通過CRISPR/Cas9敲除PD-1有效增強(qiáng)EGFR-CAR-T細(xì)胞對(duì)肺癌的抗腫瘤活性

姜偉華 高永山 劉娜 張媛 楊燕君 王貴剛 董躍華 張振明

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1胸外科,河北 張家口 075000;2手術(shù)室)

肺癌是最致命的惡性腫瘤之一,全世界每年新增病例超過180萬例〔1〕。肺癌存在許多病理類型,但約85%的肺癌患者被診斷為非小細(xì)胞肺癌,其5年生存率僅為10%〔2,3〕。盡管近年來在肺癌診斷和治療方面取得了顯著進(jìn)展,但預(yù)后仍不樂觀〔4,5〕。

嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞在治療多種B細(xì)胞白血病和淋巴瘤方面已經(jīng)顯示出良好的臨床效果〔6,7〕,但在針對(duì)實(shí)體腫瘤方面仍然存在挑戰(zhàn)〔8〕?；谝?guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)(Cas)9方法對(duì)原代T細(xì)胞進(jìn)行編輯的策略增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的前景〔9,10〕。

程序性死亡受體(PD)-1在T細(xì)胞激活后會(huì)短暫上調(diào),是抑制T細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的主要效應(yīng)分子之一〔11〕。本研究中,選擇肺癌中普遍高表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)作為靶點(diǎn),開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas9破壞PD-1的CAR-T細(xì)胞,來探索這種利用基因編輯破壞PD-1的EGFR-CAR-T細(xì)胞是否可以有效地抑制肺癌的進(jìn)展。

1 材料和方法

1.1血液、細(xì)胞系和主要試劑 健康人外周血由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院提供,所有流程經(jīng)過河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),志愿者均知情同意。HCC827、NCI-H1650、NCI-H23及A549細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù),所有細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

聚凝胺(Polyberene)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑、膠原酶Ⅰ及蘇木素染液購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司;聚蔗糖(Ficol)試劑購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;CD3/CD28激活磁珠購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;T細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自德國(guó)美天旎公司;乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;CD45-APC-Cy7、CD3-藻紅蛋白(PE)、PD-1-APC及EGFR-PE抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;兔抗PD-1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;白細(xì)胞介素(IL)-2購(gòu)自北京義翹神州生物科技有限公司;EGFR-CAR慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司;PD-1引導(dǎo)RNA(gRNA,GGCCAGGATGGTTCTTAGGT)由安徽通用生物有限公司合成;Cas9蛋白購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離及CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建 按照Ficol試劑的說明書,采用密度梯度離心法獲得PBMC,按照2×106/ml密度進(jìn)行培養(yǎng),6 h后小心吸取上清,離心重懸后獲得PBMC。取6×106個(gè)PBMC,加入80 μl CD3/CD28激活磁珠,培養(yǎng)24 h,之后將細(xì)胞均分為3份,分別為未轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞(UT)組、野生型EGFR-CAR-T細(xì)胞(CAR-T)組及PD-1敲除的EGFR-CAR-T細(xì)胞(PD-1-CAR-T)組。在CAR-T及PD-1-CAR-T組中加入8 μg/ml的Polyberene,在加入100 μl EGFR-CAR慢病毒,4 000 r/min離心60 min,放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后在PD-1-CAR-T組中加入3.6 μg的Cas9和3.6 μg的gRNA充分混合,置于調(diào)整密度為1×108/ml,并置于0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,將細(xì)胞重懸于T細(xì)胞培養(yǎng)基中,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性 取1×104個(gè)腫瘤細(xì)胞置于96孔板中,待細(xì)胞密度為80%時(shí)分別加入U(xiǎn)T、CAR-T及PD-1-CAR-T,共孵育24 h。孵育結(jié)束后離心取上清,按照LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒的說明檢測(cè)對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性按如下方法計(jì)算:細(xì)胞毒性(%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR-T細(xì)胞陽性率、EGFR、PD-1表達(dá)情況及腫瘤組織中T細(xì)胞比例 CAR-T細(xì)胞陽性率:分別取1×105個(gè)慢病毒感染5 d后的UT、CAR-T及PD-1-CAR-T,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后,使用100 μl PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè);EGFR表達(dá):分別取1×106個(gè)HCC827、NCI-H1650、NCI-H23及A549細(xì)胞,PBS清洗3次后,將每種細(xì)胞均分為兩份,使用100 μl PBS重懸細(xì)胞,在染色組的管子中加入5 μl EGFR-PE的抗體,冰箱中孵育30 min,PBS清洗3次后,使用300 μl PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè);PD-1表達(dá)檢測(cè):收集1.3中共孵育結(jié)束后的懸浮細(xì)胞,PBS清洗3次后,使用50 μl PBS重懸細(xì)胞,加入2 μl CD3-PE和PD-1-APC抗體,冰箱中孵育30 min,PBS清洗3次后,使用100 μl PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè);

腫瘤組織中T細(xì)胞檢測(cè):取新鮮分離的腫瘤組織10 mg,將其剪碎后加入1 ml含有1 mg/ml膠原酶Ⅰ的PBS,37 ℃孵育1 h,使用70 μm濾網(wǎng)過濾,收集的細(xì)胞用PBS清洗3次后,使用100 μl PBS重懸細(xì)胞,加入5 μl CD3-PE和CD45-APC-Cy7抗體,冰箱中孵育30 min,PBS清洗3次后,使用300 μl PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5體內(nèi)移植瘤模型檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的腫瘤抑制功能 15只M-NSG重度免疫缺陷小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物飼養(yǎng)于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院SPF動(dòng)物中心。本部分所用的表達(dá)紅色熒光蛋白的NCI-H23細(xì)胞系(NCI-H23-RFP)由本實(shí)驗(yàn)前期構(gòu)建保存。取1×107個(gè)NCI-H23-RFP細(xì)胞皮下注射到小鼠的背部皮下,第7天腫瘤長(zhǎng)至100 mm3時(shí)分別通過尾靜脈回輸1×107個(gè)UT、CAR-T及PD-1-CAR-T,分別在接瘤后第7天和第21天進(jìn)行活體成像檢測(cè)。待小鼠死亡后取腫瘤組織進(jìn)行瘤重檢測(cè)。

1.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中PD-1的表達(dá) 取20 mg分離的小鼠腫瘤組織,使用4%多聚甲醛(PFA)固定24 h,之后經(jīng)過脫水包埋及切片后,制成組織切片。在組織切片上滴加50 μl 山羊血清室溫封閉2 h,之后滴加50 μl抗PD-1抗體,在冰箱中孵育過夜,次日滴加50 μl山羊抗兔二抗,室溫孵育1 h,之后通過DAB顯色,蘇木素染色后封片,在顯微鏡下觀察并拍照。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CAR-T及PD-1-CAR-T細(xì)胞的鑒定 EGFR-CAR的序列結(jié)構(gòu)如圖1A所示。對(duì)構(gòu)建的T細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè),結(jié)果表明,未經(jīng)基因編輯的CAR-T細(xì)胞的陽性率為41.3%,經(jīng)過CRISPR/Cas9敲除PD-1的CAR-T細(xì)胞的陽性率為52.7%(圖1B)。

A.EGFR CAR結(jié)構(gòu);B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR表達(dá)圖1 EGFR CAR-T細(xì)胞的性質(zhì)

2.2腫瘤細(xì)胞表面EGFR的表達(dá)檢測(cè) HCC827細(xì)胞不表達(dá)EGFR,NCI-H1650低表達(dá)EGFR(16.3%),NCI-H23及A549細(xì)胞高表達(dá)EGFR,分別為97.6%、99.8%(圖2)。

1:對(duì)照;2:抗體染色圖2 腫瘤細(xì)胞中EGFR的表達(dá)

2.3CAR-T及PD-1-CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性及PD-1表達(dá)檢測(cè) CAR-T及PD-1-CAR-T組對(duì)HCC827細(xì)胞的殺傷活性較UT組無差異,CAR-T及PD-1-CAR-T細(xì)胞對(duì)NCI-H1650、NCI-H23及A549細(xì)胞的殺傷活性顯著高于UT組,而PD-1-CAR-T細(xì)胞對(duì)NCI-H23及A549細(xì)胞的殺傷活性較CAR-T組進(jìn)一步提高,見表1。此外,對(duì)與NCI-H23細(xì)胞共孵育的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè),結(jié)果表明CAR-T組PD-1細(xì)胞比例〔(25.600±2.600)%〕明顯高于UT組〔(5.377±0.544)%,P<0.000 1〕,PD-1-CAR-T組PD-1細(xì)胞比例〔(11.630±1.365)%〕顯著低于CAR-T組(P<0.001),見圖3。

圖3 T細(xì)胞中PD-1表達(dá)水平

2.4CAR-T及PD-1-CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性 回輸PD-1-CAR-T細(xì)胞的小鼠體內(nèi)的腫瘤熒光強(qiáng)度低于回輸CAR-T細(xì)胞組(圖4A)。生存曲線顯示,回輸PD-1-CAR-T細(xì)胞較回輸CAR-T細(xì)胞可以延長(zhǎng)小鼠的生存期(圖4B)。此外,CAR-T組腫瘤質(zhì)量〔(353.300±48.440)mg〕明顯低于UT組〔(831.300±37.580)mg,P<0.000 1〕;PD-1-CAR-T組腫瘤質(zhì)量〔(152.700±59.000)mg〕也顯著低于CAR-T組(P<0.01)。

A.NCI-H23腫瘤細(xì)胞在7、21 d時(shí)的體內(nèi)成像;B.治療后的生存曲線圖4 CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性

2.5腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞檢測(cè)及腫瘤中PD-1的表達(dá)水平檢測(cè) CAR-T組腫瘤中T細(xì)胞比例〔(7.733±0.710)%〕明顯高于UT組〔(0.103±0.046)%,P<0.000 1〕;PD-1-CAR-T組腫瘤中T細(xì)胞比例〔(12.330±0.603)%〕顯著高于CAR-T組(P<0.001),見圖5。免疫組化結(jié)果表明,CAR-T組腫瘤組織中PD-1細(xì)胞數(shù)〔(213.700±22.740)個(gè)〕明顯高于UT組〔(53.330±15.500)個(gè),P<0.000 1〕;PD-1-CAR-T組腫瘤組織中PD-1細(xì)胞數(shù)〔(92.000±11.530)個(gè)〕顯著低于CAR-T組(P<0.001)。見圖6。

圖5 腫瘤組織中T細(xì)胞浸潤(rùn)

圖6 各組腫瘤組織中PD-1表達(dá)(蘇木素染色,×100)

3 討 論

肺癌是一種免疫抑制型癌癥,其腫瘤微環(huán)境限制抗腫瘤免疫,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,是肺癌治療的重要障礙〔12〕。本研究結(jié)果表明,基于CRISPR/Cas9敲除PD-1可顯著提高CAR-T細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤的療效。

盡管CAR-T細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)抑制劑這兩種主要的癌癥免疫治療方法為癌癥患者帶來了更多的治療希望,但控制一些癌癥的進(jìn)展,特別是實(shí)體腫瘤,仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)〔13,14〕。據(jù)報(bào)道,CAR-T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤功效大打折扣,很大一部分原因是其自身PD-1的表達(dá)抑制了抗腫瘤效應(yīng)功能〔15〕。CAR-T細(xì)胞和PD-1受體抑制劑的聯(lián)合使用可以改善腫瘤發(fā)展和患者的總生存期〔16〕。通過PD-1失活受體或PD-1信號(hào)轉(zhuǎn)換受體實(shí)現(xiàn)的PD-1信號(hào)阻斷同樣可以提高CAR-T細(xì)胞的療效〔17〕。PD-1阻斷抗體的阻斷作用是短暫的,需要反復(fù)給藥〔18,19〕。近期有研究表明,CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PD-1的敲除可以增強(qiáng)CD19-CAR-T細(xì)胞的功能〔20〕。本研究中構(gòu)建的PD-1敲除的EGFR-CAR-T細(xì)胞不僅在體外增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,在體內(nèi)的腫瘤抑制功效同樣卓越,抗腫瘤功能被顯著增強(qiáng)。然而,在體外研究中,PD-1敲除的EGFR-CAR-T細(xì)胞較未敲除PD-1的EGFR-CAR-T細(xì)胞殺傷能力并無顯著增加,這一現(xiàn)象可能與腫瘤細(xì)胞表面EGFR的低表達(dá)有關(guān)。

CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增和持久性是體內(nèi)抗腫瘤療效的關(guān)鍵〔21〕。研究人員發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞中的PD-1失活增強(qiáng)了T細(xì)胞的持久性,并改善了體內(nèi)對(duì)黑色素瘤和纖維肉瘤的抗腫瘤療效〔22〕。也有研究證明PD-1失活受體的共轉(zhuǎn)導(dǎo)增加了28ζCAR-T細(xì)胞的增殖能力,并逆轉(zhuǎn)了PD-1配體介導(dǎo)對(duì)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性的抑制作用〔9〕。在本研究中,PD-1缺失的EGFR-CAR-T細(xì)胞較野生型EGFR-CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)持久性明顯增強(qiáng),這也可能與其卓越的腫瘤抑制功能有關(guān)。

高效和便捷的基因編輯手段為改進(jìn)過繼性免疫治療的療效開辟了多樣化的途徑。如PD-1編輯的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤功能增強(qiáng),便可允許醫(yī)生使用更少的細(xì)胞來達(dá)到同等的治療效果〔23〕。然而對(duì)于這種編輯方案,一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)是PD-1缺陷的CAR-T細(xì)胞仍然表達(dá)自身反應(yīng)性TCR,可能導(dǎo)致類似于系統(tǒng)性PD-1抗體阻斷的自身免疫疾病〔24〕。然而,其他研究小組報(bào)告了通過刪除內(nèi)源性TCR基因來產(chǎn)生“通用”型異體T細(xì)胞來預(yù)防移植物抗宿主病〔25〕?？紤]到基于多重CRISPR/Cas9編輯的可操作性,添加靶向內(nèi)源性TCR的gRNA和選擇性去除TCR+細(xì)胞將產(chǎn)生高效的、腫瘤特異性的CAR-T細(xì)胞。

綜上,CRISPR/Cas9介導(dǎo)的PD-1敲除可以在體外和體內(nèi)改善CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)功能,增強(qiáng)其對(duì)肺癌的抑制活性。本研究有助于下一代CAR-T細(xì)胞的開發(fā),為肺癌的治療提供一種潛在的手段。