下調(diào)lncRNA DSCAM-AS1表達(dá)通過負(fù)調(diào)控miR-338-3p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的機制

袁泉良 郭躍 張慶東

(南陽市中心醫(yī)院肛腸科,河南 南陽 473009)

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤,發(fā)病率和病死率均居全球前三,易轉(zhuǎn)移,臨床治療仍以放化療為主,靶向治療逐漸成為新的治療方式〔1〕。對其分子機制的研究不僅有助于預(yù)測腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險、判斷預(yù)后,還利于精準(zhǔn)化治療。長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于一種基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)RNA,與調(diào)節(jié)表觀遺傳轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平關(guān)系密切,長度超過200 nt但不能編碼蛋白質(zhì),何祖坤等〔2〕發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有調(diào)控作用,在結(jié)直腸癌中表達(dá)異常,可作為預(yù)后和診斷的新型潛在生物標(biāo)志物及治療靶點。DSCAM-AS1是一種乳腺癌異性和雌激素受體α依賴性長非編碼RNA,其沉默會導(dǎo)致乳腺癌遷移和侵襲性降低〔3〕,但其對結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響尚未清楚。miRNAs也是一類保守非編碼RNA,與結(jié)直腸癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),可通過不同的信號途徑調(diào)控其靶基因進(jìn)而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展〔4〕。 研究發(fā)現(xiàn)miR-338-3p通過下調(diào)新型轉(zhuǎn)化生長因子-β1型受體激酶(ALK)5抑制腎細(xì)胞癌的侵襲〔5〕;miR-338-3p抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移〔6〕。miR-338-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中低表達(dá),過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移〔7〕,還能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔8〕。但DSCAM-AS1是否通過調(diào)控miR-338-3p影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展尚不清楚,本文旨在研究lncRNA DSCAM-AS1對結(jié)直腸癌增殖、遷移和侵襲的影響及其是否與miR-338-3p有關(guān),為診斷治療結(jié)直腸癌提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW1116、HT29、SW480和正常結(jié)直黏膜上皮細(xì)胞NCM460;RIPA蛋白裂解液和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);基質(zhì)膠、Transwell小室(美國BD公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京Solarbio公司);噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(Sigma公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司);Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司);胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibico公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、SW1116、HT29和正常結(jié)直黏膜上皮細(xì)胞NCM460采用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)條件為飽和濕度、5% CO2、37 ℃,換液1次/d,將胰蛋白酶加入培養(yǎng)基消化傳代,加入時機為80%左右的細(xì)胞融和度,選取實驗細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為處于對數(shù)生長期。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。0.25%胰蛋白酶消化常規(guī)培養(yǎng)的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480后接種于96孔板中,更換為無血清培養(yǎng)基,更換時機為80%左右的細(xì)胞融和度,同步化12 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-338-3p組(轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimics)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-DSCAM-AS1組(轉(zhuǎn)染si-DSCAM-AS1)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-DSCAM-AS1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-DSCAM-AS1)、si-DSCAM1-AS1+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-DSCAM-AS1和anti-miR-NC)、si-DSCAM-AS1+anti-miR-338-3p組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-338-3p和si-DSCAM-AS1)。

1.4qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測DSCAM-AS1 mRNA和miR-338-3p表達(dá)水平 在Trizol試劑中加入研磨充分的各組細(xì)胞并提取總RNA,RNA濃度和純度采用微量核酸測定儀檢測。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa試劑盒,PCR擴(kuò)增以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,反應(yīng)體系配制按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明,共循環(huán)40次,3次重復(fù)/樣品,循環(huán)條件為95 ℃、72 ℃均30 s,60 ℃ 35 s。相對表達(dá)量計算采用2-ΔΔCt法。

1.5Western印跡檢測蛋白表達(dá) BCA試劑盒測定蛋白濃度,各組細(xì)胞加入RIPA裂解液,4 ℃離心15 min,12 377 r/min。蛋白樣品SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜;室溫加入二抗(1∶2 000)孵育2 h,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌3次,10 min/次,膠片Quantity One凝膠分析軟件處理,設(shè)3個重復(fù)于每個蛋白樣品。蛋白表達(dá)水平即GAPDH條帶和測定的各組蛋白條帶的吸光度的比值。

1.6MTT檢測細(xì)胞增殖 5 g/L的MTT溶液20 μl分別加入培養(yǎng)至24、48、72 h的各組細(xì)胞,孵育4 h將多余培養(yǎng)基棄去后加入DMSO 150 μl振蕩反應(yīng)10 min,酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞活性即兩組OD比值。

1.7Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 濃度2×104個/ml,重懸胰酶消化后的各組細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基。細(xì)胞遷移實驗:Transwell小室上室中接種細(xì)胞懸液200 μl,5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)于含完全培養(yǎng)基的下室中24 h,去除培養(yǎng)基,取出小室,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,棉簽擦去上層細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,4%多聚甲醛加入后固定30 min,顯微鏡視野隨機拍照5個,結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗:Transwell小室的上室鋪上RPMI1640培養(yǎng)液1∶5比例加入并稀釋的基質(zhì)膠,操作同細(xì)胞遷移實驗。結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.8DSCAM-AS1對miR-338-3p的靶向調(diào)控檢測 構(gòu)建3′編碼區(qū)(UTR)-熒光素酶表達(dá)載體,突變型和野生型基因靶點DSCAM-AS1(MUT-DSCAM-AS1和WT-DSCAM-AS1),5×104個/孔的24孔板接種對數(shù)生長期結(jié)腸癌細(xì)胞,MUT-DSCAM-AS1和WT-DSCAM-AS1組細(xì)胞采用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-338-3p和miR-NC,轉(zhuǎn)染時機為80%左右的細(xì)胞融和度。雙熒光素酶報告實驗測定使用熒光素酶報告基因檢測儀,依據(jù)說明書要求。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同細(xì)胞中miR-338-3p和DSCAM-AS1 mRNA表達(dá) 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HT29、SW1116中DSCAM-AS1 mRNA表達(dá)水平與正常結(jié)直黏膜上皮細(xì)胞NCM460相比顯著升高,miR-338-3p表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。選擇表達(dá)變化最明顯的SW480細(xì)胞做后續(xù)試驗。見表1。

表1 DSCAM-AS1 mRNA和miR-338-3p在不同細(xì)胞中的表達(dá)

2.2下調(diào)DSCAM-AS1 mRNA表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示,與si-NC組比較,si-DSCAM-AS1組SW480細(xì)胞中DSCAM-AS1 mRNA及CyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯降低,p27、p21蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。MTT法結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組24、48、72 h SW480細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。可見,下調(diào)DSCAM-AS1表達(dá)抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖。

圖1 Western印跡檢測兩組增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 下調(diào)DSCAM-AS1 mRNA表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響

2.3DSCAM-AS1表達(dá)下調(diào)影響結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲、遷移 Western印跡檢測結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組SW480細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組SW480細(xì)胞中遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3、圖3。

圖2 Western印跡檢測兩組遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 DSCAM-AS1表達(dá)下調(diào)影響結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色,×400)

表3 各組結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞遷移、侵襲及相關(guān)蛋白比較

2.4miR-338-3p過表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲、遷移及增殖的影響 與miR-NC組相比,miR-338-3p組SW480細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)量和48、72 h細(xì)胞活性及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低,miR-338-3p、p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。見圖4、表4?？梢?結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲、遷移和增殖受miR-338-3p過表達(dá)抑制。

1～6:miR-NC組、miR-338-3p組、si-NC組、si-DSCAM-AS1組、si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組、si-DSCAM-AS1+anti-miR-338-3p組圖4 Western印跡檢測各組相關(guān)侵襲、遷移增殖蛋白表達(dá)

表4 結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲、遷移增殖受miR-338-3p過表達(dá)的影響

2.5lncRNA DSCAM-AS1靶向調(diào)控miR-338-3p表達(dá) miR-338-3p與DSCAM-AS1存在結(jié)合位點通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測,見圖5。突變型DSCAM-AS1基因表達(dá)載體MUT-DSCAM-AS1被轉(zhuǎn)染后,相較于miR-NC組,miR-338-3p組MUT-DSCAM-AS1結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。野生型DSCAM-AS1基因表達(dá)載體WT-DSCAM-AS1轉(zhuǎn)染后,相較于miR-NC組,miR-338-3p組WT-DSCAM-AS1結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見表5。相較于pcDNA組miR-338-3p表達(dá)水平(1.02±0.09),pcDNA-DSCAM-AS1組結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)水平(0.41±0.04)顯著降低(P<0.05)。相較于si-NC組miR-338-3p表達(dá)水平(1.00±0.08),si-DSCAM-AS1組結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)水平(2.91±0.29)顯著升高(P<0.05)?？梢?DSCAM-AS1可靶向調(diào)控miR-338-3p表達(dá)。

圖5 DSCAM-AS1的序列中含有與miR-338-3p互補的核苷酸序列

表5 兩組雙熒光素酶結(jié)果比較

2.6抑制miR-338-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)下調(diào)DSCAM-AS1表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖遷移侵襲的影響 與si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組相比,si-DSCAM-AS1+anti-miR-338-3p組SW480細(xì)胞中miR-338-3p、p21蛋白表達(dá)水平顯著降低,MMP-9、MMP-2、CyclinD1蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量及24、48、72 h細(xì)胞活性顯著升高(均P<0.05)。與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組SW480細(xì)胞中miR-338-3p p21蛋白表達(dá)水平顯著升高,CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量及48、72 h細(xì)胞活性顯著降低(均P<0.05)。見圖4、表6。下調(diào)DSCAM-AS1表達(dá)對SW480細(xì)胞侵襲、遷移、增殖抑制作用逆轉(zhuǎn)的是抑制miR-338-3p表達(dá)。

表6 抑制miR-338-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)下調(diào)DSCAM-AS1表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討 論

結(jié)直腸癌具有很高的發(fā)病率及死亡率,嚴(yán)重威脅人類健康〔9〕。越來越多的研究表明lncRNAs在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)DSCAM-AS1參與乳腺癌的生物學(xué)進(jìn)程和耐藥性〔11〕;DSCAM-AS1在乳腺癌中上調(diào)表達(dá),通過靶向miR-137增強乳腺癌中的他莫昔芬抗性〔12〕。DSCAM-AS1在吸煙者的肺腺癌組織中表達(dá)增高,且在香煙提取物處理肺腺癌A549細(xì)胞系中表達(dá)水平也升高,提示DSCAM-AS1或與吸煙和肺腺癌相關(guān)〔13〕。豐雪等〔14〕運用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DSCAM-AS1通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞新陳代謝、能量相關(guān)通路等與肺腺癌的發(fā)病有關(guān),可作為肺腺癌潛在的治療靶點。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),DSCAM-AS1可靶向調(diào)控miR-338-3p。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)異常,可靶向結(jié)合mRNA,通過沉默癌細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)參與腫瘤進(jìn)展〔15〕。此外,miRNA還能調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移〔16〕。miR-338-3p在肝癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá),通過下調(diào)FOXP4抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖〔17〕;miR-338-3p通過靶向鞘氨醇激酶(SphK)2抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡〔18〕。

miR-338-3p在結(jié)直腸癌中低表達(dá),miR-338-3p通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MACCI表達(dá),從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生〔19〕。miR-338-3p還可通過抑制精胺氧化酶(SMO)蛋白的表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移〔7〕。miR-338-3p抑制劑能克服p53突變的結(jié)腸癌細(xì)胞中5-氟尿嘧啶抗性〔20〕。本實驗表明,miR-338-3p被DSCAM-AS1靶向調(diào)控,抑制miR-338-3p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)下調(diào)DSCAM-AS1對SW480細(xì)胞侵襲、遷移和增殖的抑制作用。

綜上,對結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖有抑制作用的機制可能與靶向調(diào)控miR-338-3p有關(guān),結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷、治療及診斷方面lncRNA DSCAM-AS1可提供新靶點。