利拉魯肽對高糖介導(dǎo)人牙周膜成纖維細(xì)胞的影響

趙東強(qiáng) 林仰東

(1天津市泰達(dá)醫(yī)院口腔科,天津 300457;2天津市第一中心醫(yī)院口腔科)

慢性牙周炎(CP)是一種普遍存在的慢性炎癥性疾病,主要涉及牙齒周圍支撐組織的炎癥,如牙周和血管骨的破壞、牙齒松動,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致牙齒的脫落〔1,2〕,影響了全球大概11%的人口〔3〕。糖尿病已被明確確認(rèn)為牙周炎的主要危險(xiǎn)因素〔4～6〕,與非糖尿病患者相比,糖尿病患者患牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)大約增加三倍〔7〕。因此,血糖水平的控制對于牙周炎的發(fā)生至關(guān)重要。炎癥反應(yīng)是糖尿病和牙周炎的共同特征,Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病都受炎癥因子水平增加的影響〔8〕。炎癥水平的升高會導(dǎo)致糖尿病患者產(chǎn)生眾多血管并發(fā)癥,血糖水平的升高可導(dǎo)致炎癥因子釋放進(jìn)一步增加、氧化應(yīng)激加劇及造成細(xì)胞凋亡〔9〕。作為牙周組織的一部分,牙周韌帶(PDL)是一種將牙齒與牙槽骨連接起來的專用組織纖維。PDL主要由成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞組成〔10〕。人類牙周韌帶成纖維細(xì)胞(hPDLFs)是主要的成纖維細(xì)胞類型,可識別病原體,分泌炎癥介質(zhì),如白細(xì)胞介質(zhì)(IL)-8和IL-6,與牙周炎的發(fā)展密切相關(guān)〔11～13〕。因此,維持hPDLFs的免疫平衡被認(rèn)為有利于牙周疾病的控制。

利拉魯肽(Lira)是一種乙酰化胰高血糖素狀肽-1類似物,與原生胰高血糖素樣肽-1具有97% 氨基酸同源性,并且作用持久,臨床上被廣泛用于治療2型糖尿病〔14〕。研究顯示,Lira具有多重生物學(xué)效應(yīng),對牙周炎具有改善作用,可減輕其炎癥反應(yīng)〔15〕,在牙體牙周疾病治療中的具有潛在應(yīng)用價(jià)值,但是關(guān)于Lira對高糖誘導(dǎo)的hPDLFs損傷的保護(hù)作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本文擬研究Lira對高糖介導(dǎo)hPDLFs損傷的影響及機(jī)制,探討Lira在CP治療領(lǐng)域里的應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1試劑和儀器 hPDLFs購自上海中喬新舟生物科技有限公司,大腸桿菌內(nèi)毒素/脂多糖類(E.coli LPS,Sigma,美國)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-3、MMP-9、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(Santa Cruz),Trizol試劑盒(Invitrogen,美國),IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(eBioscience)、CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒(碧云天)、Hoechst染色試劑盒(索萊寶)、Western印跡試劑盒(碧云天),相關(guān)引物合成(生工生物),DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國),CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher,美國),酶標(biāo)儀(Bio-Rad公,美國)、Fluo-3/AM鈣離子熒光探針(Invitrogen,Insight-PlusIQ型激光共聚焦顯微鏡(Meridian,美國),熒光相差顯微鏡(北京榮興光恒科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1人牙周膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng) hPDLFs培養(yǎng)在10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。于熒光相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況,取對數(shù)生長期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2分組 hPDLFs調(diào)整密度為5×108個(gè)/L。對照組培養(yǎng)條件為:含11 mmol/L葡萄糖(GLU)常規(guī)培養(yǎng)基;甘露醇組:含19.5 mmol/L甘露醇培養(yǎng)基;高糖組:含40 mmol/L GLU培養(yǎng)基中培養(yǎng);Lira 組:含40 mmol/L GLU和100 nmol/ml Lira的培養(yǎng)基。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測 使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖,以1×104個(gè)細(xì)胞/孔在96孔板中種植細(xì)胞。24 h后,向其中加10 μl CCK-8試劑,96孔板在37 ℃孵育2 h,酶標(biāo)儀上測定OD 450 nm值,細(xì)胞增殖率=(OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測定 將hPDLFs細(xì)胞懸浮并與5 μmol/L Fluo-3/AM分子探針在 37 ℃下孵育45 min。使用Insight-PlusIQ型激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中Fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度。

1.2.5Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡率 未經(jīng)處理和處理的細(xì)胞在磷酸鹽緩沖液中洗兩次,并固定在含有4%甲醛的磷酸鹽緩沖液中,之后用水沖洗,滴加上Hoechst染色液(最終濃度,10 μg/ml)10 min。在染色后,用熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞核的形態(tài)。

1.2.6含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Casp-ase)3、6、9活性的檢測 采用熒光比色法測定hPDLFs中Caspase 3、6、9的活性。收集不同處理組hPDLFs,加入提前遇冷的裂解液(50 μl/1×106細(xì)胞),混勻后,置于冰上10 min;以2 991 r/min離心10 min,吸取上清液,測定蛋白濃度,加入50 μl特異性的熒光報(bào)告底物,分別檢測hPDLFs中Caspase3、6、9的活性。通過熒光分光光度計(jì)定量檢測各組hPDLFs中的Caspase3、6、9的活性變化情況。

1.2.7ELISA測定細(xì)胞上清液MMP-2、MMP-3和MMP-9的含量 采用ELISA按說明書測定4個(gè)實(shí)驗(yàn)組hPDLFs細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-3和MMP-9的含量,經(jīng)離心后,收集各組細(xì)胞上清液,按相應(yīng)的試劑盒說明書檢測相關(guān)因子含量,于PR-521酶標(biāo)儀讀取各細(xì)胞OD值,按照試劑盒指示計(jì)算MMP-2、MMP-3和MMP-9的含量。

1.2.8Wnt3a連環(huán)蛋白β(CTNNB)1、Bcl關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、重組人B細(xì)胞淋巴瘤因子2XL(Bcl-xl)mRNA的表達(dá)測定 收集細(xì)胞,加入Trizol試劑提取總RNA。行逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件為:25 ℃ 10 min,48 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min。利用合成的cDNA為底物依據(jù)qRT-PCR說明書行檢測相應(yīng)指標(biāo)mRNA的含量,qRT-PCR條件為:95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,59 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,利用2-ΔΔCt法計(jì)算進(jìn)行結(jié)果分析。所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.9Wnt3a、CTNNB1、Bax、Bcl-xl蛋白表達(dá)水平檢測 處理結(jié)束后收集細(xì)胞,使用RIPA裂解提取總蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度由BCA試劑測定,調(diào)整為4 μg/μl,由12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。然后,5%的脫脂奶粉孵育2 h,然后加入相應(yīng)的一抗抗體(1∶1 000)在4 ℃的孵育過夜。次日,殘留的一抗抗體通過對苯二甲酸丁二醇酯(PBST)清洗去除,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二次抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h,然后用PBST沖洗3次,每次5 min,多余的液體用過濾紙吸收。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯色,采用ImageJ軟件掃描蛋白質(zhì)條帶并分析灰度值。蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白帶/GAPDH蛋白條帶的灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1hPDLFs培養(yǎng)鑒定 當(dāng)hPDLFs細(xì)胞接種1 d后,鏡下觀察,可見大部分細(xì)胞貼壁,細(xì)胞呈長梭形或多角形,胞質(zhì)均勻,胞體豐滿,細(xì)胞兩端的突起明顯可見。取傳代后處于對數(shù)生長期的hPDLFs細(xì)胞,于相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞呈柵欄狀或放射狀。于免疫熒光顯微鏡觀察,綠色熒光指示細(xì)胞波形絲蛋白,為中胚層來源的成纖維細(xì)胞(圖1)。

圖1 hPDLFs相差顯微鏡觀察及免疫熒光染色(×200)

2.2細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度 與對照組和甘露醇組比較,高糖組hPDLFs細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著增加,細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較,Lira組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著降低,細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 細(xì)胞增殖率及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、細(xì)胞中及細(xì)胞上清液Caspase3、Caspase6、Caspase9含量

2.3Caspase3、Caspase6、Caspase9含量測定 與對照組和甘露醇組相比較,高糖組hPDLFs細(xì)胞中及細(xì)胞上清中MMP-2、MMP-3、MMP-9的含量均顯著升高(均P<0.05)。與高糖組比較,Lira組hPDLFs細(xì)胞中及細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-3、MMP-9的含量均顯著降低(均P<0.05)。見表2。

2.4Hoechst染色凋亡率檢測結(jié)果 與對照組〔(6.45±1.19)%〕和甘露醇組〔(8.23±1.13)%〕相比較,高糖組細(xì)胞凋亡率〔(41.62±1.97)%〕顯著增加(均P<0.05);與高糖組相比較,Lira組細(xì)胞凋亡率〔(22.70±2.73)%〕明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 hPDLFs細(xì)胞凋亡率檢測(Hoechst染色,×200)

2.5各組Wnt3a、CTNNB1、Bax、Bcl-xl mRNA及蛋白表達(dá)水平 與對照組和甘露醇組相比,高糖組hPDLFs細(xì)胞Wnt3a、CTNNB1、Bax mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05),Bcl-xl mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與高糖組比較,Lira組hPDLFs細(xì)胞Wnt3a、CTNNB1、Bax mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05),Bcl-xl mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Wnt3a、CTNNB1、Bax、Bcl-xl 蛋白表達(dá)

表3 各組Wnt3a、CTNNB1、Bax、Bcl-xl mRNA及蛋白表達(dá)水平

3 討 論

牙周炎被認(rèn)為是人類最常見的疾病之一,目前在全世界范圍內(nèi)呈明顯增長趨勢,全世界總體患病率為11.2%〔16〕。我國牙周炎患病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于世界平均水平,根據(jù)最近發(fā)布的《中國第四次流行病學(xué)抽樣調(diào)查》,在35～44歲年齡段人群中,牙周炎患病率約為90.9%。牙周炎是世界牙齒流失的主要原因,并給社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),牙周炎的治療仍然是一個(gè)長期且艱巨的任務(wù)〔17〕。

Wnt信號通路被認(rèn)為是人體內(nèi)重要的信號通路,它調(diào)節(jié)生物體生長、發(fā)育,并控制細(xì)胞命運(yùn),如增殖、分化、凋亡和癌變。自21世紀(jì)初人類遺傳學(xué)研究報(bào)告了Wnt信號通路成員與骨質(zhì)疏松之間聯(lián)系以來,Wnt信號通路在骨骼發(fā)育相關(guān)疾病中被廣泛關(guān)注〔18〕,人們普遍認(rèn)為,Wnt信號與牙周炎的發(fā)展有關(guān)。研究表明,Wnt3a在骨細(xì)胞的分化中具有重要的調(diào)節(jié)作用。在骨細(xì)胞分化早期可以誘導(dǎo)堿性磷酸酶的活性,促進(jìn)骨細(xì)胞的分化〔19〕。在骨細(xì)胞分化后期階段,Wnt3a可以調(diào)節(jié)骨原蛋白和骨蛋白(OPG),從而調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的分化〔20〕。本研究結(jié)果說明高糖誘導(dǎo)hPDLFs細(xì)胞損傷模型制備成功;在牙周炎中存在Wnt信號通路的激活;牙周炎發(fā)作過程,利拉魯肽在一定程度上通過Wnt/CTNNB1信號通路發(fā)揮作用。MMPs是胞外蛋白酶家族,負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和降解〔21〕。研究顯示,MMPs是與牙周疾病相關(guān)的組織破壞過程中最重要的途徑〔22〕。先前的研究表明,在牙周炎患者的牙周組織中檢測到MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9水平顯著升高〔23〕。本研究中,高糖處理hPDLFs細(xì)胞損傷后,細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-3、MMP-9表達(dá)升高,與上述研究結(jié)果相一致。

綜上,利拉魯肽處理后可顯著抑制高糖引起的hPDLFs細(xì)胞損傷后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)因子釋放,改善hPDLFs細(xì)胞損傷。利拉魯肽可降低細(xì)胞上清液中MMP-2、MMP-3和MMP-9含量及抑制Wnt信號通路成員Wnt3a和CTNNB1表達(dá)。本研究結(jié)果可為臨床上牙周炎的治療提供借鑒,并為利拉魯肽在牙周炎治療中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。