cè)前列腺側(cè)葉注射小鼠前列腺癌細胞(RM-1)懸液10 μl,包膜鼓起且脫離腺體,注射成功,將無菌棉取出后關(guān)腹。大鼠麻醉蘇醒后使用2 mg/kg的絲裂霉素磷酸鹽緩沖液(PBS)腹腔注射,小鼠出現(xiàn)蜷縮、體溫下降等瀕死狀態(tài),經(jīng)眼眶取血后脫頸處死,表示建模成功,建模過程中死亡3只,最終建模成功27只。將27只前列腺癌大鼠隨機分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各9只,上調(diào)組尾部靜脈注射30 mg/kg激活胱天蛋白酶富集域家族成員(agoCARD)9,下調(diào)組尾部靜脈注射30 mg/kg抑制ago-CARD9(antagoCARD9),正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水,均連續(xù)給藥干預(yù)7 d。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色 實驗結(jié)束后,采集靜脈血,離心,取上清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。立即處死大?取大鼠前列腺組織,放于10%甲醛中固定,切片,脫蠟操作,HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察病理組織形態(tài)變化。

1.4雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定VEGF、IL-1、TNF-α、ALP水平 將前列腺組織標(biāo)本加入適量生理鹽水搗碎,3 000 r/min離心10 min取上清液。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,將樣品加入96孔酶標(biāo)板中,每孔50 μl,隨后將其樣品加于至酶標(biāo)板孔的底部位置,在進行加入的過程中對于孔壁盡量不要去觸碰,搖勻,封板,置于37 ℃常溫中進行孵育30 min。洗板3次,除去空白孔,其余的兩孔內(nèi)均分別加入50 μl的酶標(biāo)試劑,37 ℃溫育30 min。洗板3次,在3孔中按照先后順序先加入50 μl的顯色劑A,再加入50 μl的顯色劑B,在37 ℃常溫中進行溫育30 min。每孔加入終止液50 μl,終止反應(yīng),此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。以空白孔凋零,450 nm波長計算VEGF、IL-1、TNF-α、ALP水平。

1.5TC、TG、PSA、MMP-3水平檢測 TC、TG水平采取羅氏c501全自動生化分析儀檢測。采用羅氏公司的cobas e 602 全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定PSA、MMP-3水平。

1.6miR-34b表達檢測 采用實時熒光定量PCR法測定。細胞轉(zhuǎn)染成功,Trizol法提取細胞中總RNA,應(yīng)用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,GAPDH為內(nèi)參,提取細胞總RNArimer5.0軟件設(shè)計引物反應(yīng)條件:16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min,40個循環(huán),2-△△Ct方法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次,取平均值。miR-34b上游引物:5′-TTTTTATTTGTTTTGTTTTGTGTTTGTTTTG-3′,下游:5′-CAACTACAACTCCCAAACA-ATCC-3′;內(nèi)參基因U6:上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATAT-ACTAAAAT-3′,下游:3′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5′。

1.7TGF-B/Smads通路蛋白相對表達量對比 采用Western印跡法對所有培養(yǎng)的細胞進行離心、蛋白提取,然后使用BCA做蛋白定量測定,將50 μg蛋白加入至2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中,轉(zhuǎn)膜、取膜、固定、做電泳1.5 h封閉處理,將1∶1 000比例的TBST稀釋的TGF-B/Smads一抗,在4 ℃的環(huán)境中孵育過夜,TBST反復(fù)3次洗膜,將1∶10 000 TBST稀釋的二抗加入,搖動孵育1 h,TBST反復(fù)3次洗膜,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)做顯色處理,定量分析蛋白表達情況,以GAPDH蛋白為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組前列腺組織病理學(xué)觀察 如圖1所示,正常組前列腺組織細胞結(jié)構(gòu)完好,無充血、水腫等病理變化,無炎性細胞浸潤;模型組前列腺組織細胞排列無規(guī)則,且大量壞死,充血、水腫、炎性細胞浸潤情況較明顯;上調(diào)組前列腺組織細胞水腫、炎性浸潤現(xiàn)象改善,病變緩解;下調(diào)組前列腺組織細胞壞死、充血、水腫、炎性細胞浸潤等病理變化更為嚴重。

圖1 各組前列腺組織(HE染色,×200)

2.2轉(zhuǎn)染效率鑒定 如表1所示,與正常組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組miR-34b表達量降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組miR-34b表達量升高,下調(diào)組miR-34b表達量降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組miR-34b表達量降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),說明miR-10a轉(zhuǎn)染成功。

表1 各組轉(zhuǎn)染效率、骨轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)、VEGF水平及免疫炎癥因子水平對比

2.3各組血清PSA、VEGF、ALP水平對比 如表1所示,與正常組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組ALP水平降低,PSA、VEGF水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組PSA、VEGF水平下降,ALP水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組ALP水平降低,PSA、VEGF水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組免疫炎癥因子水平比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組IL-1、TNF-α、MMP-3水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組、下調(diào)組IL-1、TNF-α、MMP-3水平降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組IL-1、TNF-α、MMP-3水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.5各組血脂水平對比 如表2所示,與正常組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組TC、TG水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組、下調(diào)組TC、TG水平降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組TC、TG水平升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組血脂水平對比

2.6各組TGF-B/Smads通路蛋白表達對比 如表3、圖2所示,與正常組相比,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組TGF-β、Smads表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,上調(diào)組、下調(diào)組TGF-β、Smads表達上升,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與上調(diào)組相比,下調(diào)組TGF-β、Smads表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組TGF-β/Smads通路蛋白表達對比

圖2 4組TGF-B/Smads通路蛋白表達

3 討 論

前列腺癌的發(fā)病病因目前尚未明確,晚期預(yù)后不佳〔7〕。研究顯示,抑制癌細胞增殖,促進癌細胞凋亡是治療前列腺癌研究熱點〔8〕。隨著臨床對miRNA的進一步研究顯示,miRNA在轉(zhuǎn)錄水平上具有抑制該靶基因mRNA的翻譯或降解目標(biāo)mRNA來調(diào)控蛋白質(zhì)表達的作用〔9〕。miRNA是一種非編碼RNA,廣泛存在于多種生物中,在動物種系中具有保守序列,在血清、血漿中存在較穩(wěn)定,因此miRNA可應(yīng)用于診斷腫瘤的潛在血清標(biāo)志物〔10〕。mRNA可結(jié)合靶序列對基因表達產(chǎn)生調(diào)節(jié),miRNA在腫瘤的發(fā)生中類似于致癌基因和抑癌基因〔11,12〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-34的異常低表達可使miR-34b下游靶基因水平降低,導(dǎo)致腫瘤增殖,表明調(diào)控miR-34可有效抑制癌細胞生長、分化〔13〕。研究發(fā)現(xiàn),miR-34在多種腫瘤(乳腺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等)中表達均呈異常低表達,分析原因可能與基因啟動子區(qū)甲基化改變相關(guān)〔14,15〕。本研究顯示,miR-34b在前列腺癌組織中呈低表達水平,可能與DNA損傷的修復(fù)情況有關(guān)。報道顯示,miR-34b參與列腺癌局部炎癥反應(yīng),當(dāng)炎癥誘發(fā)列腺損傷后可經(jīng)基因調(diào)控作用和介導(dǎo)促進炎癥細胞因子表達參與炎癥損傷,表現(xiàn)為表達異常升高〔16〕。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-34b可有效抑制局部炎癥反應(yīng),證實miR-34b對前列腺損傷具有良好保護作用。

研究顯示前列腺癌大鼠TGF-β/Smads蛋白表達降低〔17〕。TGF-β作為功能細胞因子,在干細胞分化及T細胞調(diào)節(jié)和分化中發(fā)揮至關(guān)重要作用。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β作為一種有效的腫瘤抑制因子,對惡性腫瘤細胞的增殖、促進、凋亡具有良好的抑制作用,在眾多生物學(xué)過程中具有重要作用〔18〕。分析其原因可能是其通過細胞突變來影響TGF-β信號通路,將細胞轉(zhuǎn)化為惡性狀態(tài),產(chǎn)生基質(zhì)修飾劑進而促進腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移〔19〕。TGF-β/Smad的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過由膜結(jié)合的Ⅰ、Ⅱ型受體和Smad蛋白形成低聚體復(fù)合物參與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的。而Smads家族蛋白在TGF-β信號傳導(dǎo)過程中起到關(guān)鍵性作用,且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)〔20,21〕。TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物,通過激活Smads進入核內(nèi),共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果提示,上調(diào)miR-34b可能通過抑制TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達進而降低細胞增殖能力。

綜上所述,上調(diào)miR-34b可有效抑制局部炎癥反應(yīng)蔓延,延緩前列腺癌骨轉(zhuǎn)移進展,改善PSA、VEGF、MMP-9及血脂的水平,分析其機制可能是TGF-β/Smads通路蛋白表達受到調(diào)控。因此miR-34b可作為前列腺癌新的治療靶點,可進一步進行深入研究。