基于細(xì)胞自噬JNK信號(hào)通路探討通絡(luò)糖泰方對(duì)高糖環(huán)境下大鼠雪旺細(xì)胞的影響

李周泉 李宇宸 唐瑩 李慧 楊莉君 姜迎宏 殷麗平

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,四川 成都 610075;2研究生院)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是一種困擾超半數(shù)糖尿病患者造成其殘疾甚至死亡、嚴(yán)重影響生存質(zhì)量的糖尿病并發(fā)癥〔1〕。雪旺細(xì)胞是一種保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)軸突再生,起神經(jīng)修復(fù)作用的膠質(zhì)細(xì)胞〔2〕,它在DPN發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要,異常代謝因素持續(xù)損傷雪旺細(xì)胞會(huì)阻礙周圍神經(jīng)修復(fù)〔3〕。自噬是一種細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激,將待降解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行自我更新以滿足代謝需要和支持細(xì)胞生長(zhǎng)生存的過(guò)程〔4〕,研究顯示調(diào)控雪旺細(xì)胞自噬可能是一種靶向治療DPN的手段〔5〕,然而Gomez-Sanchez等〔6〕發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞自噬可能并非通過(guò)傳統(tǒng)常見(jiàn)的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路,而是通過(guò)c-JUN氨基末端蛋白激酶(JNK)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的調(diào)節(jié),但相關(guān)研究仍處于初級(jí)階段〔7〕。通絡(luò)糖泰方是成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研制的一種中藥制劑,由黃芪、當(dāng)歸、地骨皮、水蛭、蠶沙、川牛膝、玄參、赤芍和冰片等藥物構(gòu)成〔8〕,在臨床應(yīng)用上取得良好反饋,在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)其可一定程度下調(diào)大鼠坐骨神經(jīng)磷酸化(p)-JNK、JNK mRNA、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3 蛋白的表達(dá),上調(diào)促生長(zhǎng)因子(IGF)-1 mRNA的表達(dá),降低大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)、髓鞘堿性蛋白(MBP)水平,提高大鼠感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度等〔9～12〕。因此本研究主要基于JNK信號(hào)通路,探討通絡(luò)糖泰方在高糖環(huán)境下對(duì)大鼠雪旺細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑及儀器 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量200～250 g,由成都森威實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠雪旺細(xì)胞(RSC96) 上海賽佰康生物技術(shù)股份有限公司提供;通絡(luò)糖泰方浸膏(TLTT) 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供(批號(hào)20201108);甲鈷胺片(彌可保,MKB) 中國(guó)衛(wèi)材藥業(yè)有限公司生產(chǎn);細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8試劑盒檢測(cè)盒、重組Anti-JNK1+JNK2+JNK3抗體、重組Anti-自噬關(guān)鍵分子醇母Atg6同第物(Beclin)1抗體、重組Anti-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)抗體由Abcam公司生產(chǎn);細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔二抗、極超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒由南京碧云天生物公司生產(chǎn);基因PCR引物由成都耶達(dá)科技有限公司合成;SureScriptTMcDNA第一鏈合成試劑盒與BlazeTaqTMSYBR Green Qpcr Mix試劑盒由美國(guó)GeneCopoeia公司生產(chǎn);多功能酶聯(lián)免疫分析儀由山東博科生物公司提供;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由美國(guó)ABI公司提供。

1.2含藥血清制備 30只SPF級(jí)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,將其隨機(jī)分為空白組、彌可保組和通絡(luò)糖泰(通絡(luò))組,每組各10 只,彌可保組給予劑量為0.25 mg/(kg·d)MKB,通絡(luò)組給予劑量10 mg/(kg·d)TLTT,空白組大鼠給予等體積生理鹽水,各組均連續(xù)給藥3 d。末次灌胃2 h后,無(wú)菌前提下藥物麻醉后于腹主動(dòng)脈取血,離心取血清于無(wú)菌離心管,經(jīng)滅活滅菌處理后保存-80 ℃冰箱保存。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù) 根據(jù)前期課題組數(shù)據(jù)〔13〕及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定通絡(luò)糖泰含藥血清以5%、10%、20%濃度為佳,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雪旺細(xì)胞分為6組,按1×105/ml的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并進(jìn)行分組干預(yù):空白組(5.6 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、模型組(50 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、彌可保組(50 mmol/L葡萄糖+10%含彌可保血清)、低劑量通絡(luò)組(50 mmol/L葡萄糖+5%通絡(luò)糖泰血清)、中劑量通絡(luò)組(50 mmol/L葡萄糖+10%通絡(luò)糖泰血清)和高劑量通絡(luò)組(50 mmol/L葡萄糖+20%通絡(luò)糖泰血清)。各組均在37 ℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

1.4CCK-8計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組雪旺細(xì)胞活性 將細(xì)胞以每孔5×103細(xì)胞數(shù)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,共制作3塊培養(yǎng)板(24 h板、48 h板和72 h板)。待24 h細(xì)胞貼壁后,按照分組更換培養(yǎng)液,每組5個(gè)復(fù)孔,24、48和72 h后按照試劑說(shuō)明書(shū)滴加顯色試劑繼續(xù)孵育1 h,最后采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度(A)值,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組雪旺細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞以每孔1×105細(xì)胞數(shù)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待24 h貼壁后換液培養(yǎng)48 h,胰酶消化收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)潤(rùn)洗細(xì)胞2次,加入結(jié)合緩沖液500 μl,先后加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI),室溫下避光孵育10 min,放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率(Q2)+晚期細(xì)胞凋亡率(Q3),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞自噬熒光染色法檢測(cè)各組雪旺細(xì)胞自噬泡 根據(jù)細(xì)胞自噬染色試劑盒要求,將已更換血清并培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上48 h的各組貼壁細(xì)胞去除培養(yǎng)液,用去離子水稀釋后的1× Wash Buffer清洗后直接加入單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色劑室溫避光染色1 h,染色結(jié)束用1×清洗緩沖液清洗后,熒光顯微鏡下觀察并拍照,最后用Image J進(jìn)行熒光強(qiáng)度半定量分析,平均熒光強(qiáng)度=該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/該區(qū)域面積。

1.7Western印跡法檢測(cè)各組雪旺細(xì)胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá) 貼壁生長(zhǎng)并以含藥血清干預(yù)48 h后的RSC96細(xì)胞,使用上樣緩沖液進(jìn)行裂解,經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量后,根據(jù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒制備電泳凝膠后進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)印、封閉處理、抗體孵育,最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀獲取條帶影像并用ImageJ軟件分析計(jì)算條帶灰度值進(jìn)而計(jì)算蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組雪旺細(xì)胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ mRNA表達(dá) 引物序列由成都市耶達(dá)科技有限公司設(shè)計(jì)合成:LC3Ⅱ上游引物:5′-GACGCCTTATGTAGTGACTCGC-3′,下游:5′-TCCTGGAAAGAGGATTTTGTGGC-3′;p-JNK上游引物:5′-GCTACAAGGGTGAGAAGCAGCT-3′,下游:5′-CTGGTTCACCAGCAGGAAGAAG-3′;Beclin1上游引物:5′-CTGGACACTCAGCTCAACGTCA-3′,下游:5′-CTCTAGTGCCAGCTCCTTTAGC-3′;GAPDH上游引物:5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游:5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。將貼壁生長(zhǎng)并以含藥血清干預(yù)48 h后的RSC96細(xì)胞,根據(jù)TRIzol法提取總RNA,根據(jù)第一鏈 cDNA 合成試劑盒和qPCR Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建體系為20 μl的互補(bǔ)cDNA,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素分析,方差齊時(shí)采用多重比較法(Turkey),方差不齊時(shí)采用DunnettT3檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1雪旺細(xì)胞活性表現(xiàn) 與空白組比較,模型組雪旺細(xì)胞在48、72 h培養(yǎng)后活力顯著降低(P<0.01);與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡(luò)組雪旺細(xì)胞在48和72 h培養(yǎng)后活力明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組雪旺細(xì)胞活性比較

2.2各組雪旺細(xì)胞凋亡比較 與空白組比較,其余5組凋亡細(xì)胞百分比均顯著升高(P<0.01),與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡(luò)組凋亡細(xì)胞百分比明顯下降(P<0.01)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡比較

表2 各組雪旺細(xì)胞凋亡率、自噬泡熒光強(qiáng)度及p-JNK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA比較

2.3各組雪旺細(xì)胞自噬泡表現(xiàn) 與空白組比較,模型組自噬泡明顯減少(P<0.01);與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡(luò)組自噬泡顯著增加(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組細(xì)胞自噬泡熒光(MDC染色)

2.4各組雪旺細(xì)胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá) 與空白組比較,模型組p-JNK蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡(luò)組p-JNK蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

1～6:空白組、模型組、彌可保組、低劑量通絡(luò)組、中劑量通絡(luò)組、高劑量通絡(luò)組圖3 各組p-JNK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)

3 討 論

雪旺細(xì)胞是一種周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有并主要構(gòu)成有髓神經(jīng)纖維髓鞘的膠質(zhì)細(xì)胞,在周圍神經(jīng)病變中具有維持神經(jīng)原有結(jié)構(gòu)與功能、修復(fù)損傷和促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生的重要作用〔14〕。自噬是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外環(huán)境壓力變化的一種反應(yīng),在正常情況下,自噬處于相當(dāng)?shù)偷乃?主要清理衰老損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化,但當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),細(xì)胞自噬被激活,表現(xiàn)為自噬增強(qiáng)。但當(dāng)刺激程度過(guò)強(qiáng)時(shí),又進(jìn)一步發(fā)展為自噬受損,最后自噬失敗再通過(guò)凋亡途徑最終促成細(xì)胞死亡〔15,16〕。若細(xì)胞發(fā)生自噬,則需要進(jìn)一步檢測(cè)自噬在細(xì)胞死亡中的角色:一方面,細(xì)胞通過(guò)自噬加強(qiáng)對(duì)功能受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)行識(shí)別、降解和修復(fù),從而抑制細(xì)胞死亡;另一方面,大量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明自噬能誘發(fā)凋亡等非自噬性細(xì)胞死亡途徑,從而促進(jìn)細(xì)胞死亡〔17〕。

JNK是一類調(diào)控細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)化、增殖和死亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,JNK信號(hào)通路是細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)中的重要調(diào)節(jié)靶標(biāo)和細(xì)胞信息傳遞交匯點(diǎn)〔18〕。JNK參與多種自噬和凋亡通路的調(diào)節(jié),研究提示阻斷JNK信號(hào)通路可能是預(yù)防和治療DPN的潛在靶點(diǎn)〔19,20〕。糖尿病高糖環(huán)境下,機(jī)體JNK信號(hào)通路被激活,細(xì)胞從低水平自噬轉(zhuǎn)向自噬增強(qiáng),但持續(xù)應(yīng)激狀態(tài)下自噬被抑制,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡直至死亡。本研究結(jié)果說(shuō)明,高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞的刺激過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞自噬受損,通絡(luò)糖泰方可能通過(guò)抑制JNK信號(hào)的活化,減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)自噬發(fā)生。

MDC可與自噬囊泡膜上存在自噬體形成依賴的第二個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)Apg8特異性結(jié)合,因此其可判斷細(xì)胞自噬過(guò)程是否發(fā)生,但MDC不僅可以與自噬體發(fā)生結(jié)合,還能與胞質(zhì)內(nèi)所有酸性液泡結(jié)合,因此需結(jié)合Western印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明〔21〕。Beclin1是一種持續(xù)招募自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)自噬啟動(dòng)并參與調(diào)控自噬體雙層膜形成過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,LC3是自噬體膜和自噬溶酶體膜的特征性標(biāo)志物,分為L(zhǎng)C3Ⅰ和LC3Ⅱ,而LC3Ⅱ是與自噬體相關(guān)唯一可靠的標(biāo)記蛋白,在一定程度上可反映細(xì)胞自噬的活性,因此Beclin1和LC3Ⅱ是檢測(cè)自噬水平的兩種關(guān)鍵生物標(biāo)志物〔22,23〕。本研究結(jié)果說(shuō)明,高糖環(huán)境下雪旺細(xì)胞自噬活性被抑制,給予通絡(luò)糖泰血清處理后,Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)均得到改善,說(shuō)明通絡(luò)糖泰方可能提高了細(xì)胞自噬活性。

綜上所述,通絡(luò)糖泰方可通過(guò)降低p-JNK蛋白的表達(dá),抑制高糖環(huán)境下JNK信號(hào)通路的異常激活,提高細(xì)胞自噬活性和自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3Ⅱ的表達(dá),改善JNK信號(hào)通路參與的雪旺細(xì)胞凋亡與自噬。