右美托咪定介導(dǎo)GDNF表達(dá)對(duì)腦損傷大鼠神經(jīng)元突觸損傷及肺功能保護(hù)機(jī)制

段彩萍 白江華 郝彬潔 韓云志 都義日

(鄂爾多斯市中心醫(yī)院,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的發(fā)病率、死亡率均較高,該病患者常出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀,嚴(yán)重者會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)障礙〔1〕。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)由M2型小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)分泌,可促進(jìn)神經(jīng)元再生,具有神經(jīng)保護(hù)作用〔2〕。研究表明,GDNF在帕金森病〔3〕、神經(jīng)病理性疼痛〔4〕等多種神經(jīng)性疾病中均具有重要作用。在腦缺血再灌注中,通過促進(jìn)GDNF的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕。在腦損傷中,肺損傷是其常見的并發(fā)癥。目前認(rèn)為〔6〕,腦損傷繼發(fā)肺損傷與肺內(nèi)過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺血管及上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)的破壞性較大,是引起肺損傷的重要介質(zhì)之一。目前對(duì)于治療TBI的神經(jīng)保護(hù)類藥物較少,尋找促進(jìn)神經(jīng)元存活的藥物對(duì)治療TBI至關(guān)重要。右美托咪定(Dex)除具有抗炎作用外,還可改善神經(jīng)元損傷。多項(xiàng)研究證實(shí),其在腦出血〔7〕、腦卒中〔8〕等腦神經(jīng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用,另外,Dex還可減少由炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。但Dex對(duì)腦損傷神經(jīng)功能等的具體作用機(jī)制尚未完全掌握,因此,本研究Dex介導(dǎo)GDNF表達(dá)對(duì)腦損傷大鼠神經(jīng)元突觸損傷及肺功能保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只雄性SPF級(jí)SD大鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司〔許可證號(hào):SCXK(蘇)2021-0102〕,鼠齡6～8 w,體質(zhì)量200～300 g,適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào):20190327)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 TUNEL工作液(武漢普健生物科技有限公司,貨號(hào):ATK00001),NE、白細(xì)胞介素(IL)-8試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司,貨號(hào)分別為SND-R812、CHM-009),蘇木素-伊紅(HE)染色液(金華力升實(shí)驗(yàn)器材有限公司,貨號(hào):002),突觸蛋白(SYN)1、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)一抗(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司,貨號(hào):hz883Ra21),辣根過氧化物酶二抗(北京博爾西科技有限公司,貨號(hào):BHR112)。

1.3模型建立及干預(yù) 75只大鼠中隨機(jī)抽取15只作為健康組進(jìn)行對(duì)照,剩余大鼠根據(jù)文獻(xiàn)〔9〕建立TBI模型:運(yùn)用撞針撞擊左側(cè)腦皮層頂葉(3.5 mm/s,深2 mm),留針0.4 s,止血,封閉顱骨,縫合皮膚。以神經(jīng)功能缺損評(píng)分為1～3分為建模成功。將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、Dex組、GDNF組及聯(lián)合組,各組15只。健康組與模型組常規(guī)飼養(yǎng),無任何處理;Dex 組于腹腔注射Dex 100 μg/kg;GDNF組于髓鞘注射2 μg GDNF ,1次/2 d,共2 w;聯(lián)合組在Dex組治療的基礎(chǔ)上給予GDNF組治療。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1檢測(cè)Dex對(duì)各組神經(jīng)功能缺損的影響 各組干預(yù)24 h、48 h、72 h后根據(jù)文獻(xiàn)〔10〕檢測(cè)神經(jīng)功能缺損(mNSS) 狀況,主要由運(yùn)動(dòng)、感覺、反射測(cè)試構(gòu)成,共18分,分值越高神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4.2Morris 水迷宮試驗(yàn)評(píng)估Dex對(duì)各組認(rèn)知功能的影響 空間學(xué)習(xí)能力:干預(yù)完畢后4次/d進(jìn)行定位航行,將大鼠隨機(jī)放入水迷宮中,在大鼠找到平臺(tái)或航行120 s未找到平臺(tái)時(shí)結(jié)束,計(jì)算到達(dá)平臺(tái)的平均航行時(shí)間(逃避潛伏期),時(shí)間越長(zhǎng)認(rèn)知越差?？臻g探索:將水迷宮中平臺(tái)去除,水池中隨機(jī)位置放入大鼠,航行1 min,記錄穿越平臺(tái)次數(shù),共2次,取均值。

1.4.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)Dex對(duì)各組肺損傷相關(guān)因子NE、白細(xì)胞介素(IL)-8水平表達(dá)的影響 支氣管肺泡灌洗液中NE、IL-8含量測(cè)定參照文獻(xiàn)〔11〕進(jìn)行,從各組大鼠體內(nèi)取支氣管肺泡灌洗液5～6 ml,采用ELISA檢測(cè)NE、IL-8水平,實(shí)驗(yàn)按照說明書進(jìn)行。

1.4.4HE染色觀察Dex對(duì)各組肺組織及腦組織病理形態(tài)的影響 取各組麻醉后處死,去除腦、肺組織,甲醛固定,自來水沖洗,脫蠟、包埋、切片。將各組肺、腦組織切片放入37 ℃復(fù)溫15 min,脫蠟、脫水后蘇木素染色10 min,鹽酸(1%)處理,伊紅復(fù)染,脫水,封片,觀察組織形態(tài)。

1.4.5TUNEL檢測(cè)Dex對(duì)各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情的影響 取各組腦組織,石蠟切片脫蠟,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,加入TUNEL檢測(cè)液45 μl孵育1 h,PBS清洗,每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野,計(jì)算凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞總數(shù)/(凋亡細(xì)胞總數(shù)+正常細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.6免疫印跡檢測(cè)Dex對(duì)各組SYN1、BDNF蛋白表達(dá)的影響 取各組腦組織,剪碎、裂解,離心后取上清,二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)于PVDF膜上,脫脂奶粉封閉2 h后分別加入脫脂牛奶配制SYN1、BDNF一抗(1∶1 000)孵育過夜,加入辣根過氧化物酶二抗(1∶2 000)孵育1 h,PBS清洗,用化學(xué)發(fā)光液孵育 3 min 后曝光。應(yīng)用 Image Pro Plus6.0(Media Cybernetics)軟件分析結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn),多組內(nèi)兩兩對(duì)比采用SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1Dex對(duì)各組神經(jīng)功能缺損的影響 模型組不同時(shí)間mNSS評(píng)分明顯高于Dex組、GDNF組、聯(lián)合組(P<0.05),Dex組與GDNF組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),聯(lián)合組不同時(shí)間mNSS評(píng)分明顯低于Dex組、GDNF組(P<0.05),見表1。

表1 各組mNSS評(píng)分對(duì)比分)

2.2Dex對(duì)各組認(rèn)知功能的影響 與健康組相比,模型組逃避潛伏期明顯增加,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05);與模型組相比,Dex組、GDNF組、聯(lián)合組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05),Dex組、GDNF組各指標(biāo)對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與Dex組、GDNF組相比,聯(lián)合組逃避潛伏期明顯縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05),見表2。

表2 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)指標(biāo)水平對(duì)比

2.3Dex對(duì)各組肺損傷相關(guān)因子NE、IL-8水平表達(dá)的影響 健康組NE、IL-8水平明顯低于模型組(P<0.05),模型組NE、IL-8水平明顯高于Dex組、GDNF組、聯(lián)合組(P<0.05),Dex組、GDNF組各指標(biāo)水平對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),Dex組、GDNF組NE、IL-8水平明顯高于聯(lián)合組(P<0.05),見表3。

表3 各組肺損傷相關(guān)因子NE、IL-8水平對(duì)比

2.4Dex對(duì)各組肺組織及腦組織病理形態(tài)的影響 肺組織:健康組肺組織正常;模型組可見肺泡腔及細(xì)支氣管內(nèi)中性粒細(xì)胞和纖維蛋白滲出,肺泡隔增寬,肺泡萎陷,肺泡壁破裂,肺泡腔融合;與模型組肺組織相比,Dex組、GDNF組及聯(lián)合組肺組織均有所改善,且以聯(lián)合組效果最為顯著。腦組織:健康組腦組織正常;模型組腦組織發(fā)生水腫,神經(jīng)元細(xì)胞核固縮;與模型組肺組織相比,Dex組、GDNF組及聯(lián)合組腦組織均有所改善,且以聯(lián)合組效果最為顯著,見圖1。

圖1 各組肺組織及腦組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.5Dex對(duì)各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 健康組腦組織細(xì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率〔(6.56±1.25)%〕明顯低于模型組〔(63.28±12.05)%,P<0.05〕,模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于Dex組、GDNF組及聯(lián)合組〔(39.52±8.29)%、(39.56±8.32)%、(20.11±3.59)%,P<0.05〕,Dex組、GDNF組細(xì)胞凋亡率對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率明顯低于Dex組、GDNF組(P<0.05),見圖2。

圖2 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)比(TUNEL染色,×200)

2.6Dex對(duì)各組SYN1、BDNF蛋白表達(dá)的影響 健康組SYN1、BDNF表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05),模型組SYN1、BDNF表達(dá)明顯低于Dex組、GDNF組及聯(lián)合組(均P<0.05),Dex組、GDNF組各指標(biāo)對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),聯(lián)合組SYN1、BDNF表達(dá)明顯高于Dex組、GDNF組(P<0.05),見圖3、表4。

圖3 Dex對(duì)各組SYN1、BDNF蛋白表達(dá)的影響

表4 Dex 對(duì)各組SYN1、BDNF蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

MG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫防御中發(fā)揮著主要的免疫識(shí)別作用,對(duì)腦內(nèi)微環(huán)境的維持和調(diào)節(jié)具有掌控作用。MG主要通過分泌BDNF、GDNF 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕,GDNF成熟后在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、胼胝體、丘腦、小腦、海馬等中存在表達(dá)。GDNF可特異促進(jìn)神經(jīng)元生存,并對(duì)感覺/交感神經(jīng)元具有保護(hù)作用。體外研究中〔13〕,在神經(jīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),若神經(jīng)元在受到傷害性刺激后未死亡,接觸MG 后,通過促進(jìn)GDNF的表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)。Yuan等〔14〕在運(yùn)用電針干預(yù)缺血再灌注腦損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)中提出,通過調(diào)控TLR2/NF-κB通路,從而持續(xù)升高GDNF水平,改善神經(jīng)功能缺損,發(fā)揮腦保護(hù)作用。以上研究提示GNDF水平與神經(jīng)保護(hù)聯(lián)系密切。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)〔15,16〕,Dex對(duì)腦損傷的治療及神經(jīng)保護(hù)的作用。陳金權(quán)等〔17〕提示,Dex可通過調(diào)控micoRNA-329-3p/CREB/IL-1RA通路恢復(fù)神經(jīng)功能損傷及認(rèn)知功能障礙,從而發(fā)揮腦保護(hù)的作用。另外,其還具有抑制全麻藥誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用。曹艷等〔18〕在對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)研究中提出,Dex可通過調(diào)控SIRT1通路抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,從而減輕腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性損害。本研究提示,Dex可通過調(diào)控GDNF水平,發(fā)揮腦保護(hù)作用。

BDNF主要存在于腦皮質(zhì)、海馬區(qū)等,可促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育,促進(jìn)神經(jīng)元突觸形成、重塑,通過多種途徑減少神經(jīng)元凋亡,是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,還可促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)。SYN1水平增加可鍍金突觸傳到、連接等,可恢復(fù)神經(jīng)功能,其還參與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞釋放過程〔19〕。此外,SYN1是BDNF的下游因子,BDNF能夠促進(jìn)SYN1含量增加,促進(jìn)突觸重塑,恢復(fù)神經(jīng)功能。在王冬慧等〔20〕對(duì)放射性腦損傷大鼠的實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用電針進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn),通過調(diào)控Notch通路,促進(jìn)SYN1、BDNF及突觸后致密蛋白95表達(dá)增加,修復(fù)了神經(jīng)突觸損傷,提高了小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,從而改善腦損傷。在本研究結(jié)果提示,Dex通過促進(jìn)BDNF、SYN1表達(dá),修復(fù)損傷的神經(jīng)突觸,保護(hù)神經(jīng)功能,此外,本文神經(jīng)功能缺損評(píng)分及認(rèn)知功能結(jié)果也可證實(shí)上述結(jié)論。

顱腦損傷后由于昏迷、嘔吐等易發(fā)生口咽分泌物等誤吸入呼吸道,使得肺部受到感染,產(chǎn)生急性肺損傷,嚴(yán)重者會(huì)演變?yōu)楹粑狡染C合征。NE可降解多種蛋白(膠原蛋白、肺泡表面蛋白等),誘導(dǎo)炎性介質(zhì)產(chǎn)生,上調(diào)細(xì)胞因子、黏附分子的表達(dá),促進(jìn)黏液分泌等功能,因此,被稱為急性肺損傷的終極效應(yīng)因子。IL-8是氧自由基等產(chǎn)生的重要介質(zhì),是炎性因子之一,可趨化粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥區(qū)域。因此,肺內(nèi)IL-8的增加在一定程度上反映了肺內(nèi)炎癥反應(yīng)和炎性損傷的程度。NE可促進(jìn)IL-8的表達(dá)增加炎癥反應(yīng),IL-8可激活中性粒細(xì)胞從而增加NE含量,形成炎癥反應(yīng)惡性循環(huán),加重肺損傷。Dex具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果提示,Dex干預(yù)后可通過降低IL-8、NE水平,減少肺部感染,預(yù)防呼吸窘迫綜合征的產(chǎn)生。

綜上,Dex通過促進(jìn)GDNF表達(dá),從而修復(fù)神經(jīng)元突觸損傷,抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,改善肺功能及認(rèn)知功能,發(fā)揮腦保護(hù)及肺保護(hù)的作用。